CS266763B1

CS266763B1 - Způsob přípravy redukovaného nikotin- amldadenindinukleotidfosfátu

Info

Publication number: CS266763B1
Application number: CS884301A
Authority: CS
Inventors: Ludmila Doc Ing Csc Silhankova; Petr Ing Hajek
Original assignee: Silhankova Ludmila; Hajek Petr
Priority date: 1988-06-20
Filing date: 1988-06-20
Publication date: 1990-01-12
Also published as: CS430188A1

Abstract

Způsob přípravy redukovaného nikotln- amidadenindinukleotldfosfátu spočívá v tom, že se na nlkotinamidadenlndlnukleotidfosfát působí v přítomnosti fosfátu a glukózy nebo jejího zdroje permeabillzovanýml buňkami pravých kvasinek nebo kvaslnkovltých mikroorganismů. Zvlášt výhodné Je použití buněk Rhodotorula glutlnls DBM 18, uloženého1 ve sbírce mikroorganismů Katedry biochemie a mikrobiologie Vysoké školy chemicko-techno- logtcké v Praze pod číslem 18, lisovaného pekařského droždí, sušeného aktivního droždí, lisovaného krmného droždí nebo odpadních pivovarských nebo vinařských kvasnic. Permeablllzované buňky mohou být lmobllizo- vány. Redukci lze provádět v přítomnosti Mg Zn a v přítomnosti inhibitorů rozvoje mikrobiální kontaminace, např. azidu sodného nebo fluoridu sodného.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy a regenerace redukovaného níkoťlnamidadenlndlnukleotldfosfátu /NADPH/. Nikotlnamldadeníndlnukleotldfosfát /NADP+/ Je koenzymem řady oxldoredukčních enzymů. Jeho redukovaná forma se používá v analytické chemii, v biochemickém výzkumu a při enzymové přípravě některých organických sloučenin.

Až dosud se získával hlavně enzymovou redukcí nlkotlnamldadenindlnukleotidfosfátu /NADP+/ pomocí Izolovaných enzymů, např. pomocí glukosa-6-fosfátdehydrogenasy /EC 1.1. 1.49/, karboxylační malátdehydrogenasy /EC 1.1.1.40/, isocitrátdehydrogenasy /EC 1.1.1. 42/ nebo glukosadehydrogenasy /E.C. 1.1.1.47/. Nevýhodou těchto postupů Je velká spotřeba Izolovaných enzymů a v některých případech také vysoká cena jejich substrátů /tj. glukosa-6-fosfátu a Isocltrátu/. Při použití hrubého izolátu malátdehydrogenasy z bakteriálních buněk /Saye S. , Yokoyama S. , Enzyme Mistroblol. Technol. 7, 418, 1985/ Je nevýhodou velmi dlouhá reakční doba /5h/. Použití izolovaných enzymů bylo navrženo také pro regeneraci redukovaných koenzymů během preparatlvní syntézy, nebol použití techo koenzymů ve stechiometrlckýcb množstvích by bylo příliš nákladné. Elektrochemická regenerace Je totiž neslučitelná s mnoha biochemickými systémy, má nízkou selektivitu a vyžadovala by složitou aparaturu, navíc se elektrody velmi rychle opotřebovávají. Také chemická a fotocnemlcká regenerace má omezenou použitelnost, v biochemických systémech’ a další nedostatky /nízká rychlost a výtěžek a v případě fotochemické regenerace Ještě omezená stabilita systému a složitá aparatura/. Cenovou nevýhodu použití izolovaných enzymů· odstraňuje použití permeabllizovaných mikrobiálních buněk Jako zdroje enzymů redukujících nikotlnamidadenlndinukleotidfosfát. Až dosud byly k tomuto účelu používány přísně anaerobní mikroorganismy. Tak Eguchi S. Y. a sp. /Agric. Biol. CHEm. 47, 2941, 1983/ používají methabogenní bakterie za použití mravenčanu nebo plynného vodíku Jako substrátu s výtěžností přeměny kolem 60 %. Matsunaga /Jap, pat. 86 56 090 z r. 1986/ dosahuje při použití anaerobního druhu Clostridium butyrlcum a tlaku plynného vodíku 10 MPa po 9 h rovněž pouze 60 % konverze nikotinamidadenlndlnukleotidfosfátu v Jeho redukovanou formu. Práce s přísně anaerobními mikroorganismy a použití plynného vodíku představuje značné technologické komplikace.

