CS264290B2

CS264290B2 - Process for preparing carbocyclic nucleosides of purine

Info

Publication number: CS264290B2
Application number: CS871517A
Authority: CS
Inventors: Yoshio Taniyama; Takumi Hamana; Ryuji Marumoto; Naoki Yamamoto
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1986-03-06
Filing date: 1987-03-06
Publication date: 1989-06-13
Also published as: KR870008911A; CS151787A2; JPS6310787A; SU1561826A3; DD255351A5

Description

Tento vynález se týká nukleosidových analogů obsahujících cyklopentanový kruh, které se mohou používat jako náhrada purinových nukleosidů v oblasti biologie, lékařství a genových manipulací, stejně jako protivirové prostředky.

Deriváty sloučenin obecného vzorce

kde

Y znamená guanin-9-ylovou nebo adenin-9-ylovou skupinu, jsou příklady dideoxylových analogů purinových nukleosidů používaných ke stanovení základních sekvencí Nat. Acad. Sci. USA, 74, 4563 (1977)]. Αν kyselině deoxyribonukleové (DNA) [Proč, však 2‘,3‘'dideoxyanalogy purinových nukleosidů jsou také citlivé ke kyselinám, takže štěpení probíhá snadno na glykosylové vazbě, což způsobuje velké obtíže při jejich syntéze.

Nedávno bylo popsáno, že 2‘,3‘-dideoxyanalogy purinových nukleosidů mohou působit jako inhibitory reverzní transkriptázy virového půdovu, a proto tyto analogy upoutaly pozornost jako terapeutika pro choroby způsobené virem RNA [Chemical and Engineering, News, 27. leden, č. 28 (1986)].

Třebaže jak je zmíněno výše, dedeoxynukleosidy a jejich karbocyklické analogy se studovaly v určitém rozsahu, je zde stále řada stránek, které mají být objasněny. Proto je důležitá syntéza a vývoj různých analogů. Tento vynález se týká způsobu výroby nových 2‘,3‘-dideoxykarbocyklických nukleosidů, které mohou být používány jako protivirové prostředky nebo pro jiné účely·

Předložený vynález se tedy týká způsobu výroby karbocyklických purinových nukleosidů obecného vzorce I _{p C}'^Y w

(I) kde

R znamená hydroxyskupinu popřípadě chráněnou monomethoxytritylovou nebo dimethoxytritylovou skupinou a

Y znamená adenin-9-yl, hypoxanthin-9

-yl nebo guanin-9-yl popřípadě chráněný benzoylovou, isobutyrylovou nebo acetylovou skupinou, a jejich farmaceuticky přijatelných solí.

Sloučeniny obecného vzorce I se připraví tak, že se sloučenina obecného vzorce II

(II) kde

R a Y mají výše uvedený význam .a buď Ri nebo R2 znamená hydroxyskupinu a druhý z těchto substituentů znamená vodík, thiokarbonyluje, pak se provede redukce tributylstannanem za přítomnosti a,a‘azobisisobutylnitrilu pro deoxidaci v poloze 2* nebo 3‘ a popřípadě se odstraní všechny chránicí skupiny ze substituentů R a Y.

Konkrétněji se sloučenina obecného vzorce I ze sloučeniny obecného vzorce II, hydroxyskupina v poloze 2‘ nebo 3‘ ve sloučenině obecného vzorce II je thiokarbonýlována za teploty 0 až 80 °C nebo s výhodou za teploty místnosti, potom se provádí redukce tributylcínhydrídem v přítomnosti ekvivalentního množství nebo přebytku a,a‘-azobisisobutylonitrilu za teploty mezi 0 a 100 °C po dobu. 30 minut až 2 hodin, čímž se dostane 2‘,3‘-dideoxyderivát obecného vzorce I. Thiokarbonylace se může přednostně provádět za použití thiokarbonyldiimidazolu к thiokarbonylaci a fenylchlorthlokarbonátu к fenoxythiokarbonylaci. Dále se S-methyldithiokarbonylace může provádět také za použití směsi sirouhlíku a methyljodidu. Po této redukci se skupina chránicí 6‘-hydroxyskupinu, například 4,4‘-dimethoxytritylová skupina, snadno odstraní za kyselých podmínek (například zpracováním s kyselinou octovou nebo 1-normální kyselinou chlorovodíkovou za teploty místnosti) a kromě toho se chránicí skupina z purinové báze může odstranit za alkalických podmínek (například působením koncentrovaného vodného amoniaku 1-normálního hydroxidu sodného nebo 1-molárního ethoxidu sodného).

Sloučeniny obecného vzorce II se mohou vyrábět například tímto postupem:

Sloučenina obecného vzorce II, kde Y znamená .adenin-9-ylovou skupinu, která je popřípadě chráněna lze také vyrobit metodou, která je popsána v japonské zveřejněné patentové přihlášce č. 62992/1975, Chemical and Pharmaceutical Bulletin 24, 2624 (1976) nebo Nucleic Acids Symposium Series, 16, 141 (19851). Tak například metodou popsanou v japonské zveřejněné patentové přihlášce č. 62992/1975 nebo Chemical and Pharmaceutical Bulletin 24, 2624 (1976) se získá sloučenina obecného vzorce II, kde Y znamená adenin-9-ylovou skupinu, buď Ri, nebo R2 znamená hydroxyskupinu a druhý z těchto substituentů znamená vodík a R znamená hydroxyskupinu, za použití aristeromycinu jako· výchozí sloučeniny a sloučenina obecného vzorce II, kde Y znamená N⁶-benzoyladenin-9-ylovou skupinu, R znamená hydroxyskupinu chráněnou 4,4^<-dimethoxytritylovou skupinou, Ri znamená atom vodíku a R2 představuje hydroxyskupinu, se získá metodou popsanou ve výše zmíněné publikaci Nucleic Acids Symposium Series. Sloučenina obecného vzorce Г, kde Y znamená guanin-9-ylovou nebo hypoxanthin-9-ylovou skupinu, která může být chráněna, s atomem vodíku v poloze 2‘ a hydroxyskupinou v poloze 3‘ se získá metodou, která je popsána v japonské zveřejněné patentové přihlášce č. 1740/1987.

