CS266909B1 - Způsob přípravy redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu - Google Patents

Abstract

Způsob přípravy redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu enzymovou redukcí spočívá v tom, že se na nikotinamidadenindinukleotid působí permeabilizovanými buňkami druhu Arthrobacter ureafaciens Krebs et Eggleston, v přítomnosti jimi metabolizovatelného sacharidu a fosfátu. Buňky se pěstují v půdě obsahující zdroje uhlíku, dusíku a minerálních látek. Zvláště výhodné je použití buněk Arthrobacter ureafaciens DBM 1076, uloženého ve sbírce mikroorganismů Katedry biochemie a mikrobiologie Vysoké školy chemicko-technologické v Praze pod číslem 1076. Permeabilizované buňky mohou být imobilizovány. Redukci lze provádět v přítomnosti 2 až 120 mM hořečnatých iontů jako stimulátoru a inhibitorů rozvoje mikrobiální kontaminace, například fluoridu sodného nebo azidu sodného.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu ÍNADH). Nikotinamidadenindinukleotid (NAD* je koen—zymem řady oxidoredukčních enzymů. Jeho redukovaná forma se používá při enzymovém stanovení řady organických sloučenin, v biochemickém výzkumu a při enzymové přípravě některých organických sloučenin. Zatímco nikotinamidadenindinukleotid je většinou jřipravován izolací z kvasinkových buněk. Je10 redukovaná forma je získávána redukcí izoovaného nikotinamidadenindinukleotidu. Nejčastěji se používá redukce pomocí alkoholdehydrogenasy (E.C.1.1.1.1), malátdehydrogenasy (E.C. 1.1.1.37, E.C.1.1.1.38 nebo E.C.1.1.1.39) nebo formátdehydrogenasy (E.C.1.2.1.2) s příslušným enzymovým substrátem jako donorem vodíku. Při těchto postupech se používají izolované přečištěné enzymy, většinou v imobilizované formě. ,

Protože čisté enzymy jsou poměrně drahé, neboť jejich izolace a čištění jsou často technicky náročné, a navíc je stabilita čistých enzymů omezená, bylo pro redukci nikotinamidadenindinukleotidu navrženo použití celých, rozdrcených nebo permeabilizovaných mikrobiálních buněk jako zdroje příslušných dehydrogenas, případně hydrogenas (Izumi Y. a sp. J. Ferment. Technol. 61, 135, 1983) používají pro redukci nikotinamidadenindinukleotidu permeabilizované buňky mikroorganismů s vysokou aktivitou formátdehydrogenasy (E.C.1.2.1.2), tj. některé kvasinky a bakterie. Substrátem je zde mravenčan sodný, který však při použitém pH uvolňuje těkavou mravenčí kyselinu, působící korozivně na zařízení a dráždivě na sliznice obsluhujícího personálu. Pro redukci 60 % přítomného nikotinamidadenindinukleotidu je přitom zapotřebí tříhodinová inkubace. Tato poměrně dlouhá inkubační doba je nevýhodná také proto, že redukovaný nikotinamidadenindinukleotid se ve vodném roztoku zvolna rozkládá na sloučeniny, jež inhibují reakce dehydrogenas, čímž se redukovaný nikotinamidadenindinukleotid znehodnocuje. Yokoyama S. a Suye S. (Franc, patent 2 562 089) používají jako zdroj malátdehydrogenasy pro redukci nikotinamidadenindinukleotidu rozdrcené buňky bakterie Achromobacter parvulus, u nichž inaktivují oxidasu redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu zahřáťím na 50 °C. K dosažení redukce 98 % přidaného nikotinamidadenindinukleotidu je však zapotřebí 6 hodin. Klibanov A. M. a Puglisi V. A. (Biotechnol. Letters 2, 445^1980) navrhují pro redukci nikotinamidadenindinukleotidu plynným vodíkem imobilizované buňky bakterie Alcaligenes eutropus. Postup je však technicky značně náročný, neboť uvedenou bakterii je nutno pěstovat v atmosféře obsahující 80 % plynného vodíku a také redukce nikotinamidadenindinukleotidu probíhá v atmosféře plynného vodíku. Navíc je účinnost celého systému opět velmi nízká: Na redukci 1 mM nikotinamidadenindinukleotidu s 85% účinností je třeba 6 h. Rovněž buňky Clostridium butyricum, použité pro hydrogenaci nikotinamidadenindinukleotidu plynným vodíkem

CS 266 909 B1 (Matsunaga I. a sp., Biotechnol. Bioeng. 27, 1 277, 1985), mají poměrně malou aktivitu, takže během 5 h bylo redukováno pouze 60 % nikotinamidadenindinukleotidu. U mobilizovaných buněk Clostridium butyricum byl sice během 5 h redukován veškerý nikotinamidadenindinukleotid, avšak jeho počáteční koncentrace byla pouze 0,8 mM. Přitom bylo nutno použít plynný vodík za tlaku 10 MPa, což představuje značné technologické komplikace.

