CS266909B1 - Method of reduced nicotinamidadenindinucleotide preparation - Google Patents
Method of reduced nicotinamidadenindinucleotide preparation Download PDFInfo
- Publication number
- CS266909B1 CS266909B1 CS874552A CS455287A CS266909B1 CS 266909 B1 CS266909 B1 CS 266909B1 CS 874552 A CS874552 A CS 874552A CS 455287 A CS455287 A CS 455287A CS 266909 B1 CS266909 B1 CS 266909B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- adenine dinucleotide
- cells
- nicotinamide adenine
- permeabilized
- reduction
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 5
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims abstract description 32
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 claims abstract description 24
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 241001524178 Paenarthrobacter ureafaciens Species 0.000 claims abstract description 10
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 4
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims abstract description 3
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 4
- PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M sodium fluoride Chemical compound [F-].[Na+] PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract 4
- 239000011775 sodium fluoride Substances 0.000 claims abstract 2
- 235000013024 sodium fluoride Nutrition 0.000 claims abstract 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 6
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000006188 syrup Substances 0.000 claims description 3
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000002023 wood Substances 0.000 claims description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 abstract 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 abstract 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 18
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193171 Clostridium butyricum Species 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 2
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 2
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000000852 hydrogen donor Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-L NADH(2-) Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-L 0.000 description 1
- 239000004280 Sodium formate Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000007357 dehydrogenase reaction Methods 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 125000005341 metaphosphate group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M sodium formate Chemical group [Na+].[O-]C=O HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019254 sodium formate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 1
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Způsob přípravy redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu enzymovou redukcí spočívá v tom, že se na nikotinamidadenindinukleotid působí permeabilizovanými buňkami druhu Arthrobacter ureafaciens Krebs et Eggleston, v přítomnosti jimi metabolizovatelného sacharidu a fosfátu. Buňky se pěstují v půdě obsahující zdroje uhlíku, dusíku a minerálních látek. Zvláště výhodné je použití buněk Arthrobacter ureafaciens DBM 1076, uloženého ve sbírce mikroorganismů Katedry biochemie a mikrobiologie Vysoké školy chemicko-technologické v Praze pod číslem 1076. Permeabilizované buňky mohou být imobilizovány. Redukci lze provádět v přítomnosti 2 až 120 mM hořečnatých iontů jako stimulátoru a inhibitorů rozvoje mikrobiální kontaminace, například fluoridu sodného nebo azidu sodného.Process for preparing reduced nicotinamide adenine dinucleotide enzyme reduction is that it is a nicotinamide adenine dinucleotide acting by permeabilized cells species Arthrobacter ureafaciens Krebs et Eggleston, \ t in the presence of metabolisable ones carbohydrate and phosphate. Cells are grown in soil containing carbon, nitrogen and mineral sources substances. Particularly preferred is the use of Arthrobacter cells ureafaciens DBM 1076, deposited in collection of microorganisms of the Department of Biochemistry and Microbiology of the Institute of Chemical Technology in Prague under No. 1076. Permeabilized the cells can be immobilized. Reduction it can be carried out in the presence of 2 to 120 mM magnesium ions as a stimulator and inhibitors microbial contamination development, for example sodium fluoride or sodium azide.