Naproti tomu sloučenina obecného vzorce II, kde Y znamená 2,6-diaminopurin-9-ylovou skupinu, Ri znamená vodík, R2 představuje hydroxyskupinu, se může připravit synteticky tímto postupem. Hydroxyskupina ze sloučeniny, kde Y znamená adenin-9-ylovou skupinu se chrání, poté se provede N¹-oxidace peroxidem vodíku nebo m-chlorperbenzoovou kyselinou, potom se aminoskupina v poloze 6 deaminuje působením kyseliny dusité a provede se zahřívání s oxychloridem fosforečným (japonská patentová publikace č. 4347/1976), aby se získal odpovídající 2,6-dichlorpurin-9-ylový derivát. Chlor v poloze 6 je nahrazen aminoskupinou a za použití dusitanu sodného ve vodé kyselině octové se provádí deaminace na 2-chlor-6-hydroxy-9-ylový produkt. Takto získaná sloučenina se podrobí amidaci v poloze 2 a potom chloraci v poloze 6, chlor v této poloze se nahradí aminoskupinou a získá se požadovaná sloučenina.

Soli sloučenin obecného vzorce I padle tohoto vynálezu zahrnují soli vytvořené na aminoskupině purinové báze s minerální kyselinou (například kyselinou chlorovodíkovou, kyselinou sírovou, kyselinou dusičnou), organickou karboxykyselinou (například kyselinou octovou, kyselinou mléčnou, kyselinou vinnou, kyselinou maleinovou, kyselinou jantarovou) nebo organickou sulfonovou kyselinou (například kyselinou methansulfonovou, kyselinou ethansulfonovou, kyselinou benzensulfonovou).

Sloučeniny obecného vzorce I podle tohoto vynálezu, poskytují vhodný prostředek к genovému klonování. To znamená, že analogy odvozené od sloučenin podle vynálezu obsahující cyklopentanový kruh jsou karbocyklické analogy purin-2‘,3‘-dideoxynukleotidu a snadno se syntetizují v důsledku nepřítomnosti glykosylové vazby a jejich tri fosfátové deriváty se mohou používat jako prostředky к zastavení prodlužování DNA řetězce při ukončení DNA sekvencí.

Naproti tomu sloučeniny obecného vzorce I mají protivirový účinek proti DNA virům nebo RNA virům. Jako DNA viry je možné uvést skupinu herpes virů (například herpes simplex virus typ I nebo II, cytomegalovirus, Epstein-Barr virus), adenovirus (například typ III), Hepatitis В virus nebo poxvirus, jako RNA viry je možné uvést virus způsobující nedostatečnou imunitu u lidí (HIV), který je patogenem syndromu získaného selhání imunity (AIDS], virus vesikulární stomatitidy, virus leukemie koček, virus infekční anemie koní. Sloučeniny podle tohoto vynálezu mají zvláště silný protivirový účinek proti RNA virům, zvláště viru HTLV-JII (lymfotropní virus typu III T-buněk člověka, HIV HTVL-III), který je jedním z HIV, jako možné inhibitory reversní transkriptázy.

Proto sloučeniny podle tohoto vynálezu se mohou používat pro ošetřování různých virových infekcí. Jako takové virové infekce se mohou jmenovat syndrom získaného selhání imunity u člověka, herpes simplex (typ I nebo II), plané neštovice, pásový 0par, keratitida, konjuktivitida nebo akutní hepatitida, různé příležitostné infekce, zhoubné nádory nebo příznaky nemocí centrálního nervového systému, které jsou způsobeny virovými infekcemi a selhání imunity.

Sloučeniny obecného vzorce I a jejich farmaceuticky přijatelné soli se mohou použít jako protivirové prostředky к ošetřování chorob vyvolaných viry u zvířat, zvláště u savců (laboratorních zvířat, jako je králík, krysa a myš, malých zvířat, jako je pes a kočka, člověka, zemědělských užitkových zvířat, jako je hovězí dobytek, kůň, ovce a vepř).

Obecně se к výše uvedenému účelu používá vhodná účinná dávka sloučenin podle tohoto vynálezu v rozmezí 30 až 500 mg na 1 kg tělesné hmotnosti za den, s výhodou v rozmezí 100 až 300 mg na 1 kg tělesné hmotnosti za den. Požadovaná dávka je obvykle přítomna jako dvě, tři nebo čtyři dílčí dávky, které se podávají ve vhodných intervalech během dne. Podávání se může provádět libovolnou cestou, včetně orální, rektální, nasální a lokální (například bukální nebo sublinguální), vaginální a parenterální (například subkutánní, intramuskulární, intravenózní, intradermální). Výhodná cesta podání se může měnit například podle stavu a věku příjemce. I když sloučeniny podle vynálezu je možné podávat samotné, je výhodné podávat je jako složku farmaceutického prostředku. Prostředky podle tohoto vynálezu zahrnují alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I dohromady s alespoň jedním jejich přijatelným nosičem a popřípadě jinými terapeutickými přísadami.

S

Prostředek může být vhodně přítomen v jednotkové dávkové formě. Prostředky obsahující sloučeninu podle tohoto vynálezu pro orální podání zahrnují oddělené jednotky, jako jsou kapsle nebo tablety, prášek nebo granule, dále roztok nebo suspenzi nebo kapalnou emulzi oleje ve vodě nebo kapalnou emulzi vody v oleji a podobně.

