CS267706B1 - Způsob izolace D-ribozy - Google Patents

Abstract

Řešení seytýké izolace D-ribózy ze směsí s D-glukozou. Podstata řešení spočívá v rozdělení směsi obou aldóz ohromatografií vodného roztoku ve sloupci kationtoměnné pryskyřice na bázi kuličkovitého sulfonovaného styrendivinylbenzenového kopolymerů, obsahujícího nejvýše 8 % hmot., s výhodou 4 až 5 % hmot. divinylbenzenu, s velikostí zrna nejvýše 0,5 mm, s výhodou 0,1 až 0,3 mm, nasyceného ionty alkalického kovu, zejména sodíku, nebo ionty kovu alkalických zemin, zejména vápníku, stroncia a baria. Řešení má použití ve fermentačním průmyslu při získávání meziproduktu syntézy riboflavinu.

Description

Vynález se týká způsobu izolace D-ribózy ze směsí s D-glukózou, získaných např. fermentací živných půd obsahujících D-glukózu, mikroorganismy, které vytvářejí D-ribózu.

D-ribóza je součástí některých základních složek živé hmoty. Je obsažena v nukleových kyselinách. Její redukovaný derivát, ribitol, je součástí riboflavinu, působícího jako aktivní centrum flavoproteinových enzymů v systémech pro transport elektronů (v dýchacích řetězcích),

Průmyslový význam má D-ribóza především pro syntézu riboflavinu - vitamínu Bg. Potřeba tohoto vitamínu stále stoupá, jak pro účely humánní medicíny, tak zejména jako doplněk krmných dávek v moderních velkochovech hospodářských zvířat.

Klasický způsob výroby D-ribózy spočívá v alkalické epimerizaci kyseliny D-arabonové, získané ixidací sacharózy kyslíkem v přítomnosti KOH, v kyselinu D-ribonovou, její izolaci, laktonizaci a redukci elektrochemicky připravenou amalgamou v D-ribózu (L.C. Šnajdman: Proizvodstvo vitaminov, Moskva 1973)· Novější postupy vycházejí z D-arabinózy, která Bílikovou reakcí, tj. působením iontů molybdenanu za zvýšené teploty, se zčásti epimerizuje na D-ribózu. Ze získané směsi se oddělí většina nezreagované D-arabinózy krystalizaci (evrop. pat. 20 959).

K přípravě D-arabinózy bylo popsáno více postupů. Např. oxidační dekarboxylace D-glukonanu vápenatého peroxidem vodíku v přítomnosti železitých iontů (O. Ruff a G. Ollendorf: Ber. 33 (I960), 1898; H.G. Fletcher a C.S. Hudson: J.Am. Chem.Soc. 72 (1950), 4546 nebo v přítomnosti měánatých iontů, dále elektrochemickou cestou čs. autorské osvědčení č. 225576, oxidace D-glukózy chlornanen sodným (R.L. Whistler a R. Schweiger: J.Am.Chem.Soc. 81 (1959). 5190) a obdobně působením chlornanu sodného na D-glukonan sodný, získaný fermentačně z D-glukózy '(DOS.pat.Ž 923 267)'.

Fermentač ní výrobu D-ribózy umožnilo až získání umělých mutantů bakterií, vytvářejících D-ribózu z D-glukozy (T. Suzuki. N. Tanaka, K. Mizuhara a S. Kinoshita: J.Gen.Appl.Microbiol. 9 (1963), 457 a holand. pat. 6 408 606 (1965); T. Azawa a S. Watanabe: japon. pat. 1479-67 (1964); M. Yoneda. K.I. Sasajima: pat. USA 3 607 648 (1971); K. Sasajima a M. Yoneda: Agric. Biol. Chem. 35 (1971), 509; K. Sasajima, M. Doi. T. Fukuhara, A. Yokota a Y. N?kao: japon. pat. 76 79, 782 (1976): K. Mockizuki a.T· Shimbo: japon. pat. 76 91 388 (1976). Ačkoliv byla popsána konverze D-glukózy v D-riDÓzu prakticky beze zbytku (T.Asai, M. Doi, T. Kono a H. Fukuda: J. Ferment. “ Technol. 56 (1978), 91), dostupné mutanty zpravidla poskytují směs nezměněné D-glukózy a fermentací vzniklé D-ribózy. Ze získané směsi je nutno D-ribózu izolovat. Děje se tak odkvešením zbylé D-glukózy přísadou kvasinek Saccharomyces cerevisiae, které D-ribózu prakticky nezkvašují. ,

