CS259996B1 - Způsob enzymová výroby 6-amlnopenioilánové kyseliny z fenoxymethylpenicilinu stabilizovanými buňkami . kvasinek - Google Patents
Způsob enzymová výroby 6-amlnopenioilánové kyseliny z fenoxymethylpenicilinu stabilizovanými buňkami . kvasinek Download PDFInfo
- Publication number
- CS259996B1 CS259996B1 CS873060A CS306087A CS259996B1 CS 259996 B1 CS259996 B1 CS 259996B1 CS 873060 A CS873060 A CS 873060A CS 306087 A CS306087 A CS 306087A CS 259996 B1 CS259996 B1 CS 259996B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- suspension
- stabilized
- yeast
- acid
- phenoxymethylpenicillin
- Prior art date
Links
- BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N phenoxymethylpenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)COC1=CC=CC=C1 BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 239000002253 acid Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims description 37
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims description 37
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 31
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 41
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 39
- 229930195708 Penicillin V Natural products 0.000 claims abstract description 24
- 229940056367 penicillin v Drugs 0.000 claims abstract description 24
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 16
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 12
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 11
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 40
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 34
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 30
- LCPDWSOZIOUXRV-UHFFFAOYSA-N phenoxyacetic acid Chemical compound OC(=O)COC1=CC=CC=C1 LCPDWSOZIOUXRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 claims description 10
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 10
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- 241000694959 Cryptococcus sp. Species 0.000 claims description 3
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical class [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 claims description 3
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 claims description 3
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011591 potassium Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 claims description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 claims description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 1
- 150000001991 dicarboxylic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 7
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 abstract description 4
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 2
- ZZKAAWZQFPDZDW-UHFFFAOYSA-N 1-(phenoxymethyl)piperidine Chemical compound C1CCCCN1COC1=CC=CC=C1 ZZKAAWZQFPDZDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 239000003518 caustics Substances 0.000 abstract 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 10
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 description 9
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 9
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 8
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 8
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 6
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 5
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 4
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 4
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 3
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 3
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940008309 acetone / ethanol Drugs 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000005422 blasting Methods 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 210000003298 dental enamel Anatomy 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 2
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 2
- WLJVXDMOQOGPHL-PPJXEINESA-N 2-phenylacetic acid Chemical compound O[14C](=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-PPJXEINESA-N 0.000 description 1
- XMIIGOLPHOKFCH-UHFFFAOYSA-N 3-phenylpropionic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=CC=C1 XMIIGOLPHOKFCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGNGWHSBYQYVRX-UHFFFAOYSA-N 4-(dimethylamino)benzaldehyde Chemical compound CN(C)C1=CC=C(C=O)C=C1 BGNGWHSBYQYVRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000531 Amidohydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004092 Amidohydrolases Human genes 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 238000012366 Fed-batch cultivation Methods 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000010425 asbestos Substances 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000011437 continuous method Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002360 explosive Substances 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000002706 hydrostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 229910052895 riebeckite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000028016 temperature homeostasis Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Řešení se týká způsobu výroby 6-aminopenioilánová
kyseliny (6-APK) z fenoxymethylpe0iollinu
(V-penloilin) stabilizovanými
buňkami kvasinek, které íe vyznačeno
tím, že se enzymová hydrolýza provádí suspenzí
kvasinek obsahujíoích V-peniollin
amidázu, zejména suspenzi buněk kvasinky
Cryptooooous sp. CCY 17-22-1, předem chemimioky
stabilizovaných působením blfunkčního
činidla jako jsou dialdehydy dikarboxylovýoh
kyselin, s výhodou působením glutaraldehydu,
a předem vypraných roztoky anorganických
solí silných kyselin a/nebo zásad,
s výhodou síranem amonným, a s použitím
roztoku fenoxymethylpenicilinu v koncentraci
1 až 10 'fe, s výhodou 4 až 7 % hmota/objem,
při pH 7,0 a 8.5, s výhodou 8,0. při teplotě
10 až 45 °C, s výhodou 37 C, v míchaném
reaktoru a po ukončené hydrolyze a ochlazení
reakční směsi na teplotu 0 až 5 °C
se suspenze stabilizovaných a vypraných
kvasinek oddělí a použije k hydrolýze čerstvé
násady roztoku fenoxymethylpenicilinu
a ze supernatantu, popřípadě z matečného
louhu se po úpravě pH a teploty izoluje
6-amlnopenioliánová kyselina, popřípadě
regeneruje fenoxyootová kyselina, přičemž
se enzymová hydrolýza fenoxymethylpenicillnu
a izolace 6-amlnopenioilánové kyseliny,
popřípadě regenerace fenoxyootová kyseliny
alespoň dvakrát opakuje.