Tablety se mohou vyrábět lisováním nebo odléváním, popřípadě s alespoň jednou dodatečnou složkou. Lisované tablety se mohou připravovat na vhodném stroji lisováním sloučeniny podle tohoto vynález ve formě prášku nebo· granulí, popřípadě ve směsi s pojivém (například hydroxypropylcelulózou), mazadlem (například hořečnatou solí kyseliny stearové), inertním ředidlem (například škrobem), ochranným prostředkem, povrchově aktivní látkou nebo dispergačním prostředkem.

Prostředky pro parenterální podání zahrnují vodné a nevodné sterilní injekční roztoky, které mohou obsahovat antioxidanty, pufry nebo bakteriostatika, a vodné a nevodné sterilní suspenze, které mohou obsahovat suspendační prostředky a přísady к zahuštění konzistence. Prostředky mohou být přítomny v zásobnících s jednotkovou dávkou nebo s větším počtem dávek, například v uzavřených ampulích a lahvičkách a mohou se skladovat v lyofilizovaném stavu, kdy se vyžaduje přidání sterilního kapalného nosiče, například vody pro injekce, bezprostředně před použitím. Narychlo připravované injekční roztoky a suspenze se mohou získávat ze sterilních prášků, granulí a tablet.

Prostředky pro lokální podání zahrnují zdravotní bonbóny sestávající ze sloučenin podle tohoto vynálezu v aromatizovaném základu, obvykle sacharóze a akacii nebo tragantu. Pastilky obsahují sloučeninu podle tohoto vynálezu v inertním základě, jako želatině a glycerinu nebo sacharóze a akacii. Voda к večerní hygieně zahrnuje složku určenou к aplikaci ve vhodném kapalném nosiči.

Prostředek pro rektální podání může být přítomen jako čípek s vhodným základem, jako je kakaové máslo.

Prostředek pro vaginální podávání může být přítomen ve formě pesaru, tampónu, krému, želé, pasty, pěny nebo postřiku a obsahuje kromě sloučeniny podle tohoto vynálezu vhodné nosiče, které jsou známé v oboiru.

Mezi sloučeninami obecného vzorce I zvláště 2‘,3‘-dideoxyaristeromycin (sloučenina z příkladu 3) a 9-[(lS,4R)-4-hydroxymethyl-cyklopentan-l-yl]guanin (sloučenina z příkladu 4) zabraňují silně replikaci HIV viru původci AIDS, a proto jsou obzvláště vhodné sloučeniny.

Dále se popisují srovnávací příklady, příklady a příklady testů, kterými se konkrétně vysvětluje vynález.

Srovnávací příklad 1

Způsob syntézy 9-[ (lR,2S,3R,4R)-4-methyl^J2-hydroxy-3,6-(tetraisopropyldisiloxanyl)dioxycyklopentan-l-yl ] hypoxanthinu g (37,5 mmolu) C-analogu inosinu se rozpustí ve 200 ml bezvodého dimethylformamidu, přidá 13 ml (41 mmolů) 1,3-dichlor-l,l,3,3-tetraisopropyldisiloxanu a 11,3 gramu (165 mmolů) ímidazolu a směs se míchá za teploty místnosti 2,5 hodiny. Reakční směs se nakape do 2 litrů vody, sraženina se odfiltruje, promyje vodou, dále rychle promyje diethyletherem a suší. Sloučenina uvedená v nadpisu o hmotnosti 17,2 gramu se získá jako bílý prášek. Část produktu se rekrystaluje z dichlormethanu a dostanou se krystaly o teplotě tání 135 až 138 °C.

Pozmenává se, že C-analog inosinu je známý z Chemical and Pharmaceutical Bulletin 24, 2624 (1976).

Srovnávací příklad 2

Způsob syntézy 9-[(lR,2S,3R,4R)-4-methyl-2-f enoxythiokarbonyloxy-3,6- (tetraisopropyldisiloxanyl)dioxycyklopentan-l-yl]hypoxantinu

11,2 g (22,3 mmolu) sloučeniny získané ve srovnávacím příkladu 1 se rozpustí ve 300 ml bezvodého acetonitrilu, přidá se 15,8 gramu (53,5 mmolu) dimethylaminopyridinu a 5 g (29 mmolů) fenoxythiokarbonylchloridu a směs se míchá za teploty místnosti 7 hodin. Rozpouštědlo se oddestiluje za sníženého tlaku a odparek se rozpustí ve 250 ml chloroformu. Roztok se dvakrát promyje vždy 250 ml 0,'5 molárního roztoku dihydrogenfosforečnanu draselného a potom 200 ml vody, suší bezvodým síranem sodným a odpaří za sníženého tlaku. Dostane se žlutý sirup, který se čistí chromatograficky za použití 90 g silikagelu a chloroformu a chloroformu s methanolem v poměru 60 : 1, jako rozpouštědla. Získá se 13,0 gramů titulní sloučeniny, kterou tvoří světle žlutá látka podobná sklu.

NMR (60 MHz, CDC13.) <S ppm:

1,0 — 1,23 (28H, m),

2.13 - 2,43 (3H, m, H4‘, H5‘),

3,93 — 4,10 (2H, m, Нб‘),

4,80 — 5,20 (2H, m, H1‘, Нз‘),

6,00 — 6,20 (H, m, H2‘), '

7,03 — 7,50 (5H, m),

7,78 (lH,s),

8.13 (1H, s,J;

s značí singlet, m značí multiplet.