Uvedené nedostatky odstraňuje způsob pří, pravý redukovaného nikotinamidadenindinu' kleotidu enzymovou redukcí podle vynálezu, který spočívá v tom, že se na nikotinamidadenindinukleotid působí permeabilizovanými buňkami bakterie Arthrobacter ureafaciens Krebs et Eggleston v přítomnosti fosfátu a 0,2 až 5 % (hmot./obj.) glukózy nebo jiného jimi metabolizovatelného sacharidu, například glukózy nebo jejich přirozeného zdroje jako je škrobový sirup, melasa, hydrolyzát celulózy nebo dřeva apod. Enzymovou redukci je výhodné provádět v přítomnosti 2 až 120 mM hořečnatých iontů. Zvláště výhodné je použití buněk Arthrobacter ureafaciens DBM 1076, uloženého ve sbírce mikroorganismů katedry biochemie a mikrobiologie Vysoké školy chemickotechnologické v Praze pod číslem 1076. Permeabilizované buňky mohou být také mobilizovány.

Extracelulární redukce nikotinamidadenindinukleotidu pomocí permeabilizovaných buněk Arthrobacter ureafaciens a sacharidu podle vynálezu se provádí tak, že se buňky tohoto mikroorganismu pomnoží za aerobních podmínek v tekutém médiu obsahujícím vedle vhodného zdroje uhlíku a energie také zdroje dusíku ve formě amonné soli, kvasniěného extraktu (autolyzátu), peptonu nebo jiného přirozeného zdroje tohoto prvku, dále hořečnaté a draselné ionty, fosfáty a sulfát. Buňky se oddělí od pomnožovacího média, nejlépe odstředěním, a podle potřeby promyjí vodou. Permeabilizace buněk se dosáhne buď třepáním s acetonem, nebo jiným rozpouštědlem nebo působením vhodné povrchově aktivní látky například dodecylsulfátu, cetylpyrimidiumchloridu apod. nebo opakovaným zmražením a rozmrazováním. Pro mobilizaci buněk se může použít vhodný gel jako je polyakrylamid, agar, genu-carageenan, alginát apod. Permeabilizace buněk může být aplikována před jejich imobilizací nebo až po ní.

Přeměna nikotinamidadenindinukleotidu v jeho redukovanou formu probíhá v reakční směsi obsahující 1 až 60 mM nikotinamidadenindinukleotid, 2 až 120 mM Mg²¹, 0,2 až 5 % hmot./obj. glukózy, 0,05 až 5 % (hmot./obj.) metafosfátu nebo ortofosfátu a volné nebo imobilizované permeabilizované buňky v množství 5 až 100 mg buněčné sušiny/ml reakční směsi. Pro potlačení rozvoje kontaminace u opakovaně používaných mobilizovaných buněk je možno přidat NaN₃ (0,1 až 3,0 mmol/dm³) nebo NaF (10 až 300 mmol/dm³). Základní látky, aktivátory i inhibitory se rozpouští ve vhodném pufru o pH 5,5 až 9,5. Reakční teplota se volí

CS 266 909 Bl v rozmezí 20 až 55 ° C.

Po proběhnutí reakce se reakční kapalina oddělí od bakteriálních buněk např. odstředěním, dekantací nebo filtrací a izoluje se z ní některým ze známých postupů redukovaný nikotinamidadenindinukleotid.

Způsob podle vynálezu umožňuje redukci až 20 mM nikotinamidadenindinukleotidu během 1 h s výtěžkem 90 až 95 % redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu. Zároveň jako donoru vodíku využívá metabolizovatelné cukry popřípadě i ve formě melasy, škrobového sirupu, hydrolyzátů celulózy nebo dřeva. Reakce probíhá v normální atmosféře, za normálního tlaku, což nevyžaduje žádné náročné zařízení.

Vynález je v dalším blíže objasněn na konkrétních příkladech způsobu přípravy redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu za použití Arthrobacter ureafaciens DBM 1076.