Description
Vynález se týká enzymové výroby 6-aminopenicilánové kyseliny z fenoxymethylpenicilinu stabilizovanými buňkami kvasinek.
6-aminopenicilánová kyselina (dále jen 6-APK) slouží jako meziprodukt farmaceutické výroby pro přípravu tzv. polosyntetických penicilinů, zejména ampicilinu. 6-APK lze připravit bud chemicky, nebo enzymově. Enzymová příprava 6-APK je však ekonomicky podstatně výhodnější. Pro její výrobu se u řady farmaceutických firem jako výchozí suroviny používá tzv. přírodních penicilinů, G-penicilinu (benzylpenicilinu) nebo V-penicilinu (fenoxymethylpenicilinu) za.použití G- nebo V-penicilinamidáz (penicilinacyláz), které jsou do určité míry substrátově specifické, podle typu postranního řetězce přírodních penicilinů (N-fenylacetyl-resp. N-fenoxyacetyl-6-APK). Zdrojem těchto enzymů jsou obvykle mikrobiální buňky, zejména bakterie,imperfektní houby,(plísně) a některé druhy vyšších hub (basidiomycety).
Většina farmaceutických firem využívá pro enzymovou výrobu 6-APK především benzylpenicilin jako substrát za použití bud nativních (intaktních) ve většině případů bakteriálních buněk z rodu Escherichia nebo Próteus, popřípadě rozpustného, výhodněji imobilizovaného enzymu, předem izolovaného z produkčních, vysoce aktivních bakteriálních kmenů.
V československém farmaceutickém průmyslu je využíván tzv. semikontinuální způsob enzymové výroby 6-APK z benzylpenicilinu na bázi chemicky stabilizovaných individuálních buněk bakterií Escherichia coli podle čs. autorského osvědčení č. 201 621.
Citovaný způsob spočívá v tom, že bakteriální buňky Ei coli se oddělí po jejich kultivaci ve fermentačním tanku na zahušťovacích odstředivkách, nakoncentrovaná vodná suspenze bakteriálních buněk se stabilizuje glutaraldehydem, suspenze se promyje vodou a stabilizované buňky se permeabilizují v prostředí chloridu ' sodného v přítomnosti vhodného,tenžidu, načež se promytá vodná 2599.96
-2suspenze obsahující individuálně zesítěné a permeabilizované buňky uvede ve styk s draselnou nebo sodnou solí benzylpenicilinu (G-penicilinu) v míchaném reaktoru a po ukončení enzymové hydrolýzy se suspenze stabilizovaných buněk oddělí odstředěním na zahuštovacích odstředivkách a ze supernatantu se izoluje 6-APK popřípadě regeneruje fenyloctová kyselina. Oddělená, nakoncentrovaná vodná suspenze stabilizovaných bakteriálních buněk, obsahující část reakční směsi z předchozího cyklu použití, je opět přečerpána zpět do reaktoru, zředěna vodou, přidán další díl nové násady G-penicilinu a opět zahájen další cyklus enzymové hydrolýzy.
Použití tohoto suspenzního biokatalyzátoru je však omezeno “ pouze na výrobu 6-APK z benzylpenicilinu (G-penicilinu). Druhý typ přírodního penicilinu, fenoxymethylpenicilin (V-peniciliň), který je rovněž v Československu vyráběn, však jako surovinu pro výrobu 6-APK nelze využít, nebot substrátová specifita penicilínamidázy z E. coli je více než řádově posunuta ve prospěch hydrolýzy benzylpenicilinu.