Srovnávací příklad 3

Způsob syntézy 9-['(lR,3S,4R)-4-methyl-3,6-

- (tetraisopr opyldisiloxanyl) dioxycy klopentan-l-yl]hypoxanthinu ml bezvodého toluenu se přidá к 13,0 gramům (20 mmolů) sloučeniny získané ve srovnávacím příkladu 2, a potom se provede odpaření za sníženého tlaku. Odpairek se rozpustí ve 300 ml bezvodého toluenu a roztokem se probublává plynný dusík po dobu 20 minut. Po přidání 11 ml (40 mmolů) tributylcínhydridu se roztok zahřeje «na teplotu 80 °C a v patnáctiminutových interavlech se přidají 4 díly krystalického a,a‘-azobisisobutyronitrilu (AIBN) o celkové hmotnosti 820 mg. Po tříhodinovém zahřívání za míchání se rozpouštědlo odpaří za sníženého tlaku. Získaný olej se čistí chromatograficky na 80 g silikagelu za použití chloroformu a chloroformu s methanolem v poměru 60 : : 1 až 30 : 1, jako rozpouštědla. Dostane se

10,4 g sloučeniny uvedené v nadpisu, jako bezbarvé krystalické substance podobné sklu. Rekrystalizace části produktu z ethanolu poskytne bezbarvé jehličky o teplotě tání 200 až 202 °C.

NMR (60 MHz, CDC13) 5 ppm:

0,93 — 1,20 (28H, s),

1,97 — 2,53 (5H, m, Нг‘, Ш‘, Hs‘),

3,80 — 4,07 (2H, m, Нб‘),

4,43 — 5,27 (2H, m, H1‘, Нз‘),

7,87 (1H, s),

8,20 (1H, s).

Srovnávací příklad 4

Způsob syntézy 9-[ (lR,3S,4R)-4-

- (monomethoxytrityloxy) methyl-3-hydroxylcyklopenta-l~yl ] -

- (1-methoxymethylhypoxantinu)

9,8 g [19,8 mmolu) sloučeniny získané ve srovnávacím příkladu 3 se rozpustí ve 240 mililitrech bezvodého dioxanu. К roztoku se rychle přidá 880 mg (21,8 mmolu) natriumhydridu za míchání a chlazení ledem a potom se míchá po dobu 1,5 hodiny za teploty místnosti. Ke směsi za chlazení ledem se potom rychle přidají 2 ml (21,8 mmolu) methoxymethylchloridu. Vše se míchá za teploty místnosti 3 hodiny.

Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku a olejovitý odparek se rozpustí ve 200 ml chloroformu. Roztok se dvakrát promyje vždy 100 ml 0,1-molárního triethylamino-hydrogenuhličitanového (TEAB) pufru o pH 7,5 a potom 200 ml vody, suší bezvodým síranem sodným a odpaří za sníženého tlaku na sirup. Čištěním sirupu chromatograficky na C18 silikagelu (průměr 5,3 X 7,0 cm, rozpouštědlo: aceton a voda 55 % až 80 %) po8 skytne 8,5 g bezbarvé sloučeniny podobné sklu.

8,0 g této sloučeniny se rozpustí v 32 ml tetrahydrofuranu (THF), a přidá 10 g trihydrátu tetrabutylamoniumfluoridu (TBAF . . ЗН2О). Směs se míchá za teploty místnosti 0,5 hodiny, rozpouštědlo se oddestiluje za sníženého tlaku a zbývající olej se rozpustí ve 100 ml vody. Roztok se dvakrát promyje vždy 100 ml diethyletheru a zbaví tetrabutylamoniové soli působením pryskyřice Dowex-50 (pyridinová forma, 60 ml). Vytékající kapalina a 240 ml promývací vody se spojí a odpaří. Odparek se dehydratuje azeotropicky třemi podíly pyridinu. Odparek se rozpustí ve 100 ml pyridinu, přidá 5,4 g monomethoxytritylchloridu (MMTrCl) a směs se míchá za teploty 37 °C po dobu 4 hodin. Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku a olejovitý odparek se rozdělí mezi 50 ml 0,1-molárního triethylamin-hydrogenuhličitanového pufru a 100 ml chloroformu, organická vrstva se promyje 100 ml vody, suší bezvodým síranem sodným a odpaří za sníženého tlaku. Odparek se dehydratuje azeotropickou destilací a dostane se bezbarvý sirup. Frakce 0,1-molárního triethylamin-hydrogenuhličitanového pufru a promývací voda se spojí a odpaří, čímž se dostane nemonomethoxytritylovaná sloučenina. Tato sloučenina se čistí na 190 ml pryskyřice HP-20 za použití vody a 30% vodného ethanolu jako rozpouštědel a po odpaření a azeotropické destilaci s pyridinem se provede monomethoxytritylace a to stejným způsobem, jako je popsán svrchu. Oba takto získané podíly titulní sloučeniny se spojí a čistí chromatografií za použití 80 g silikagelu a směsi chloroformu s methanolem v poměru 100 : 1, 60 : 1 a 50 : 1 jak rozpouštědla, čímž se dostane 6,1 g bezbarvého produktu podobného sklu. Roztok části tohoto produktu v dichlormethanu poskytne bílý prášek, jestliže se přikape к n-hexanu.

NMR (60 HMz, CDC13) δ ppm:

1.87 — 2,70 (5H, m, Нг‘, Hí, Hs⁴),

3,20 — 3,40 (2H, m, He‘),

3,43 (3H, s, CH3OCH2),

3,80 (3H, s),

4,30 — 4,57 (1H, m, Нз‘),

4.87 — 5,10 (1H, m, Hi‘),

5,47 (2H, s, CH3OCH2—-N),

6.73 — 6,97 (2H, m),

7,17 — 7,53 (12H, m),

7.73 (1H, s),

7,98 [1H, s).