Description
Vynález se týká způsobu přípravy redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu ÍNADH). Nikotinamidadenindinukleotid (NAD* je koen—zymem řady oxidoredukčních enzymů. Jeho redukovaná forma se používá při enzymovém stanovení řady organických sloučenin, v biochemickém výzkumu a při enzymové přípravě některých organických sloučenin. Zatímco nikotinamidadenindinukleotid je většinou jřipravován izolací z kvasinkových buněk. Je10 redukovaná forma je získávána redukcí izoovaného nikotinamidadenindinukleotidu. Nejčastěji se používá redukce pomocí alkoholdehydrogenasy (E.C.1.1.1.1), malátdehydrogenasy (E.C. 1.1.1.37, E.C.1.1.1.38 nebo E.C.1.1.1.39) nebo formátdehydrogenasy (E.C.1.2.1.2) s příslušným enzymovým substrátem jako donorem vodíku. Při těchto postupech se používají izolované přečištěné enzymy, většinou v imobilizované formě. ,The invention relates to a process for the preparation of reduced nicotinamide adenine dinucleotide (INADH). Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD * is a coenzyme of a number of redox enzymes. Its reduced form is used in the enzymatic determination of a number of organic compounds, in biochemical research and in the enzymatic preparation of some organic compounds. Reduction with alcohol dehydrogenase (EC1.1.1.1), malate dehydrogenase (EC 1.1.1.37, EC1.1.1.38 or EC1.1.1.39) or format dehydrogenase (EC1.2.1.2) with the appropriate enzyme substrate as hydrogen donor is most commonly used. These processes use isolated purified enzymes, mostly in immobilized form.
Protože čisté enzymy jsou poměrně drahé, neboť jejich izolace a čištění jsou často technicky náročné, a navíc je stabilita čistých enzymů omezená, bylo pro redukci nikotinamidadenindinukleotidu navrženo použití celých, rozdrcených nebo permeabilizovaných mikrobiálních buněk jako zdroje příslušných dehydrogenas, případně hydrogenas (Izumi Y. a sp. J. Ferment. Technol. 61, 135, 1983) používají pro redukci nikotinamidadenindinukleotidu permeabilizované buňky mikroorganismů s vysokou aktivitou formátdehydrogenasy (E.C.1.2.1.2), tj. některé kvasinky a bakterie. Substrátem je zde mravenčan sodný, který však při použitém pH uvolňuje těkavou mravenčí kyselinu, působící korozivně na zařízení a dráždivě na sliznice obsluhujícího personálu. Pro redukci 60 % přítomného nikotinamidadenindinukleotidu je přitom zapotřebí tříhodinová inkubace. Tato poměrně dlouhá inkubační doba je nevýhodná také proto, že redukovaný nikotinamidadenindinukleotid se ve vodném roztoku zvolna rozkládá na sloučeniny, jež inhibují reakce dehydrogenas, čímž se redukovaný nikotinamidadenindinukleotid znehodnocuje. Yokoyama S. a Suye S. (Franc, patent 2 562 089) používají jako zdroj malátdehydrogenasy pro redukci nikotinamidadenindinukleotidu rozdrcené buňky bakterie Achromobacter parvulus, u nichž inaktivují oxidasu redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu zahřáťím na 50 °C. K dosažení redukce 98 % přidaného nikotinamidadenindinukleotidu je však zapotřebí 6 hodin. Klibanov A. M. a Puglisi V. A. (Biotechnol. Letters 2, 445^1980) navrhují pro redukci nikotinamidadenindinukleotidu plynným vodíkem imobilizované buňky bakterie Alcaligenes eutropus. Postup je však technicky značně náročný, neboť uvedenou bakterii je nutno pěstovat v atmosféře obsahující 80 % plynného vodíku a také redukce nikotinamidadenindinukleotidu probíhá v atmosféře plynného vodíku. Navíc je účinnost celého systému opět velmi nízká: Na redukci 1 mM nikotinamidadenindinukleotidu s 85% účinností je třeba 6 h. Rovněž buňky Clostridium butyricum, použité pro hydrogenaci nikotinamidadenindinukleotidu plynným vodíkemBecause pure enzymes are relatively expensive because they are often technically demanding to isolate and purify, and the stability of pure enzymes is limited, the use of whole, crushed or permeabilized microbial cells as a source of appropriate dehydrogenases or hydrogenases has been proposed to reduce nicotinamide adenine dinucleotide (Izumi Y. and J. Ferment Technol. 