Příklad 1

Arthrobacter ureafaciens DBM 1076 se aerobně kultivuje při 30 °C v prostředí o pH 7,2, obsahujícím v 1 litru 20 g glukózy, 1,0 g (NH₄)₂SO₄, 0,1 g MgSO₄.7 H₂O, 8,7 g K₂HPO₄, 10 g sušeného kvasničného autolyzátu a 10 g peptonu. Po 18 h kultivace se buňky odstředí při 800 g, promyjí vodou a permeabilizují zhruba dvojnásobným objemem vychlazeného acetonu po dobu 15 min. Pak se buňky odstředí, aceton se slije a jeho residua se odstraní proudem vzduchu. K reakční směsi 10 mM nikotinamidadenindinukleotidu, 20 mM MgCl₂, 1 % (hmot./obj.) kyseliny metafosforečné neutralizované pomocí 1 N NaOH a 2 % glukózy (hmot./obj.) v Tris-HCl pufru o pH 9,0 se přidají permeabilizované buňky v množství 30 mg buněčné sušiny/ml reakční směsi a inkubuje se za třepání 1 h při 30 °C. Během této doby dojde k přeměně 90 až 95 % nikotinamidadenindinukleotidu v jeho redukovanou formu. Buňky se od reakční směsi oddělí centrifugací při 800 až 1 000 g a ze supernatantu se některý ze zná mých postupů izoluje redukovaný nikotinamidadenindinukleotid.

Příkl ad 2

Mikrobiální buňky Arthrobacter ureafaciens DBM 1076 se získají postupem uvedeným v příkladu 1. 16 g promytých vlhkých buněk se imobilizuje v alginátu, imobilizované buňky se promyjí 0,05 M CaCl₂ v Tris-HCl pufru o pH 9,0 a míchají 15 min. v dvojnásobném objemu acetonu. Pak se aceton slije a jeho zbytky se odstraní proudem vzduchu. K takto získaným permeabilizovaným imobilizovaným buňkám se přidá trojnásobné množství (obj./hmot.) reakční směsi obsahující v konečných koncentracích 20 mM nikotinamidadenindinukleotid, 20 mM MgCl₂, 0,05 M CaCl₂ a 1 mM NaN₃, 1 %(hmot./obj.) kyseliny metafosforečné neutralizované pomocí 1 N NaOH, 2 % (hmot./ obj.) sacharózy v Tris-HCl pufru o pH 9,0 a inkubuje se za mírného míchání 1 h při 30 °C. Pak se reakční kapalina oddělí od imobilizovaných buněk filtrací a z filtrátu se některým ze známých postupů izoluje redukovaná forma nikotinamidadenindinukleotidu. Imobilizované buňky se použijí pro další podíl reakční směsi. Jejich enzymová aktivita zůstává zachována po dobu 7 až 14 dnů.

Příklad 3

Buňky Arthrobacter ureafaciens připravené podle postupu uvedeného v příkladu 1 se mobilizují do polyakrylamidu a permeabilizují mícháním s dvojnásobným objemem acetonu. Po odstranění acetonu se imobilizované buňky plní do kolony, kterou se poté nechá protékat reakční směs shodného složení jako v příkladu 2. Rychlost průtoku se volí tak, aby se celková náplň reakční směsi v koloně vyměnila za 45 až 60 min. Tento kontinuální způsob biotransformace poskytuje výtěžnost redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu 90 až 95 %.

Claims (7)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Způsob přípravy redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu enzymovou redukcí vyznačující se tím, že se na nikotinamidadenindinukleotid působí permeabilizovanými buňkami druhu Arthrobacter ureafaciens Krebs a Eggleston v přítomnosti jimi metabolizovatelného sacharidu a fosfátu.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se na nikotinamidadenindinukleotid působí permeabilizovanými buňkami Arthrobacter ureafaciens DBM 1076.
3. 3. Způsob podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že se na nikotinamidadenindinukleotid působí imobilizovanými permeabilizovanými buňkami.
4. 4. Způsob podle bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že enzymová redukce se provádí v přítomnosti glukózy, sacharózy nebo xylózy.
5. 5. Způsob podle bodů 1 až 3, vyznačující se lim, ze enzymová redukce se provádí v přítomnosti melasy, škrobového sirupu, hydrolyzátů celulózy nebo dřeva.
6. 6. Způsob podle bodů 1 až 5, vyznačující se tím, že se enzymová redukce nikotinamidadenindinukleotidu provádí v přítomnosti inhibitorů rozvoje mikrobiální kontaminace, například fluoridu sodného nebo azidu sodného.
7. 7. Způsob podle bodů 1 až 6, vyznačující se tím, že se enzymová redukce nikotinamidadenindinukleotidu provádí v přítomnosti 2 až 120 mM hořečnatých iontů.