Srovnávací příklad 5

Způsob syntézy l-[ (lR,3S,4R)-4- (monoethoxytrityloxy) methyl-3-hydroxycyklopentan-l-yl ] - (4-karbamoyl-5-aminoimidazolu)

6,1 g (10,7 mmolu) sloučeniny získané ve srovnávacím příkladu 4 se rozpustí ve 490 mililitrech ethanolu a při zahřívání pod zpětným chladičem se rychle přidá 130 ml 5-molárního vodného roztoku hydroxidu sodného. V zahřívání pod zpětným chladičem se pokračuje 40 minut. Roztok se potom odpaří za sníženého tlaku. Olejovitý odparek se rozpustí ve 200 ml chloroformu, promyje dvakrát vždy 100 ml vody, potom dvakrát vždy 100 ml 0,1-molárního triethylamin-hydrogenuhličitanového pufru a dále 100 ml nasyceného vodného roztoku chloridu sodného, suší bezvodým síranem sodným a odpaří za sníženého tlaku na sirup. Čištěním tohoto sirupu chromatograficky na 90 gramů silikagelu za použití chloroformu s methanolem v poměru 100 : 1 až 20 : 1 jako rozpouštědla se dostane 3,2 g bezbarvého produktu podobného sklu. Roztok z části tohoto produktu v chloroformu, přikape-li se к n-pentanu za míchání, poskytne bílý prášek.

Elementární analýza pro C30H32N4O4.0,5НгО, molekulová hmotnost 521,616:

vypočteno:

69,08 % C, 6,38 % H, 10,74 % N, nalezeno:

69.14 % C, 6,09 % H, 10,54 % N.

NMR (100 MHz, CDC13) S ppm:

1,36 — 2,52 (5H, m),

3,00 — 3,40 (3H, m, Hg‘, OH),

3,77 (3H, s),

4,12 — 4,60 (2H, m, Hi‘, Нз‘),

4,80 — 5,28 (2H, široký s, NH2),

5,64 — 6,44 (2H, široký s, NH2),

6,76 — 6,94 (3H, m),

7.14 - 7,48 (12H, m).

Srovnávací příklad 6

Způsob syntézy l-[ (lR,3S,4R)-4- (monomethoxytrityloxy) methyl-3-hydroxycyklopentan-l-yl ] - [ 4-karbamoyl-5(N-benzoyl-S-methylisothiokarbamoylJaminoimidazolu]

0,88 g (1,7 mmolu) sloučeniny získané ve srovnávacím příkladu 5 se rozpustí ve 25 mililitrech bezvodého acetonu a při zahřívání pod zpětným chladičem se během 10 minut přikape roztok 260 μΐ (1,9 mmolu) benzoylisothiokyanátu v 8 ml acetonu a poté se pokračuje v zahřívání pod zpětným chladičem 50 minut. Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku a získaná světle žlutá látka podobná sklu se čistí na 15 g silikagelu chromatografií za použití směsi chloroformu s methanolem v poměru 50 : 1 až 30 : 1, jako rozpouštědla. Získá se světle žlutá sloučenina podobná sklu, o hmotnosti 0,87 g. К 0,84 g (1,2 mmolu) této sloučeniny se přidá malé množství acetonu a výsledný sirup se převede na homogenní roztok přídavkem

12,5 ml 0,2-normálního hydroxidu sodného a působením ultrazvuku. Poté se přidá 130 μΐ (1,4 mmolu) dimethylsulfátu za míchání a potom se v intenzívním míchání pokračuje za teploty místnosti 1 hodinu. Reakční směs se smíchá dvakrát vždy s 15 ml chloroformu к jejímu rozdělení, organická vrstva se třikrát promyje 15 ml 0,1-molárního triethylamin-hydrogenuhličitanového pufru, potom 20 ml nasyceného vodného roztoku chloridu sodného, suší bezvodým síranem sodným a odpaří za sníženého tlaku. Odparek se čistí chromatograficky na 15 g silikagelu za použití směsi chloroformu a methanolu v poměru 100 : 1 až 60 : 1 jako rozpouštědla. К získané látce podobné sklu se přidá malé množství dichlormethanu, směs se přikape do hexanu a výsledná sraženina se odstředí a suší, aby se dostalo 400 mg sloučeniny uvedené v nadpisu ve formě prášku.

Elementární analýza pro C39H39N5O5S, molekulová hmotnost 689,835:

vypočteno:

67,90 % C, 5,70 % H, 10,15 % N, nalezeno*

67,45 % C, 5,45 θ/ο H, 9,89 % N.

NMR (100 MHz, CDC13) 6 ppm:

I, 34 — 2,60 (5H, m),

2,52 (3H, s, SCH3),

3,04 — 3,44 (2H, m, Нб‘),

3.79 (3H, s, ОСНз),

4,08 — 4,44 (1H, m, Нз‘),

4,60 — 5,00 (1H, m, H1‘),

5,64 (1H, široký s, NH2),

6,72 — 6,94 (3H, m),

7,12 — 7,52 (15H, m),

7.80 — 7,96 (2H, m),

II, 35 (1H, široký s, NH).