Nevýhody jmenovaného způsobu izolace D-ribózy (ztráta glukózy, znečištění roztoku vedlejšími produkty lihového kvašení, zejména glyoerolem) odstraňuje postup, který je předmětem tohoto vynálezu. Při něm se separuje D-glukóza od D-ribózy chromatografií na sloupci kationtoměnné pryskyřice. Fermentovaná půda, obsahující zbytek nezměněné D-glukózy a D-ribózu, se zfiltruje a deionizuje. Pak se vede sloupcem kationtoměnné pryskyřice vhodného typu, nasycené ionty alkalického kovu, kovu žíravých zemin, ionty stříbra, olova a pod. Pryskyřice je perličkový polystyrendivinylbenzenový kopolymer s obsehem DVB 3 až 8 %, velikosti zrna 0,05 až 0,5 mm (s výhodou 0,1 až 0,3 mm). Při vhodných podmínkách dělení (zatížení pryskyřice, průtokové rychlosti, koncentrace cukerných roztoků a teploty) lze dosáhnout úplného rozdělení obou monosacharidů. Z frakcí eluátu je možno oba cukry získat v krystalické formě. Vzhledem k vysoké čistotě roztoků obou cukrů po rozdělení, je výhodné použít takto získané roztoky přímo, případně po vhodném zahuštění, k dalším operacím, tj. roztok

CS 267 706 B1

D-glukózy vrátit zpět k přípravě živné půdy a roztok D-ribózy použít např. k přípravě nukleosidů. '

Podrobnosti způsobu podle vynálezu vyplývají z následujících příkladů provedení, které tento způsob pouze ilustrují, ale nijak neomezují.

Příklad 1

Mutantem Bacillus pumilus V1ÍFB 1004, udržovaným na bujónovém Šikmém agaru, bylo po dvou dnech nárůstu zaočkováno 100 ml půdy, obsahující 2 % rozpustného Škrobu, 2 % kukuřičného extraktu, 0,3 % dikaliumhydrogenfosfátu a 0,1 % kaliumdihydrogenfosfátu. Po jednodenním klidovém nárůstu při 32 °C byla kultura použita k zaočkování půdy objemu 1000 ml, obsahující 12,5 % D-glukózy, 2,5 % aktivních suSených kvasnic Engedure, 1,5 % síranu amonného, 0,5 % kalciumhydrogenfosfátu, 0,5 % trikalciumfosfátu a 0,1 % uhličitanu vápenatého. Po jedenáctidenní inkubaci na podélné třepačce při 32 °C obsahovala kultura 95 mg celkových redukujících cukrů v 1 ml, počítáno jako D-glukóza a 21 ,5 mg kvasnicemi nezkvasitelných cukrů, počítáno jako D-robóza ví ml. Souběžně provedená analýza papírovou chromatografií prokázala přítomnost D-glukózy a D-ribózy, resp. D-ribózy (po odkvašení glukózy). Půda byla zfiltrována s přísadou 3 g aktivního uhlí a deionizována za účelem odstranění solí. Po zahuStění na koncentraci 35 % sušiny byl roztok podroben chromátogrefické separaci na koloně o průměru 5 cm a výšce 280 cm. Byl použit silně kyselý kationtoměnič Wofatit EPS, sítovaný 4 % DVB, zrnění 0,10 až 0,30 mm nasycený ionty vápníku při teplotě 50°C. Zatížení slouoce bylo 25 g sušiny cukrů na 1 pryskyřice. Kluče byla provedena vodou * 2 při rychlosti průtoku 0,42 ml na cm průřezu sloupce za minutu a frakce eluátu byly jímány po 120 ml během každých 14,5 min. Frakce č. 14 až 23 obsahovaly celkem 64,7 g chromátograficky jednotné dD-glukózy, *tj. 52 % množství nasazeného do fermentace. Frakce č. 29 až 38 obsahovaly celkem 26,6 g chromátograficky jednotné D-ribózy, tj. 21% teorie z použité glukózy.