Fenoxymethylpenicilin (dále jen V-penicilin) má oproti benzylpenicilinu (dále jen G-penicilin) řadu výhod, které spočí-; vají zejména ve vyšší stabilitě 3-laktamového kruhu tohoto přírodního antibiotika ve vodných roztocích v závislosti na pH a teplotě. Z těchto důvodů lze V-penicilin v humánní a veterinární medicíně aplikovat perorálně na rozdíl od výhradní perenterální opakované aplikace G-penicilinu. Z toho pro výrobu 6-APK vyplývá další výhoda, a to je podstatně nižší přítomnost degradačních produktů V-penicilinu, zejména fenoxymethylpenicilánové kyseliny a z toho rezultující lepší kvalita 6-APK a vyšší výtěžek v izolaci. Další výhodou výroby 6-APK z V-penicilinu je i skutečnost, že druhý produkt enzymové hydrolýzy, fenoxyoctová kyselina, má podstatně nižší odór (podstatně méně páchne) ve srovnání s fenyloctovou kyselinou, což při velkokapacitní výrobě 6-APK není zanedbatelný společenský a pracovní faktor.
V čs. autorských osvědčeních č. 240 247 a č. 250 495 je popsán způsob selekce mikroorganismů, zejména kvasinek a vysokoprodukční mutantní kmen kvasinky Cryptococcus sp. CCY 17-22-1, včetně způsobu jeho submersní’ fed-batch kultivace ve fermentačhím tanku s vysokou aktivitou V-penicilinamidázy, která hydrolyzuje pouze pouze V-penicilin a p-hydroxy-V-penicilin, zatímco G-penicilin nebo ampicilin není hydrolyzován vůbec. Existence tohoto kmene a způsobu výroby enzymově aktivní biomasy tohoto 259996
-3kmene kvasinky a průkaz o nepathogenitě tohoto kmene na základě hygienicko-epidemiologické expertízy umožňuje navrhnout řešení technologie enzymové výroby 6-APK z V-penicilinu pomocí stabilizovaných buněk.
Způsob enzymové výroby 6-aminopenicilánové kyseiny z fenoxymethylpenicilinu stabilizovanými buňkami kvasinek podle předmětné ho vynálezu je vyznačen tím, že se enzymová hydrolýza provádí suspenzí kvasinek obsahujících enzym V-penicilinamidázu, zejména suspenzí buněk kvasinky Cryptococcus sp. CCY 17-22-1, předem chemicky stabilizovaných působením bifunkčního činidlat jako jsou dialdehydy dikarboxylových kyselin, s výhodou působením glutaraldehydu, a předem vypraných roztoky anorganických solí silných kyselin a/nebo zásad, s výhodou síranem amonným, a s použitím roztoku fenoxymethylpenicilinu v koncentraci 1,0 až 10 % hmota/ob jem, s výhodou 4 až 7 % hmota/objem, při pH 7,0 až 8,5, s výhodou 8,0 při teplotě 10 až 45 *C, s výhodou 37 *C v míchaném reaktoru a po ukončené hydrolýze a ochlazení reakční směsi na teplotu 0 až 5 ‘C se suspenze stabilizovaných a vypraných kvasinek oddělí a použije k hydrolýze čerstvé násady roztoku fenoxymethylpenicilinu a ze supernatantu, popřípadě z matečného louhu se po úpravě pH a teploty izoluje 6-aminopenicilánová kyselina, popřípadě regeneruje fenoxyoctová kyselina, přičemž se enzymová hydrolýza fenoxymethylpenicilinu a izolace 6-aminopenicilánové kyseliny, popřípadě regenerace fenoxyoctové kyseliny^ alespoň dvakrát opakuje.
Ke způsobu výroby podle předmětného vynálezu lze použít roztok fenoxymethylpenicilinu ve formě kyseliny, získaného při zpracování vyfermentované živné půdy po ukončené kultivaci, nebo meziproduktů získaných z různých fází izolace a čištěni fenoxymethylpenicilinu.