Srovnávací příklad 7

Způsob syntézy 9-[ (lR,3S,4R)-4-monomethoxytrityloxymethyl-3-hydroxycyklopentan-l-yl ] guaninu

360 mg (0,53 mmolu) sloučeniny získané ve srovnávacím příkladě 6 se vnese do 18 mililitrů horkého 6-normálního roztoku hydroxidu sodného a směs se zahřívá pod zpětným chladičem 1 hodinu. Produkt se extrahuje z reakční směsi chloroformem, extrakt se promyje 30 ml 0,1-molárního triethylamin-hydrogenuhličitanového pufru a potom 30 ml nasyceného vodného roztoku chloridu sodného, suší bezvodým síranem sodným a podrobí chromatografií na 8 g silikagelu za použití směsi chloroformu s methanolem v poměru 40 : 1 až 6 : 1, jako rozpouštědla. К takto získané substanci podobné sklu se přidá malé množství acetonu, směs se přikape к benzenu a výsledná sraženina se odstředí и

a suší. Získá se 210 mg sloučeniny pojmenované v nadpisu, jako prášek.

Elementární analýza pro C31H31N5O4 . 1.0H2O, molekulová hmotnost 555,633:

vypočteno:

67,01 % C, 5,99 % H, 12,60 % N, пд1р7РпП‘

67,01 % C, 5,69 % H, 12,42 % N,

NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ ppm:

1,50 — 2,60 (5H, m),

3,01 (2H, široký s),

3,98 — 4,20 (1H, m),

4,70 — 4,96 (2H, m),

6,37 (2H, široký s, NH2),

6,82 — 7,46 (14H, m),

7,68 (1H, s, Ha),

10,60 (1H, široký s, NH).

Srovnávací příklad 8

Způsob syntézy 9-[ (lR,3S,4R)-4-hydroxymethyl-3-hydroxycyklopentan-l-ýl]guaninu

180 mg (0,33 mmolu) sloučeniny získané ve srovnávacím příkladu 7 se rozpustí v 10 mililitrech 80% kyseliny octové a roztok se míchá za teploty 40 °C po dobu 4,5 hodiny. Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku a dále se provede dvojí azeotropická destilace s vodou. Poté se přidá 10 ml vody, směs se dvakrát promyje vždy 10 ml etheru a voda se odpaří za sníženého tlaku. Získá se tak 41 mg bezbarvých krystalů tvořených sloučeninou uvedenou v nadpisu, o teplotě tání 246 až 248 °C.

[a]o²⁵ = +7,7° (C=O, 5, dimethylformamid).

(nm): (H2O); 255, 278 (přehyb), (H⁺); 257, 282, (OH^-); 256 (přehyb), 273.

Elementární analýza pro CnHisNsOs . 0,5 H2O . 0,1 C2H5OH, molekulová hmotnost 278,886:

vypočteno:

48,24 % C, 6,00 % H, 25,11 % N, nalezeno ·

48,61 % C, 6,41 θ/ο H, 25,40 % N.

Příklad 1

Způsob výroby N⁶-benzoyl-6‘-O-

- (4,4‘-dimethoxytrityl) -3‘-O-

- [ (imidazol-l-yí) -thiokarbonyl ] -2‘-deoxyaristeromycinu

2,5 g N⁶-benzoyl-6'-O- ( 4,4‘-dimethoxytrityl)-2‘-deoxyaristeromycinu se rozpustí v 10 mililitrech suchého dichlormethanu, poté se přidá 8,0 g thiokarbonyldiimidazolu a míchá za teploty místnosti 20 hodin. Reakční směs se odpaří do sucha a čistí chromatografický na 50 g silikagelu (Kieselgel 60, Merck Co.) za použití ethylacetátu jako rozpouštědla. Dostane se světle žlutá sklovitá látka ve výtěžku 2,2 g.

NMR (90 MHz, CDC13) δ ppm:

3,80 (6H, s, 2CH3O—),

8,35 (1H, s, Ha),

8,76 (1H, s, H2).

Příklad 2

Způsob výroby №-benzoyl-6‘-0- (4,4‘-dimeth oxytrityl) -2‘,3‘-dideoxyaristeromyclinu

2,0 g 3‘-thiokarbonylového derivátu získaného v příkladu 1 se rozpustí ve 20 ml vysušeného dioxanu a poté se přikape roztok

4,5 g tributylstamanu v 10 ml vysušeného dioxanu při zahřívání pod zpětným chladičem. Mezitím se pomalu přidá 500 mg krystalů a,a‘-azobisisobutylnitrilu. Přidávání po kapkách se ukončí za 20 minut a v zahřívání pod zpětným chladičem se pokračuje další 2 hodiny. Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku a olejovitý odparek se čistí na 40 g silikagelu chromatografický za použití chloroformu, jako rozpouštědla. Dostane se 1,1 g bezbarvého prášku.

NMR (90 MHz, CDC13) δ ppm:

3.80 (6H, s, 2СНзО—),

4.80 — 5,20 (1H, m, H1‘),

3,15 (2H, d, 2Нб‘),

8,76 (1H, s, H2), •9,10 (1H, s, —NH—C—).

II o

Příklad 3

Způsob výroby 2‘,3‘-dideoxyaristeromycinu

1,0 g sloučeniny získané v příkladu 2 se rozpustí v malém množství pyridinu, poté se přidá 50 ml koncentrovaného vodního amoniaku a zahřívá se v tlakové zkušební trubici za teploty 60 °C po dobu 5 hodin. Reakční směs se odpaří do sucha, přidá 100 ml 80% kyseliny octové, zahřívá na teplotu 60 °C po dobu 2 hodím a potom se odpaří do sucha za sníženého tlaku. Odparek se rozpustí ve 100 ml vody a dvakrát promyje vodou. Vodná vrstva se odpaří do sucha a odparek se rozmělní na prach v etheru. Získá se 0,23 g 2^í,3^Ldideoxyaristeromycínu.

1120

UV A_nia_x (nm); 260.

Elementární analýza pro CnHisNsO—H2O, molekulová hmotnost 251,29:

vypočteno:

52,57 «/o C, 6,82 % H, 27,87 % N, nalezeno:

52,83 % C, 6,95 % H, 27,54 % N.