Příklad 2

Fermentace 1000 ml půdy, obsahující 125 g D-glukozy a živné sole byla provedena stejným kmenem a stejným způsobem jako v příkladu 1. Po skončené fermented byla půda vyčeřena filtrací s přísadou aktivního uhlí a deionizována na sloupcích silně kyselého katexu v H⁺ -cyklu a slabě bázického anexu v OH~-cyklu. Po zahuštění roztoku při sníženém tlaku na 37 % sušiny byle provedena čhromatogrefická separace D-ribózy od nezměněné D-glukózy na koloně kationtoměniče Ostionu KS 0407 (zrnění 0,15 až 2+ 0,30 mm, 4 % DVB, Ba -forma, rozměry sloupce 5 x 180 cm) elucí vodou při teplotě _ p .

°C a průtokové rychlosti 0,48 ml na cnT průřezu sloupce za min. Dělení obou cukrů proběhlo kvantitativně. Frakce eluátu č. 15 až 23 obsahovaly v roztoku 53,9 g D - glukózy a frakce č. 30 až 39 obsahovaly čistou D-ribózu v množství 22,4 g, tj. 21,5% teorie, počítáno na výchozí D-glukózu. Krystalizace D-ribózy byle provedena po zahuštění vodného roztoku na sirup o koncentraci cca 95 % a po neředění bezvodým etánolem. Po zaočkování D-ribózou proběhla krystalizace během 48 h při teplotě 5 °C. Z matečného roztoku po 1. frakci krystalů bylo možno získat ještě druhou frakci D-ribózy. Celkový výtěžek krystalické D-ribózy byl 20,6 g, tj. 92 % množství, zjištěného analyticky v roztoku. Teplota bodu tání 86 až 87 °C.

Příklad 3 ·

Fermentace 1000 ml půdy, obsahující 125 g D-glukózy a živné sole byla provedena stejným kmenem a stejným způsobem jeko v příkladu 1. Po skončení inkubace byla půdě filtrována přes filtrační vložku s·naplaveným aktivním uhlím a deionizována na sloupcích silně kyselého katexu v H⁺-cyklu a slabě bázického anexu v OH-cyklu.

CS 267 706 Bl

Po zahuštění na koncentraci 40 % sušiny byl roztok podroben chromatografické separaci ne koloně o průměru 5 cm a výšce 180 cm. Byl použit silně kyselý kationtoměnič Zerolit 225 SRG 10, sítovaný 4 % DVB, zrnění 0,15 až 0,30 mm nasycený ionty stroncia při teplotě 60 °C. Eluce byla prováděna demineralizovanou vodou rychlostí 0,4 ml. 1 —2 min .cm průřezu sloupce. Eluát byl zachycován ve frakcích po 120 m. Spojením frakcí 14 až 22 byl získán roztok, který obsahoval 58,1 g čisté D-glukózy, tj.

46,5 % množství nasazeného do fermentece. Frakce 29 až 38 obsahují 23,2 g čisté D-ribózy, t j. 22 % teorie, počítáno na výchozí D-glukózu.

Claims (1)

1. Způsob izolace D-ribózy ze směsí s D-glukózou, vyznačující se tím, že se deionizovaný roztok obsahující D-glukózu a D-ribózu podrobí chromatografické separeci ne sloupci ketiontoměnné pryskyřice ne bázi kuličkovitého sulfonoveného styren-divinylbenzenového kopolymerů, obsahujícího nejvýše 8 % hmot., s výhodou 4 až 5 % hmot, divinylbenzenu, s velikostí zrna nejvýše 0,5 mm, s výhodou 0,1 až 0,3 mm, nasyceného ionty alkalického kovu, zejména sodíku, nebo ionty kovu alkalických zemin, zejména vápníku, stroncia a barya.