Stabilizace vodné suspenze kvasinek a jejich praní podle předmětného vynálezu se provádí za míchání při teplotách 10 až 40 *C v rozmezí koncentrací glutaraldehydu 0,5 až 10 % objem/objem, výhodně 2 % objem/objem, při koncentraci buněk 1 až 15 % hmota/objem sušiny, s výhodou 10 % hmota/objem sušiny buněk po dobu 0,5 až 5 hodin, výhodně'3 hodiny, načež se suspenze stabilizovaných kvasinek zředí vodou, buňky se oddělí, znovu suspendují ve vodě a za míchání ošetří vnášením pevného síranu amonného v rozmezí jeho koncentrací ve vodné suspenzi 0,1 až ( 5,0 mol . litr1, výhodně 2,0 mol . litr1, po dobu 1 až 10 ho259996
-4din, výhodně 2 hodiny, suspenze se zředí vodou, kvasinky se oddělí a alespoň dvakrát promyjí vodou.
Ke -způsobu výroby podle předmětného vynálezů lze kromě technických forem fenoxymethylpenicilinu použít i roztoky čistého fenoxymethylpeniciíinu ve formě amonné, draselné nebo sodné soli.
Přechovávání, skladování a transport stabilizovaných vypraných a promytých kvasinek před jejich použitím se podle předmětného vynálezu provádí tak, že se bud přechovává vodná suspenze buněk v chlazeném zásobníku při teplotách v rozmezí 1 až 30 *C, výhodně 5 až 15 *C, nebo se tato zahuštěná suspenze za míchání krátkodobě ošetří silně podchlazeným acetonem nebo ethanolem v poměru 1 objemový díl buněčné suspenze na 2 až 5 objemových dír lů acetonu nebo ethanolu, načež se buňky separují odstředěním nebo filtrací, vlhký koláč stabilizovaných buněk se homogenizuje a usuší při teplotě 10 až 45 °C, s výhodou 30 ‘c, suchá hmota stabilizovaných buněk se mechanicky homogenizuje a před použitím přechovává v dobře uzavřených obalech při teplotách 1 až 45 *C, s výhodou 15 až 20 *C.
Uvedené řešení technologie enzymové výroby 6-aminopeniciláno~ vé kyseliny z fenoxymethylpenicilinu stabilizovanými buňkami kvasinek má, oproti známému a dosud využívanému postupu enzymové výroby této kyseliny z benzylpenicilinu pomocí stabilizovaných bakterií, popsané v čs. autorském osvědčení č. 201 621, tyto výhody :
a) vychází z podstatně stabilnější suroviny přírodního antibiotika,
b) umožňuje zvýšit kvalitu 6-APK, cj umožňuje zvýšit výtěžnost 6-APK,
d) umožňuje dlouhodobé uchovávání, skladování a transport stabilizovaných buněk v suché formě,
e) odstraňuje nebezpečí napadení kultur bakteriofágem,
f) umožňuje zkrátit časové prodlevy mezi jednotlivými cykly semikontinuálním způsobem, nebot kvasinky mají lepší sedimentační vlastnosti než bakterie,
g) snižuje nepříjemné společenské, pracovní a sociální problémy spojené s výrobou 6-APK,
h) umožňuje flexibilní přechod na alternativní možnosti enzymových technologií pro výrobu polosyntetických antibiotik 3-laktamové řady.
Určitou nevýhodou předmětné technologie ve srovnání s postupem výroby 6-APK z benzylpenicilinu, podle čs. autorského osvědčení č. 201 621, je fáze výroby enzymově aktivní biomasy kvasinek, 259996 ί,
-5podle čs. autorského osvědčení č. 250 495, což se projevuje nižší růstovou rychlostí kvasinek ve srovnání s bakteriemi, z čehož rezultuje více jak dvojnásobná kultivační doba, čímž se v provozních podmínkách zvyšuje riziko sekundární kontaminace. Další nevýhodou je v čs. podmínkách dostupnost fenylpropionové kyseliny, která slouží v určité fázi růstu kvasinek produkčního kmene jako jediný zdroj uhlíku a energie.