2‘,3‘-dideoxyaristeromycin takto získaný se rozpustí v 1-normální kyselině chlorovodíkové o ekvivalentní hmotnosti. Po odpaření se к roztoku přidá ethanol a roztok se odpaří dosucha. Tento postup se několikrát opakuje. Odparek se rekrystaluje z horkého ethanolu a získají se krystaly hydrochloridu, jako soli o teplotě tání 173 až 175 °C.

Elementární analýza, pro CixHisNsO . HC1 . . ^гНгО, molekulová hmotnost 278,73:

vypočteno:

47,40 % C, 6,15 % H, 25,12 % N,

12,72 % Cl, nalezeno ·

47,98 % C, 6,06 % H, 24,87 % N,

12,71 % Cl.

[a]_D ²⁵ ₌ _₆₎₇₉ (c=O, 61, voda).

Příklad 4

2,5 g sloučeniny získané ve srovnávacím příkladu 8 se zpracuje stejným způsobem, jako je uvedeno v příkladech 1, 2 a 3, čímž se dostane krystalický prášek 9-[(lS,4R)-4-hydroxymethylcyklopentan-l-yljguaninu o hmotnosti 0,3 g, teplota tání 269 °C.

pH2

UV Л_шях (nm): 255,280 (přehyb);

H20

UV A_ma_x (nm): 253,270 (přehyb);

pH10

UV_max (nm): 258 (přehyb], 270.

Elementární analýza pro C11H15O2N5, molekulová hmotnost 249,27:

vypočteno:

53,00 % c, 6,07 % H, 28,10 % N, nalezeno:

52,81 % C, 5,86 O/o H, 27,83 % N.

[a] o²⁵ = —4,74 (C=O, 57, dimethylformamid).

9- [ (1S,4R )-4-hydroxymethylcyklopentan-l-yl]-hypoxanthin .se dostane, když se hypoxanthinový derivát na místo №-benzoyl-6‘-O- (4,4‘-dimethoxytrityl)-3‘-O-[ (imidazol-l-yl)-thiokarbonyl]-2‘-deoxyaristeromycinu v příkladu 1 zpracuje stejným postupem, jako je uveden v příkladech 1 až 3.

Elementární analýza pro C11H14N4O2, molekulová hmotnost 234,25:

vypočteno:

56,40 0/0 C, 6,02 % H, 23,92 % N, nalezeno:

56,81 % C, 6,33 % H, 24,25 % N.

Příklad 5

Způsob výroby 9-[ (lS,4R)-4-hydroxymethylcyklopentan-l-yl]guaninu

1. Způsob syntézy 9-[ (lR,3S,4R)-4-

-hydroxyméthyl-3-hydroxyeyklopentan-l-yl]hypoxanthinu

12,4 g (20 mmolů) sloučeniny získané ve srovnávacím příkladu 3 se rozpustí ve 200 mililitrech toluenu, ke směsi se přidá 10,46 gramu (40 mmolů) tetrabutylamoniumfluoridu a vše se potom zahřívá na teplotu 75 °C po dobu 2 hodin. Reakční roztok se odpaří do sucha a odparek rozpustí ve vodě. Roztok se zbaví soli zpracováním se 30 g aktivního uhlí a surový produkt se rekrystaluje ze směsi methanolu a ethyletheru. Dostane se 4,6 g bezbarvých krystalů o teplotě tání 170 °C.

Elementární analýza pro C11H14N4O3 . H2O, molekulová hmotnost 268,27:

vypočteno:

49,25 % C, 6,01 % H, 20,88 % N,

Π3.16ΖθΠ0’

49,08 % C, 5,86 % H, 20,81 % N.

2. Způsob syntézy 9-[ (lR,3S,4R)-4-monomethoxytrityloxymethyl-3-hydroxylcyklopentan-l-yl ] hypoxanthinu

2,3 g (9,2 mmolů) krystalické sloučeniny získané metodou 1 popsanou výše se rozpustí ve 100 ml pyridinu, potom se přidá 3,1 gramu (10 mmolů) monomethoxytritylchloridu a poté se vše míchá za teploty místnosti po dobu 5 hodin. Reakční směs se čistí chromatograficky na 80 g silikagelu za použití směsi chloroformu s methanolem v poměru 40 : 1 až 6 : 1, jako rozpouštědla. Ve formě prášku se získá 4,3 g požadovaného produktu. Část tohoto produktu se rekrystaluje ze směsi chloroformu a etheru. Krystaly mají teplotu tání 244 až 246 °C.

Elementární analýza pro C31H30N4O4 . H2O, molekulová hmotnost 531,60:

vypočteno:

70,04 % C, 5,88 % H, 10,54 % N, nalezeno:

70,39 % C, 5,77 % H, 10,38 % N.

3. Způsob syntézy 9-[(lS,4R)-4-monomethoxytrityioxymethylcyklopentan-l-yl ] hypoxanthinu

4,32 g (8,27 mmolů) sloučeniny získané metodou 2 popsanou výše se rozpustí v 70 mililitrech toluenu, potom se přidá 2,2 g (12,4 mmolů) thiokarbonyldiimidazolu a vše se smíchá za teploty místnosti 5 hodin. Reakční roztok se odpaří dosucha a odparek čistí chromatografií na 80 g silikagelu za použití směsi chloroformu a methanolu v poměru 100 : 1 až 60 : 1, jako rozpouštědla. Získá se 5,2 g světle žlutého prášku. Takto získaný produkt se rozpouští v 90 ml toluenu a nechá reagovat s 3,4 ml (12,4 mmolů) tributylstannanu a 270 mg (1,6 mmolů) α,α¹-azobisisobutylonitrilu stejnou metodou, jako je popsána ve srovnávacím příkladu 3 a potom se čistí chromatograficky na 100 g silikagelu za použití směsi ethylacetátu a methanolu v poměru 9 : 1, jako rozpouštědla. Získá se 1,63 g požadovaného produktu. Část tohoto produktu se rekrystaluje ze směsi methanolu a ethylacetátu. Krystaly mají teplotu tání 175 až 177 °C.