61, 135, 1983) use permeabilized cells of microorganisms with high format dehydrogenase activity (EC1.2.1.2), i.e. some yeasts and bacteria, to reduce nicotinamide adenine dinucleotide. The substrate here is sodium formate, which, however, at the pH used releases volatile formic acid, which is corrosive to the equipment and irritating to the mucous membranes of the operating personnel. A three-hour incubation is required to reduce 60% of the nicotinamide adenine dinucleotide present. This relatively long incubation period is also disadvantageous because the reduced nicotinamide adenine dinucleotide in aqueous solution slowly decomposes into compounds that inhibit dehydrogenase reactions, thereby degrading the reduced nicotinamide adenine dinucleotide. Yokoyama S. and Suye S. (Franc, U.S. Pat. No. 2,562,089) use crushed Achromobacter parvulus cells as a source of malate dehydrogenase to reduce nicotinamide adenine dinucleotide, in which they inactivate reduced nicotinamide adenine dinucleotide oxidase by heating to 50 ° C. However, 6 hours are required to achieve a 98% reduction in the added nicotinamide adenine dinucleotide. Klibanov A. M. and Puglisi V. A. (Biotechnol. Letters 2, 445, 1980) propose immobilized Alcaligenes eutropus cells for the reduction of nicotinamide adenine dinucleotide by hydrogen gas. However, the process is technically very demanding, since said bacterium has to be grown in an atmosphere containing 80% of hydrogen gas and the reduction of nicotinamide adenine dinucleotide also takes place in an atmosphere of hydrogen gas. In addition, the efficiency of the whole system is again very low: It takes 6 h to reduce 1 mM nicotinamide adenine dinucleotide with 85% efficiency. Also, Clostridium butyricum cells used for hydrogenation of nicotinamide adenine dinucleotide with hydrogen gas
CS 266 909 B1 (Matsunaga I. a sp., Biotechnol. Bioeng. 27, 1 277, 1985), mají poměrně malou aktivitu, takže během 5 h bylo redukováno pouze 60 % nikotinamidadenindinukleotidu. U mobilizovaných buněk Clostridium butyricum byl sice během 5 h redukován veškerý nikotinamidadenindinukleotid, avšak jeho počáteční koncentrace byla pouze 0,8 mM. Přitom bylo nutno použít plynný vodík za tlaku 10 MPa, což představuje značné technologické komplikace.CS 266 909 B1 (Matsunaga I. et al., Biotechnol. Bioeng. 27, 1277, 1985), have relatively little activity, so that only 60% of the nicotinamide adenine dinucleotide was reduced in 5 hours. Although all nicotinamide adenine dinucleotide was reduced in mobilized Clostridium butyricum cells within 5 h, its initial concentration was only 0.8 mM. It was necessary to use hydrogen gas at a pressure of 10 MPa, which represents considerable technological complications.
Uvedené nedostatky odstraňuje způsob pří, pravý redukovaného nikotinamidadenindinu' kleotidu enzymovou redukcí podle vynálezu, který spočívá v tom, že se na nikotinamidadenindinukleotid působí permeabilizovanými buňkami bakterie Arthrobacter ureafaciens Krebs et Eggleston v přítomnosti fosfátu a 0,2 až 5 % (hmot./obj.) glukózy nebo jiného jimi metabolizovatelného sacharidu, například glukózy nebo jejich přirozeného zdroje jako je škrobový sirup, melasa, hydrolyzát celulózy nebo dřeva apod. Enzymovou redukci je výhodné provádět v přítomnosti 2 až 120 mM hořečnatých iontů. Zvláště výhodné je použití buněk Arthrobacter ureafaciens DBM 1076, uloženého ve sbírce mikroorganismů katedry biochemie a mikrobiologie Vysoké školy chemickotechnologické v Praze pod číslem 1076. Permeabilizované buňky mohou být také mobilizovány.The process for the reduction of nicotinamide adenine dinucleotide by enzymatic reduction according to the invention overcomes these drawbacks by treating the nicotinamide adenine dinucleotide with permeabilized cells of Arthrobacter ureafaciens Krebs et Eggleston in the presence of phosphate and 0.2 to 5% (w / v). ) of glucose or another metabolizable saccharide thereof, for example glucose or a natural source thereof such as starch syrup, molasses, cellulose or wood hydrolyzate and the like. Enzymatic reduction is preferably performed in the presence of 2 to 120 mM magnesium ions. Particularly preferred is the use of Arthrobacter ureafaciens DBM 1076 cells, deposited in the collection of microorganisms of the Department of Biochemistry and Microbiology of the University of Chemical Technology in Prague under number 1076. Permeabilized cells can also be mobilized.