Suchý biokatalyzátor stabilizovaných kvasinek je tvořen béžovým až hnědým amorfním práškem, obsahujícím individuální suché buňky kvasinek a arteficiální agregáty” vzniklé sušením a nedokonalou homogenizací ve formě nepravidelných hrudek. Obsah sušiny se pohybuje v rozmezí 80 až 95 %. Během několikanásobného opakovaného použití se hrudky a arteficiální agregáty rozpadnou na individuální buňky. Sedimentační rychlost materiálu po jeho nabobtnání ve vodě se významně neliší od buněk intaktních. Hrubší frakce, která činí v průběru asi 20 % suché hmoty, po nabobtnání velmi rychle sedimentuje. Ke kvantitativní sedimentaci 10 % suspenze nabobtnalého biokatalyzátoru stabilizovaných buněk vede odstředění při relativní odstředivé síle 5000 g .za 10 až 15 minut. Suchý biokatalyzátor na bázi stabilizovaných buněk kvasinek lze za sucha prosívat. Po nabobtnání ve vodě (24 hodin) nelze filtrovat, pouze odstřeSovat. Dobře nabobtnalý biokatalyzátor po odstředění zaujímá více jak dvojnásobný objem ve srovnání s jeho suchou formou. Specifická enzymová aktivita biokatalyzátoru se pohybuje od 60 do 140 U . g* suché hmoty. Biokatalyzátor je v suchém stavu stabilní, tj. jeho specifická enzyihová aktivita se nemění minimálně po dobu 1 roku, je-li uchováván v dobře uzavřených obalech, například zataven v polyethylenových sáčcích, při teplotách v rozmezí 1 až 20 *C.
Jedna jednotka (U) enzymové aktivity V-penicilinamidázy je takové množství enzymu, které katalyzuje vznik jednoho yumolu
6-APK z roztoku K-soli V-penicilinu za jednu minutu, při teplotě *C a pH 8,0 v prostředí 0,05 M fosfátového pufru v oblasti enzymové reakční kinetiky nultého řádu. Rozměr aktivityí ,umol -1-1
6-APK . min . ml . Specifická aktivita je vyjádřena ja|to U . g“1 suché hmoty buněk.
Ke stanovení enzymové aktivity V-penicilinamidázy bylo použito spektrofotometrické stanovení 6-APK její reakcí s p-dimethylaminobenzáldehydem podle čs. patentového spisu č. 116 959e ,
6Stupeň teoretické konverze substrátu na produkt byl sledován jednak spektrofotometrícky, jednak vysokotlakou kapalinovou chromatograf ií (HPLC). Podmínky měření: kolona Separon SGX NH2, 7 ^um, x 250 mm, mobilní fáze: CH^CN : H2O (0,006 M NaH2PC>4 . 2 »2Ο) = = 40 : 60. Objemový’ průtok 1 ml . min~^, teplota 25 *C, tlak 72 bar, detekce při 215 nm, A.U.F.S. = 0,02. Objem nástřikové smyčky 10 ^ul. Standardy i reálné vzorky byly rozpuštěny v mobilní fázi. Metody HPLC bylo rovněž použito k hodnocení čistoty a obsahu účinné látky v produktu (6-APK) po izolaci, dále k měření koncentrací druhého produktu, fenoxyoctové kyseliny a substrátu, V-penicilinu.
Kritériem použitelnosti stabilizovaných buněk není jejich specifická aktivita, ale účinnost a kvantitativní stupeň konverze V-penicilinu na 6-APK za časovou jednotku. Doporučená analytická norma použitelnosti vlhkého nebo suchého biokatalyzátoru pro přípravu 6-APK z V-penicilinu je následující: dosažení kvantitativní konverze K-soli V-penicilinu při jeho počáteční koncentraci min.
6,0 % hmota/objem a koncentraci biokatyzátoru min. 70 g sušiny . „ . litr za 120 minut za podmínek teplota 37 *C, pH kontinuálně udržováno zředěnou čpavkovou vodou (1 : 1) v rozmezí hodnot
7,9 až 8,0, nepřetržité míchání reakční směsi.
Způsob enzymové výroby 6-aminopenicilánové kyseliny z fenoxymethylpenicilinu stabilizovanými buňkami kvasinek je dále doložen v příkladech provedení včetně surovinového a strojnětechnologického řešení výroby.
Příklady provedení
Příklad 1
Suroviny pro výrobu stabilizovaných kvasinek
Nepromytá buněčná pasta (15 až 20 % sušiny) nebo zahuštěná vodná buněčná suspenze kvasinek (80 až 100 g sušiny . litr ^). Glutaraldehyd (25 % vodný roztok).