Elementární analýza pro C31H30N4O5 . V2H2O, molekulová hmotnost 515,60:

vypočteno:

72,71 % C, 6,06 % H, 10,87 % N, nalezen o *

72,69 % C, 5,88 % H, 10,92 % N.

4. Způsob syntézy 9-[ (1S,4R)-4-hydroxymethylcyklopentan-l-yl]guaninu

Požadovaná sloučenina se může vyrobit podobnými postupy jako jsou popsány ve srovnávacích příkladech 4 až 8 za použití sloučeniny získané ve stupni 3 popsaném výše.

Příklad 6

Tablety pro orální podávání protivirového prostředku podle tohoto vynálezu se připravují například takto:

V methanolu se smíchá 200 mg 2‘,3‘-dideoxyaristromycinu, 300 mg laktózy, 50 mg škrobu a 2 mg hořečnaté soli kyseliny stearové, potom se působením tepla odstraní methanol a směs se odlévá do tablet.

Příklad 7

Injekce s protivirovým prostředkem se připravují například takto:

500 mg 2‘,3‘-dideoxyaristeromycinu se rozpustí v 10 ml sterilizované vody a vodným hydroxidem sodným se upraví na hodnotu pH 6,0. Roztok se filtruje sterilním filtrem a uzavře do lahvičky.

Příklad testu 1

Materiály a metody (Antimicrob. Agents Chemother, 30, č. 6, prosinec 1986, 933 až 937).

Buňky: Při této studii se použilo řady buněk nesoucích HTLV typ I, MT-4 a řady buněk produkujících HIV_HTLV-nb Molt 4/ /HIVhtlv-ш· Buňky se udržovaly v prostředí RPMI 1640 s přídavkem 10 % fetálního telecího séra, 100 in. j. penicilinu na mililitr a 100 (Ug streptomycinu na mililitr při teplotě 37 ³C v inkubátoru pod atmosférou oxidu uhličitého.

Virus a virová infekce: HIV_HTlv iu se získává ze supernatantů kultury Molt-4/HIV_nTLv-in> jak již bylo popsáno [Virology 146, 272 (1985)]. Titr tohoto virového přípravku činí 6 X 10⁴ PFU/ml. Infikování MT-4 buněk s HIVhtlvui se provádí několikanásobně z 0,002 infekce. V krátkosti uvedeno, buňky se smíchají s roztokem viru a inkubují za teploty 37 °C po dobu 1 hodiny. Po adsorpci se infikované buňky promyjí a resuspendují v čerstvém prostředí na koncentraci 3 X 10⁵buněk na mililitr. Tato koncentrace se kultivuje jak v přítomnosti, tak nepřítomnosti karbocyklických 2^<,3^í-dideoxynukleosidů o různých koncentracích v inkubátoru pod oxidem uhličitým za teploty 37 °C během 6 dnů.

Zkouška cytopatického účinku indukovaného HIVhtlv-ш- Cytopatický účinek indukovaný HIVhtlv-jh se analyzuje stanovením 0nemocnění v řadě životaschopných buněk. Životaschopné buňky se spočítají při použití metody založené na barvení vylučováním trypanové modři.

Zkouška vyjádření antigenu HIV_IÍTlv-11Γ· Buňky MT-4 infikované HTLV-III s virovými specifickými antigeny se počítají nepřímou [imunofluorescenční (IF) ] metodou. Krátce popsáno, buňky fixované methanolem se inkubují se zředěným anti-HIV_HTLV ш pozitivním humánním sérem za teploty 37 °C po dobu 30 minut. Preparáty se potom promývají po dobu 15 minut fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem. Buňky se poté inkubují s králičím anti-humánním imunoglobulinem G konjugovaným s fluoresceinisothiokyanátem (Dakoppatts A/S, Kodaň, Dánsko) za teploty 37 °C po dobu 30 minut a opět se promyjí fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem. Pod fluorescenčním mikroskopem se odpočítá více než 500 buněk a počítá se procento IF-pozitivních buněk.

Zkouška uvedená výše potvrzuje, že sloučeniny podle tohoto vynálezu mají cenný účinek proti HIVhtlv-iii· V případě 2‘,3‘-dideoxyaristeromycinu je účinná koncentrace 50 až 100 ,uM. Zjišťuje se cytotoxicita 500 až

Claims

Způsob výroby karbocyklických purinových nukleosidů obecného vzorce I (I) kde

R znamená hydroxyskupinu popřípadě chráněnou moinomethoxytritylovou nebo dimethoxytritylovou skupinou a

Y znamená adenin-9-yl, hypoxanthin-9-yl nebo guanin-9-yl popřípadě chráněný benzoylovou isobutyrylovou nebo acetylovou skupinou, a jejích farmaceutických přijatelných solí, vyznačující se tím, že se sloučenina obecného vzorce II kde

R a Y mají výše uvedený význam a buď Rt, nebo R2 znamená hydroxyskupinu a druhý z těchto substituentu znamená vodík, thiokarbonyluje, poté se provede redukce tritylcínhydridem v přítomnosti α,α'-azobisisobutylonitrilu pro deoxidaci v poloze 2* nebo 3‘, a popřípadě se odstraní všechny chránící skupiny z R a Y a popřípadě se připravené sloučeniny převedou na své farmaceuticky přijatelné soli.