Extracelulární redukce nikotinamidadenindinukleotidu pomocí permeabilizovaných buněk Arthrobacter ureafaciens a sacharidu podle vynálezu se provádí tak, že se buňky tohoto mikroorganismu pomnoží za aerobních podmínek v tekutém médiu obsahujícím vedle vhodného zdroje uhlíku a energie také zdroje dusíku ve formě amonné soli, kvasniěného extraktu (autolyzátu), peptonu nebo jiného přirozeného zdroje tohoto prvku, dále hořečnaté a draselné ionty, fosfáty a sulfát. Buňky se oddělí od pomnožovacího média, nejlépe odstředěním, a podle potřeby promyjí vodou. Permeabilizace buněk se dosáhne buď třepáním s acetonem, nebo jiným rozpouštědlem nebo působením vhodné povrchově aktivní látky například dodecylsulfátu, cetylpyrimidiumchloridu apod. nebo opakovaným zmražením a rozmrazováním. Pro mobilizaci buněk se může použít vhodný gel jako je polyakrylamid, agar, genu-carageenan, alginát apod. Permeabilizace buněk může být aplikována před jejich imobilizací nebo až po ní.Extracellular reduction of nicotinamide adenine dinucleotide by permeabilized Arthrobacter ureafaciens cells and saccharide according to the invention is carried out by propagating the cells of this microorganism under aerobic conditions in a liquid medium containing in addition to a suitable carbon and energy source nitrogen sources in ammonium salt, yeast extract (autolysate), peptone. or another natural source of this element, as well as magnesium and potassium ions, phosphates and sulfate. The cells are separated from the propagation medium, preferably by centrifugation, and washed with water as needed. Permeabilization of the cells is accomplished either by shaking with acetone or another solvent or by treatment with a suitable surfactant such as dodecyl sulfate, cetylpyrimidium chloride and the like, or by repeated freezing and thawing. A suitable gel such as polyacrylamide, agar, gene carrageenan, alginate, etc. can be used to mobilize the cells. Permeabilization of the cells can be applied before or after immobilization.
Přeměna nikotinamidadenindinukleotidu v jeho redukovanou formu probíhá v reakční směsi obsahující 1 až 60 mM nikotinamidadenindinukleotid, 2 až 120 mM Mg21, 0,2 až 5 % hmot./obj. glukózy, 0,05 až 5 % (hmot./obj.) metafosfátu nebo ortofosfátu a volné nebo imobilizované permeabilizované buňky v množství 5 až 100 mg buněčné sušiny/ml reakční směsi. Pro potlačení rozvoje kontaminace u opakovaně používaných mobilizovaných buněk je možno přidat NaN3 (0,1 až 3,0 mmol/dm3) nebo NaF (10 až 300 mmol/dm3). Základní látky, aktivátory i inhibitory se rozpouští ve vhodném pufru o pH 5,5 až 9,5. Reakční teplota se volíThe conversion of nicotinamide adenine dinucleotide to its reduced form takes place in a reaction mixture containing 1 to 60 mM nicotinamide adenine dinucleotide, 2 to 120 mM Mg 21 , 0.2 to 5% w / v. glucose, 0.05 to 5% (w / v) metaphosphate or orthophosphate and free or immobilized permeabilized cells in an amount of 5 to 100 mg cell dry matter / ml of reaction mixture. NaN 3 (0.1 to 3.0 mmol / dm 3 ) or NaF (10 to 300 mmol / dm 3 ) can be added to suppress the development of contamination in reusable mobilized cells. The basic substances, activators and inhibitors are dissolved in a suitable buffer of pH 5.5 to 9.5. The reaction temperature is chosen
CS 266 909 Bl v rozmezí 20 až 55 ° C.CS 266 909 B1 in the range of 20 to 55 ° C.