Síran amonný (čistý).
Aceton (čistý).
Suchý led.
Hydroxid draselný (čistý). .
Pitná voda.
Destilovaná voda.
-ΊSpecifikace strojního zařízení pro výrobu stabilizovaných kvasinek
2· Reakční tlakový kotel 500 litrů, 1 ks, AKV, opatřený míchadlem s měnitelnou frekvencí míchání 100 až 1000 otáček . min”1. Kotel opatřený zařízením na měření objemu.
2· Směšovací tlakový kotel 2 m3, 1 ks, opatřený míchadlem, frekvence míchání 200 otáček . min”1.
2· Sedimentační odstředivka, 1 ks, s parciálním odstřelem.
j4. Rozmíchací kotel na aceton 500 litrů, 1 ks, AKV, duplikátor, chlazení solankou, rychloběžné vrtulové míchadlo 500 až 1000 otáček . min ,1, kotel opatřený zařízením na měření objemu. Nevýbušné provedení.
£. Separační resp. filtrační zařízení, 1 ks, možno použít 4 alternativní zařízení.
5/1. Vakuová nuč, 1 ks,, s hustě perforovaným sítem, AKV nebo z plastické hmoty s vloženým textilním materiálem - kalolisová plachetka, vysoké vakuum.
5/2. Kalolis, 1 ks, > opatřený bu3 aspestocelulózovými deskami nebo kalolisovou plachetkou.
I
5/3. Rotační vakuový filtr, 1 ks, buben potažený kalolisovou plachetkou, vysoké vakuum.
5.4. Filtrační odstředivka, 1 ks, AKV, buben potažený kalolisovou plachetkou, nevýbušné provedení.
6. Tácy z plastické hmoty, 100 ks, o rozměrech 50 x 100 cm, umístěné nad sebou v kovových konstrukcích, které jsou transportovatelné pomocí vysokozdvižného hydraulického vozíku.
2· Jemná mlynářská síta, 20 ks.
2· Fluidní sušárna, 1 ks, nevýbušné provedení.
9. Kulový mlýn, 1 ks.
i
Postup výroby stabilizovaných kvasinek
Zahuštěná buněčná suspenze intaktních kvasinek v množství
100 litrů, která byla získána submersní kultivací a separací postupem podle čs. autorského osvědčení č. 250 495, se přečerpá do kotle 2· Suspenze obsahuje 70 až 100 g sušiny buněk . litr”1., Vodná suspenze buněk se v zařízení 2 dokonale homogenizuje zvýšenou frekvencí.míchání, V průběhu intenzivního míchání se ke 100 litrům zahuštěné suspenze postupně přidává 8 litrů 25 % vodného roztoku glutaraldehydu. Aktuální koncentrace glutaraldehydu 259996
-8v reakční směsi je 2 % objem/objem. Suspenze se ponechá asi 15 minut intenzívně míchat, poté se změří pH a upraví 40 % (hmota/objem) vodným roztokem KOH v rozmezí hodnot 7,5 až 7,8. Po úpravě pH se sníží intenzita míchání na 250 až 300 otáček . min”1 a touto intenzitou se nepřetržitě míchá po dobu 3 hodin. Poté se změří pH, suspenze se maximálně zředí vodou a čerpá do směšovacího kotle 2_. Zde se opět maximálně zředí vodou, asi 30 minut se v tomto zařízení zředěná suspenze míchá a poté se čerpá na odstředivku 3. Suspenze se zahustí na objem 100 litrů o sušině 70 až 100 g .
. litr 1. Supernatant při odstředování je mírně opalescentní, nesmí však obsahovat individuální buňký kvasinek (seřízení odstředivky) . Sediment z odstředivky se čerpá zpět do kotle 1.
