Vynález se týká stabilizovaného činidla ke stanovení katalytické koncentrace alaninaminotransferasy.

«

Stanovení katalytické koncentrace alaninaminotransferasy (L-alanin: 2-oxoglutarátaminotransferasa EC 2.6.1.2.) v krevním séru nebo plazmě j,e velmi rozšířenou analýzou, umožňující značné zpřesnění diferenciální diagnostiky jaterních a srdečních chorob. Stanovení katalytické koncentrace alaninaminotransferasy je jednou ze základních analýz prováděných v klinické biochemii.

Katalytická koncentrace L-alaninaminotransferasy se stále častěji určuje pomocí spřažených enzymových reakcí. V současné době se připraví činidlo na stanovení katalytické koncentrace alaninaminotransferasy tak, že se k pufru obsahujícímu L-alanin a pyridoxal-5-fosfát přidá indikátorový enzym laktátdehydrogenasa a jeho substrát nikotinamidadenindinukleotid. Tento roztok je.stabilní v temnu při teplotě +4 °C 2 až 3 dny. Nízká stabilita zásobního roztoku je ekonomicky značně nevýhodná pro menší pracoviště a pro použití automatických analyzátorů, které pracují s velmi malými objemy pracovních činidel, a proto v tak krátké době nemohou zpracovat celý objem pracovních roztoků, které jsou připravovány z komerčně dostupných diagnostických souprav. Prodloužení stability připravovaných roztoků zmražením, které je velmi hojně užíváno, nelze v tomto případě použít, protože při zmražení dochází k poškození indikátorového enzymu laktátdehydrogenasy, a tím i k poklesu její katalytické aktivity. Stálost činidla pro stanovení katalytické koncentrace alaninaminotransferasy lze sice zvýšit přídavkem albuminu, který působí jako ochranné médium, ale jen asi na 5 až 6 dnů.

Stabilita zásobních roztoků může být několikanásobně prodloužena, přidájí-li se do roztoku látky, které ochrání enzymy

263 028 před jejich poškozením a antioxidanty zamezující nežádoucí oxidaci nikotinamidadenindinukleotidu. Mnohé entioxidanty, jako je například propylgalát, ethylenglykol a kyselina askorbové^ hojně užívané v potravinářství a farmacii, mají nepříznivý vliv na katalytickou koncentraci indikátorového enzymu, laktátdehydrogenasy. Proto je Žádoucí nalézt takovou novou látku, která potlačí oxidaci nikotinamidadenindinukleotidu a zvýší tím použití činidla pro stanovení katalytické koncentrace ALT a zároveň nebude mít nepříznivý vliv na katalytickou koncentraci enzymů. Zmíněné nedostatky výrazně potlačuje stabilizované činidlo na stanovení katalytické koncentrace alaninaminotransferas podle vynálezu. Jeho — 1 —1 podstata spočívá v tom, že obsahuje 0,5 /umol.l až 10,0 /umol.l kyseliny citrónové a 0,5 až 10 g.l”¹ albuminu.

Činidlo s kyselinou citrónovou a albuminem má následující přednosti. Albumin v kombinaci s kyselinou citrónovou zvyšuje, ve srovnání s činidlem stabilizovaným jen albuminem, stálost činidla pro stanovení katalytické koncentrace alaninaminotransferasy z původních 5 až 6 dnů až na 10 dnů. Jedná se tedy o specifický vyšší účinek albuminu a kyseliny citrónové zejména na nikotinamid ad enindinukleotid, projevující se prodloužením stálosti činidla pro katalytickou koncentraci alaninaminotransferasy až na dvojnásobek, ve srovnání s činidlem stabilizovaným samotným albuminem. Je třeba dodržet rozsah koncentrací albuminu a kyseliny citrónové uvedený v definici vynálezu, neboí vyšší koncentrace kyseliny citrónové negativně ovlivní stanovení katalytické koncentrace alaninaminotransferasy. Albumin a kyselina citrónová jsou přitom kompatibilní s analytickými systémy nejčastěji užívanými pro stanovení katalytické koncentrace alaninaminotransferasy, na rozdíl od jiných ochranných systémů.

Uvedeným poměrně velmi jednoduchým způsobem lze podstatně zvýšit stálost pracovního roztoku pro stanovení katalytické koncentrace alaninaminotransferasy tak, aby byl použitelný po dobu nezbytnou a výhodnou pro různé typy zdravotnických laboratoří.

«Μ «Β

Příklad 1

263 028

Κ 1 litru pufru obsahujícímu 0,120 mol tris(hydroximethyl)-aminomethan a 0,480 mol l-alanin se přidá 0,5 /umol kyseliny citrónové. pH pufru je nastaveno na hodnotu 7,6. K pevné enzymové směsi obsahující 0,216 mmol nikotinamidadenindinukleotid a 36 /Ukat laktátdehydrogenasa se přidá 10 g hovězího albuminu.

Po smíchání obou komponent se získá stabilizované činidlo pro stanovení katalytické koncentrace alaninaminotransferasy. Činidlo je stálé minimálně 10 dní.

Příklad 2

K enzymové směsi obsahující 0,216 mmol nikotinamidadenindinukleotid a 36 /Ukat laktátdehydrogenasa se přidá 5 ^umol kyselina citrónová a 0,5 g hovězího albuminu. Po smíchání enzymové směsi s 1 1 pufru o složení 0,120 mol tris(hydroximethyl)-aminomethan a 0,480 mol L-alanin a 0,120 mmol pyridoxal-5-fosfát, jehož pH je nastaveno na hodnotu 7,6*se získá stabilizované činidlo pro stanovení katalytické koncentrace alaninaminotransferasy. Činidlo je stálé minimálně 10 dní.

Příklad 3

K 1 ml stabilizovaného činidla na stanovení katalytické koncentrace alaninaminotransferasy obsahující 120 mmol.l“¹ trisfhydroximethyD-aminomethan, 480 mmol.1 l-alanin, 0,12 mmol.1 pyridoxal-5-fosfát, 0,216 mraol.l“*¹ nikotinamidadenindinukleotid, /Ukat.l*¹ laktátdehydrogenasa, 0,5 /umol.l*¹ kyselina citrónová a 10,0 g.l~¹ hovězího albuminu o pH 7,6 připraveného podle příkladu 1 se přidá 0,1 ml analyzovaného séra. Po desetiminutové preinkubaci při 30 °C je enzymová reakce nastartována přídavkem 0,1 mol kyseliny 2-oxoglutarové o koncentraci 165 mmol.1”¹. Zaznamenává se změna absorbance při 340 : nm za Časovou jednotku při teplotě 30 °C.