Po proběhnutí reakce se reakční kapalina oddělí od bakteriálních buněk např. odstředěním, dekantací nebo filtrací a izoluje se z ní některým ze známých postupů redukovaný nikotinamidadenindinukleotid.After the reaction has taken place, the reaction liquid is separated from the bacterial cells, for example by centrifugation, decantation or filtration, and the nicotinamide adenine dinucleotide reduced by any of the known methods is isolated therefrom.
Způsob podle vynálezu umožňuje redukci až 20 mM nikotinamidadenindinukleotidu během 1 h s výtěžkem 90 až 95 % redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu. Zároveň jako donoru vodíku využívá metabolizovatelné cukry popřípadě i ve formě melasy, škrobového sirupu, hydrolyzátů celulózy nebo dřeva. Reakce probíhá v normální atmosféře, za normálního tlaku, což nevyžaduje žádné náročné zařízení.The process of the invention allows the reduction of up to 20 mM nicotinamide adenine dinucleotide in 1 h in a yield of 90 to 95% of the reduced nicotinamide adenine dinucleotide. At the same time, it uses metabolizable sugars as a hydrogen donor, possibly also in the form of molasses, starch syrup, cellulose hydrolysates or wood. The reaction takes place in a normal atmosphere, at normal pressure, which does not require any demanding equipment.
Vynález je v dalším blíže objasněn na konkrétních příkladech způsobu přípravy redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu za použití Arthrobacter ureafaciens DBM 1076.The invention is further elucidated on specific examples of a process for the preparation of a reduced nicotinamide adenine dinucleotide using Arthrobacter ureafaciens DBM 1076.
Příklad 1Example 1
Arthrobacter ureafaciens DBM 1076 se aerobně kultivuje při 30 °C v prostředí o pH 7,2, obsahujícím v 1 litru 20 g glukózy, 1,0 g (NH4)2SO4, 0,1 g MgSO4.7 H2O, 8,7 g K2HPO4, 10 g sušeného kvasničného autolyzátu a 10 g peptonu. Po 18 h kultivace se buňky odstředí při 800 g, promyjí vodou a permeabilizují zhruba dvojnásobným objemem vychlazeného acetonu po dobu 15 min. Pak se buňky odstředí, aceton se slije a jeho residua se odstraní proudem vzduchu. K reakční směsi 10 mM nikotinamidadenindinukleotidu, 20 mM MgCl2, 1 % (hmot./obj.) kyseliny metafosforečné neutralizované pomocí 1 N NaOH a 2 % glukózy (hmot./obj.) v Tris-HCl pufru o pH 9,0 se přidají permeabilizované buňky v množství 30 mg buněčné sušiny/ml reakční směsi a inkubuje se za třepání 1 h při 30 °C. Během této doby dojde k přeměně 90 až 95 % nikotinamidadenindinukleotidu v jeho redukovanou formu. Buňky se od reakční směsi oddělí centrifugací při 800 až 1 000 g a ze supernatantu se některý ze zná mých postupů izoluje redukovaný nikotinamidadenindinukleotid.Arthrobacter ureafaciens DBM 1076 is aerobically cultured at 30 ° C in a pH 7.2 medium containing in 1 liter 20 g of glucose, 1.0 g (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1 g MgSO 4 .7 H 2 O , 8.7 g of K 2 HPO 4 , 10 g of dried yeast autolysate and 10 g of peptone. After 18 h of culture, the cells were centrifuged at 800 g, washed with water and permeabilized with approximately twice the volume of chilled acetone for 15 min. The cells are then centrifuged, the acetone is decanted and its residues are removed with a stream of air. To a reaction mixture of 10 mM nicotinamide adenine dinucleotide, 20 mM MgCl 2 , 1% (w / v) metaphosphoric acid neutralized with 1 N NaOH and 2% glucose (w / v) in Tris-HCl buffer pH 9.0 was added. add permeabilized cells at 30 mg cell dry matter / ml reaction mixture and incubate with shaking for 1 h at 30 ° C. During this time, 90 to 95% of the nicotinamide adenine dinucleotide is converted to its reduced form. The cells are separated from the reaction mixture by centrifugation at 800 to 1000 g and the reduced nicotinamide adenine dinucleotide is isolated from the supernatant by any of the known methods.