Uvedené nedostatky odstraňuje způsob přípravy redukovaného nikotlnamidadenindinukleotldfosfátu podle vynálezu, který spočívá v. tom, že se na nlkotlnamidadenlndinukleotidfosfát ve vhodném pufru působí permeabilizovanýml buňkami kvasinek nebo kvasinkoví tých mikroorganismů v přítomnosti fosfátu a glukosy nebo jejího endogenního nebo exogenního zdroje, např. škrobového sirupu, hydrolyzátu celulózy nebo dřeva. Velmi výhodné Je použití příslušníků rodů Saccharomyces ITleyen ex. Reesš, Candida Berkhout a Rhodotorula Harrison. 5 výhodou lze použít lisované pekařské dráždí nebo aktivní sušené droždí', dále lisované krmné droždí a odpadní pivovarské nebo vlnařské kvasnice. Zvláště výhodné Je použití buněk Rhodotorula glutlnis DBM 18, uložené ve sbírce mikroorganismů Katedry biochemie a mikrobiologie Vysoké školy chemlcko-technologické v Praze pod číslem 18. Permeabillzované buňky mohou být také imobilIzovány.

Redukce níkotinamidadenindinukleotídfosfátu pomocí permeabllizovaných buněk kvasinek a kvaslnkovltých mikroorganismů podle vynálezu se provádí tak, že se buňky zvoleného mikroorganismu! pomnoží v tekutém médiu obsahujícím vedle vhodného zdroje uhlíku a energie také zdroje dusíku ve formě amonné soli, kvasničného extraktu /autolyzátu/, peptonu nebo Jiného přirozeného zdroje tohoto prvku, dále horečnaté' a draselné lonty, fosfát a sulfát. Buňky se oddělí od pomnožovacího média, nejlépe odstředěním, a podle potřeby promyjí vodou. Permeablllzace buněk se dosáhne bud třepáním s acetonem, toluenem nebo Jiným rozpouštědlem, nebo působením vhodné povrchově aktivní látky /např.dodecylsulfátu, cetyltrimethylamonlumbromldu ap./, nebo opakovaným zmražením a rozmražováním. Pro

266763 imoblllzacl buněk se může použít vhodný gel, Jako Je polyakrylamld, genu-carrageenan, epoxidový polymer apod. Permeablllzace buněk může být aplikována před jejich Imobillzací nebo až po ní.

Přeměna nlkotinamidpdenindlnukleotldfosfátu v Jeho redukovanou formu probíhá v reakční směsi obsahující 0,2 až 30 mM nlkotlnamldadenindlnukleotidfosfát, 0 až 200 mM 2+ 2+

Mg , 0 až 20 mM Zn , 0 až Θ % hmot, glukosy, 0,05 až 6,5 % hmot metafosfátu nebo ortofosfát-u a volné nebo imoblllzované permeabillzované kvasinkové buňky v množství 2 až 120 mg buněčné sušlrry/ml reakční směsi. Pro potlačení rozvoje kontaminace u opakova• o ně používaných buněk Je možno přidat azld sodný Nati, v množství 0,1 až 3 mmol/dm nebo 3 až 300 mmol/dm fluoridu sodného NaF. Substráty, aktivátory a inhibitory se rozpouštějí ve vhodném pufru o pH 7,5 až 11,0. Reakční teplota se volí v rozmezí 10 až 50°C.