Ke 100 litrům vodné suspenze stabilizovaných kvasinek, která je předložena v kotli JL, se za míchání postupně vnáší pevný síran amonný v celkovém množství 20,5 kg. Aktuální koncentrace síranu amonného v suspenzi je 265 g . litr~\ tj. 2,0 mol . litr*^. Suspenze se asi 1 hodinu intenzivně míchá, poté se míchání zpomalí asi na 200 až 300 otáček . min”^ a při této intenzitě míchá .
po dobu 2 hodin. Po této době se míchaná suspenze maximálně zředí vodou a přečerpá do směšovacího kotle J2. Zde se opět co nejvíce zředí vodou, míchá asi 30 minut a poté se čerpá na odstředivku 2L Sediment se zahustí na původní objem 100 litrů. Supernatant při odstředování je kalný a opalescentní, nesmí však obsahovat individuální kvasinky (seřízení odstředivky). Zředění sedimentu vodou a další odstředění je v případě velmi kalného supernatantu nutno opakovat.
Ve fázi praní stabilizovaných buněk dochází k větším ztrátám hmoty buněk. Získá se asi 75 až 80 % sušiny stabilizovaných, vypraných a promytých buněk, vztaženo na množství sušiny ve výchozí suspenzi intaktních kvasinek. Stabilizované kvasinky lze přečerpáním do zásobních chlazených kotlíků na sediment skladovat, eventuálně použít ve formě vodné suspenze k bezprostřední přípravě 6-APK z V-penicilinu. Druhou možností je buněčnou suspenzi ošetřit acetonem nebo ethanolem a buňky usušit a skladovat) respektive použít v suchém stavu stejným způsobem. Enzymová aktivita kvasinek je ve stabilizované vlhké i suché formě dostatečně stabilní. Pro transport a dlouhodobé skladování biokatalyzátoru je však výhodnější jeho suchá forma.
Případné zpracování suspenze stabilizovaných, vypraných a promytých buněk do suché formy se provede následujícím způsobem. 259996
-9100 litrů ochlazené suspenze (5 *C), obsahující 80 až 100 g sušiny . litr 1 stabilizovaných a vypraných kvasinek, se ze skladovacího kotlíku čerpá ďo rozmíchacího kotle 4^ kde bylo předem předloženo 300 litrů silně podchlazeného acetonu. Aceton se v zařízení £ popřípadě ještě více podchladí vnášením suchého ledu tak, aby jeho teplota se pohybovala alespoň kolem -10 ’c. Při čerpání suspenze buněk ze skladovacího kotlíku do kotle £ se předložený aceton intenzívně míchá, 500 až 1000 otáček . min”1. Přečerpání suspenze do předloženého podchlazeného acetonu musí být rychlé, míchání při čerpání i po načerpání intenzívní. Stabilizované a vyprané buňky se dehydratují acetonem za intenzivního míchání při nízké teplotě maximálně po dobu 5 minut. Acetonová suspenze buněk se po uvedené době ihned vypouští na filtrační zařízení í>. Přebytečný aceton se rychle a ostře vakuově odsaje a vlhký koláč promyje malým množstvím podchlazeného acetonu a znovu odsaje. Aceton se regeneruje destilací. Dobře odsátá hmota se po částech rozloží na série táců umístěných v kovových konstrukcích · nad sebou, zařízení <5, a hmota se na tácech rozprostře v tenké, asi 1 cm vrstvě. Materiál se poté suší po dobu 24 hodin při teplotě 20 až 30 ’ v sušárně iB. Usušený materiál se přesítuje přes jemná mlynářská síta χ, a zbylý materiál ve formě amorfních zpečených hrudek se mechanicky homogenizuje na zařízení χ. Oba podíly se spojí, zváží a homogenizují. Suché stabilizované buňky kvasinek se uloží do dobře uzavřených polyethylenových lahví nebo se zataví do polyethylenových sáčků a po jejich analýze skladují při teplotě 10 až 15 *C. Homogenát suchého materiálu, stejně tak jako vodná suspenze stabilizovaných kvasinek, se analyzuje na obsah sušiny, specifickou aktivitu V-penicilinamidázy a účinnost a stupeň konverze K-soli V-penicilinu postupy uvedenými v popisu předmětného vynálezu.