Příkl ad 2Example 2
Mikrobiální buňky Arthrobacter ureafaciens DBM 1076 se získají postupem uvedeným v příkladu 1. 16 g promytých vlhkých buněk se imobilizuje v alginátu, imobilizované buňky se promyjí 0,05 M CaCl2 v Tris-HCl pufru o pH 9,0 a míchají 15 min. v dvojnásobném objemu acetonu. Pak se aceton slije a jeho zbytky se odstraní proudem vzduchu. K takto získaným permeabilizovaným imobilizovaným buňkám se přidá trojnásobné množství (obj./hmot.) reakční směsi obsahující v konečných koncentracích 20 mM nikotinamidadenindinukleotid, 20 mM MgCl2, 0,05 M CaCl2 a 1 mM NaN3, 1 %(hmot./obj.) kyseliny metafosforečné neutralizované pomocí 1 N NaOH, 2 % (hmot./ obj.) sacharózy v Tris-HCl pufru o pH 9,0 a inkubuje se za mírného míchání 1 h při 30 °C. Pak se reakční kapalina oddělí od imobilizovaných buněk filtrací a z filtrátu se některým ze známých postupů izoluje redukovaná forma nikotinamidadenindinukleotidu. Imobilizované buňky se použijí pro další podíl reakční směsi. Jejich enzymová aktivita zůstává zachována po dobu 7 až 14 dnů.Arthrobacter ureafaciens DBM 1076 microbial cells were obtained as described in Example 1. 16 g of washed wet cells were immobilized in alginate, the immobilized cells were washed with 0.05 M CaCl 2 in Tris-HCl buffer pH 9.0 and stirred for 15 min. in twice the volume of acetone. The acetone is then decanted off and its residues are removed with a stream of air. To the permeabilized immobilized cells thus obtained, three times the amount (v / w) of a reaction mixture containing at final concentrations 20 mM nicotinamide adenine dinucleotide, 20 mM MgCl 2 , 0.05 M CaCl 2 and 1 mM NaN 3 , 1% (w / w) was added. v / v) metaphosphoric acid neutralized with 1 N NaOH, 2% (w / v) sucrose in Tris-HCl buffer pH 9.0 and incubated with gentle agitation for 1 h at 30 ° C. The reaction liquid is then separated from the immobilized cells by filtration, and the reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide is isolated from the filtrate by any of the known methods. The immobilized cells are used for another portion of the reaction mixture. Their enzyme activity is maintained for 7 to 14 days.
Příklad 3Example 3
Buňky Arthrobacter ureafaciens připravené podle postupu uvedeného v příkladu 1 se mobilizují do polyakrylamidu a permeabilizují mícháním s dvojnásobným objemem acetonu. Po odstranění acetonu se imobilizované buňky plní do kolony, kterou se poté nechá protékat reakční směs shodného složení jako v příkladu 2. Rychlost průtoku se volí tak, aby se celková náplň reakční směsi v koloně vyměnila za 45 až 60 min. Tento kontinuální způsob biotransformace poskytuje výtěžnost redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu 90 až 95 %.Arthrobacter ureafaciens cells prepared according to the procedure described in Example 1 were mobilized into polyacrylamide and permeabilized by stirring with twice the volume of acetone. After removing the acetone, the immobilized cells are loaded onto a column, which is then passed through a reaction mixture of the same composition as in Example 2. The flow rate is chosen so that the total load of the reaction mixture in the column is changed in 45 to 60 minutes. This continuous biotransformation process provides a yield of reduced nicotinamide adenine dinucleotide of 90 to 95%.