Po proběhnutí reakce se reakční kapalina oddělí od kvasinkových buněk, např. odstředěním, dekantací nebo filtrací a izoluje se z ní některým ze známých postupů redukovaný nlkotlnamldadenlndlnukleotldfosfát. Výtěžky tohoto produktu při použití různých druhů kvasinek a kvasinkovitých mikroorganismů Jsou uvedeny v tab. 1.

Použlje-li se způsob přípravy redukovaného nikotlnamidadenindinukleotldfosfátu podle vynálezu pro Jeho regeneraci při preparatlvní redukci určité sloučeniny pomocí oxldoredektasového enzymového systému, Jenž vyžaduje tento redukovaný koenzym, volí se reakční směs vyhovující této preparatlvní redukci a obsahující výše uvedené složky potřebné pro redukci nikotinamidadenindinukleotidfosfátu. Po proběhnutí reakce a odstranění buněk se z reakční směsi·izoluje žádaný produkt. Permeabillzované kvasinkové buňky lze použít opakovaně. V některých případech lze zbývající substrát po izolaci žádaného produktu rovněž použít, opakovaně, po obohacení o potřebné složky.

Vynález Je v dalším blíže objasněn na konkrétních příkladech přípravy redukovaného nikotlnamldadenindlnukleotidfosfátu za použití kvasinek a kvasinkovitých mikroorganismů.

Příklad 1

Rhodotorula glutlnls DBM 16 se aerobně kultivuje při 28 až 30°C v prostředí o pH 5,8 obsahujícím v 1 litru: 10,0 g glukosy, 5,0 g sušeného kvasnlčného autolyzátu a 5,0 g enzymového hydrolyzátu kaselnu. Po 18 h kultivace se buňky odstředí, promyjí vodou a vysuší na vzduchu. Pak se permeabilizují čtyřnásobným hmotnostním množstvím vychlazeného acetonu, ρσ odstředění se aceton slije a Jeho residua se odstraní proudem vzduchu. K reakční směsi 10 mM nikotinamldadenindinukleotldfosfátu a 10 mM MgClj, 3% hmot, kyseliny metafosforečné zneutralizované oomocí' M NaOH, 5 % hmot, glukosy, 1 mM NaN^ v trls-HCl pufru o pH 10,0 se přidají permeabillzované buňky v množství 30 mg buněčné sušiny/ml a inkubuje se za mírného třepáni 1,75 h při 30°C. Během této doby dojde k přeměně 65 až 96 % nikotlnamidadenindinukleotldfosfátu /NADPH/ v Jeho redukovanou formu a pouze 0,2 až 0,6 % se přemění v redukovaný nlkotlnemldadenlndinukleotid /NAOH/. Buňky se od reakční směsi oddělí centrlfugací oři 600 až 600 g a mohou se použít pro další podíl reakční směsi. Ze supernatantu se některým ze známých postupů izoluje redukovaný nikotinamidadenindinukleotldfosfát. Z odpadních buněk lze Jednoduchou extrakcí získat provitamin A pro veterinární účely.

Příklad 2

Lisované pekařské droždí se vysuší na vzduchu při teplotě do 33°C a imoblllzuje za sucha do epoxidového polymeru dlaňového typu připraveného z epoxidové pryskyřice a ečy ot-diaminopolyethylenoxidu podle postupu. Veruoviče B. a sp. /A0 č. 217 657/. Polymerační reakce probíhá 6 h při 35°C. Pak se získaný heterogenní biokatalyzátor, obsahující 25 % hmot, kvasnlčné sušiny, rozkrájí na krychličky o hraně cca 1 mm a třepe 15 min. s vychlazeným acetonem. Pak se aceton slije, katalyzátor se promyje 0,2 M trls-HCl pufrem b pH9,5 a použije pro reakční směs obsahující 5 mífl NADP+, 5m(Yl lYlgClj , 1 mCfl NaN^, 0,1 ΙΎ1 NaF, 3% hmot, metafosfátu a 2 % hmot, glukosy v takovém množství, aby buněčná sušina činila 30 mg/ml, a inkubuje se za mírného míchání 70 min při 2B°C. Po proběhnutí reakce se reakční směs slije a biokatalyzátor se použije znovu ve stejném objemu reakční směsi stejného složení jako při prvním použití, avšak s přídavkem glukosy v konečné koncentrací 4 % hmot.

Přeměna nlkotlnamidadenlndinukleotldfosfátu ZNADP+Z v jeho redukovanou formu ZNADPHZ pomocí permeabllizovaných buněk různých druhu kvasinek a kvasinkovitých mikroooqanlsmů

Použitý mikroorganismus, pH reakční směsi	konc.buněk /mg suš./ml/	reakční doba ZhZ	počát.konc. NADP ZmfflZ	konečné trace NADPH ZmmZ	končen- NADH ZmTHZ	výtěžek NA DPH ZV
Rhodotorula glutinls	0ΒΤΪ1	18
pH 10,0			27	0,75	5	4,8	0,04	96,7
pH 10,0			27	1,5	10	8,0	ne-	85 + ^Z
pH 10,0			27	2,25	20	12,0	stáno-	60,0+^Z
pH 10,0			27	2,25	30	14,5	véno	4B+Z
Rhodotorula glutinls	DBm	16
pH 9,0			24,1	1,0	5 .	⁴,⁵	0,07	89,1
Rhodotorula glutinls	DBffl	17
pH 9,0			24,2	!,□	5	4,0	0,05	79,4
Saccharomyces cerevisiae ΒΓΠΑ VII Zlisov. pekařské' droždí, Kolín/, pH 9,5	30	0,75	5	4,9	0,11	98,9
5.cerevisiae /dř.S.uvarum, pivovarská kvasinka, Budvar/
pH 10,0			30	0,75	5	2,8	0,00	55,6+Z
Candida util is DFCHT	36
pH 10,0			30	0,75	5	2 ,2	0,22	43,5+Z

+/ Konverze ještě stoupá, nutno prodloužit reakční dobu

Claims

1. Způsob přípravy redukovaného nikotpnamldadenlndlnukleotldfosfátu z nikotiňamiddinukleotídfosfátu.j vyznačující se tím, že se na nlkotinamidadenlndlnukleotlidfosfát působí permeabilizovanýml buňkami pravých kvasinek nebo kvasinkovitých mikroorganismů v přítomnosti fosfátu, glukosy nebo jejího vhodného endogenního nebo exogen— ního zdroje, popřípadě hořečnatých a zinečnatých iontů, při pH 7,2 až 11.

2. Způsob podle bodu I, vyznačující se tím, že se na nikotlnamldadenlňďínukleotldfosfát působí permeabilizovanýml buňkami druhu Rhodotorula glutlnis DBM 1B.

3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se na nikotlnamldadenlnďinukleotldfosfát působí permeabilizovanýml buňkami lisovaného pekařského droždí, aktivního sušeného droždí, lisovaného krmného droždí, například Candida utílls nebo odpadních pivovarských nebo vlnařských kvasnic, například Saccharomyces cerevlsiae, Saccharomyces uvarum a Saccharomyces bayanus.

4. Způsob podle bodu 1 až 3, vyznačující se tím, že se na nikotlnamldádenindinukleotidfosfát působí imobillzovanými permeabilizovanýml buňkami.

5. Způsob podle bodu 1 až 4, vyznačující se tím, že zdrojem glukosy Je škrobový sirup nebo hydrolyzát celulózy nebo dřeva.

6. Způsob podle bodu 1 až 5, vyznačující se tím, že se redukce nikotlnamldadenlndinukleotidfosfátu provádí v přítomnosti inhibitorů rozvoje mikrobiální kontaminace, například azidu. spdného nebo fluoridu sodného.

7. Způsob podle hodu 1 až 6, vyznačující se tím, že se redukce nikotinamldadenlndlnukleotidfosfátu: provádí během prepsratlvní redukce, vyžadující redukovaný nikotin amidadenindlnukleotldfosf át.