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS874552A CS266909B1 (en) | 1987-06-22 | 1987-06-22 | Method of reduced nicotinamidadenindinucleotide preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS874552A CS266909B1 (en) | 1987-06-22 | 1987-06-22 | Method of reduced nicotinamidadenindinucleotide preparation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS455287A1 CS455287A1 (en) | 1989-05-12 |
| CS266909B1 true CS266909B1 (en) | 1990-01-12 |
Family
ID=5388553
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS874552A CS266909B1 (en) | 1987-06-22 | 1987-06-22 | Method of reduced nicotinamidadenindinucleotide preparation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS266909B1 (en) |
-
1987
- 1987-06-22 CS CS874552A patent/CS266909B1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS455287A1 (en) | 1989-05-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4637982A (en) | Process for biological preparation of amides | |
| Lynd et al. | Carbon monoxide metabolism of the methylotrophic acidogen Butyribacterium methylotrophicum | |
| Kuninaka et al. | Studies on 5′-Phosphodiesterases in Microorganisms: Part II. Properties and Application of Penicillium citrinum 5′-Phosphodiesterase | |
| JPS62285779A (en) | 1,4-butanediol-producing bacterial strain belonging to bacillus genus and production of 1,4-butanediol using same | |
| US5935827A (en) | Maltose phosphorylase, trehalose phosphorylase, novel strain of genus plesiomonas capable of producing these enzymes and process for producing trehalose | |
| JP2001037469A (en) | Biodegradation of epichlorohydrin | |
| Yoshida et al. | Production and application of maltose phosphorylase and trehalose phosphorylase by a strain of Plesiomonas | |
| Nishio et al. | Conversion of d-xylose into xylitol by immobilized cells of Candida pelliculosa and Methanobacterium sp. HU | |
| Matsunaga et al. | Regeneration of NAD (P) H by immobilized whole cells of Clostridium butyricum under hydrogen high pressure | |
| CS266909B1 (en) | Method of reduced nicotinamidadenindinucleotide preparation | |
| JP3586684B1 (en) | Novel microorganisms that convert validamycin to valienamin and validamin | |
| Ogata et al. | Studies on the metabolism of pantothenic acid in microorganisms: Part I. Distribution of CoA-accumulating activity in microorganisms and isolation of reaction products | |
| Ueng et al. | Fructose production from sucrose and high fructose syrup: a mycelial fungal system | |
| JPH0420597B2 (en) | ||
| JP3204924B2 (en) | Method for producing L-aspartic acid and fumaric acid and / or L-malic acid | |
| JPH07327691A (en) | Production of trehalose | |
| WO1992018637A1 (en) | Method for the production of d-gluconic acid | |
| JP2768473B2 (en) | Method for producing NADH oxidase | |
| CHELVI et al. | Microbial production of glucoamylase from agro wastes | |
| CS272660B1 (en) | Immobilized biocatalyst for nicotinamidadenindinucleotide's enzymic reduction and method of its preparation | |
| CS266763B1 (en) | Method of reduced nicotinamidadeninnucleotidephosphate preparation | |
| Kurowski et al. | The production of 3‐ketosucrose by Agrobacterium tumefaciens in batch culture | |
| JP3011472B2 (en) | Production method of indigo by enzymatic method | |
| JP3129773B2 (en) | Method for producing D-ribose | |
| Prabhakar et al. | Media optimization studies for glucose isomerase production by arthrobacter species |