Z 1 kg sušiny intaktních kvasinek po fermentaci a separaci se získá přibližně 0,8 kg sušiny stabilizované, zahuštěné, vodné suspenze buněk, nebo přibližně 0,7 kg suchého biokatalyzátoru stabilizovaných buněk o specifické aktivitě v rozmezí 60 až 140 U . g”1. Obsah sušiny suchého biokatalyzátoru je obvykle vyšší β» než 90 %. Fyzikální vlastnosti tohoto suchého materiálu jsou uvedeny v popisu předmětného vynálezu.
-10Přlklad 2
Suroviny pro výrobu 6-APK z V-penicilinu pomocí stabilizovaných kvasinek
Biokatalyzátor (zahuštěná vodná suspenze, nebo suchá forma stabilizovaných buněk), jehož postup přípravy byl uveden v příkladu 1. K-sůl V-penicilinu (min. 1500 mj/mg).
Čpavková voda (čistá).
Kyselina sírová (čistá).
Hydroxid sodný (čistý).
Sedipur CL 930, BASF, Ludwigshafen, NSR
Butylacetát nebo ethylacetát (čistý), možno použít i regenerovaný destilací.
Aceton (čistý), možno použít i regenerovaný destilací.
Ethylalkohol (čistý), možno použít i regenerovaný destilací.
Síran amonný (čistý).
Demineralizovaná voda.
Destilovaná voda.
Specifikace strojního zařízení pro výrobu 6-APK z V-penicilinu pomocí stabilizovaných kvasinek
JL. Skladovací nádrž na buněčnou suspenzi, 5 m3, 2 ks, duplikátor, chlazení solankou, míchání, 200 otáček . min-1, šestilopatková míchadla na společné ose.
2. Dávkovači čerpadlo, 1 ks, výkon průměrně 800 litrů sus.-1 penze . h
2· Sedimentační odstředivka, 1 ks, s parciálním odstřelem.
4^. Kotlík na buněčný sediment, 250 litrů, 4 ks, duplikátor, chlazení solankou, míchání.
J5. Zásobník na buněčný sediment, 500 litrů, 4 ks, duplikátor, chlazení solankou, míchání.
£. Tlakový reaktor na štěpení, 3 m3, 1 ks, duplikátor, chlazení vodou, topení, termoregulace, míchání 180 až 250 otáček . min-1, 2 šestilopatková míchadla umístěná na společné ose, vestavěná pH elektroda s kompenzací na hydrostatický tlak kapaliny, zpřežená s regulačním zařízením na kontinuální úpravu pH a dávkovačím zařízená* na čpavkovou vodu.
2· Zásobník na ředěnou čpavkovou vodu, 400 litrů, 1 ks, míchadlo.
-11<8. Deskový chladič, 2 ks, . solanka asi 150.000 kcal . h”1; tj = 38 *C, t2 = 5 ’c.
2· Tlakový krystalizační kotel, 3500 litrů, 4 ks, smalt, duplikátor, chlazení solankou, míchadlo.
10.Odměrka a ředící kotel na kyselinu sírovou, 200 litrů, 1 ks, smalt, duplikátor, chlazení vodou, míchadlo.
11. Tlakový, filtr, 1 ks, filtr Variox s filtračními přehrádkami 40 x 40 cm z asbestocelulózy, přepážky C 10.
12. Filtrační odstředivka, 2 ks, nevýbušné provedení, průměr 0,9 m.
13.Suspendační kotlík na mokrý produkt, 600 litrů, 1 ks, AKV, nevýbušné provedení, duplikátor, chlazení solankou, vrtulové rychloběžné míchadlo.
14. Vakuová sušárna, 5 ks, nevýbušné provedení, 4 kPa, 60 kg náplně.
15. Zásobník na matečné louhy, 2500 litrů, 2 ks, nevýbušné provedení, duplikátor, chlazení vodou, míchadlo, průhledítko. ·
16. Extrakční kotel, 1 m3, 2 ks, AKV, nevýbušné provedení, duplikátor, chlazeni solankou, průhledítko pro oddělení dvou kapalných fází, míchadlo.
17. Ultrafiltrační jednotka UVF-400, 1 ks, výkon 1 m3 . h1, ultrafiltrační membrány CP-20. 1
Popis výroby 6-APK z V-penicilinu stabilizovanými kvasinkami
Biokatalyzátor ve vlhké formě vodné suspenze,'nebo suchý biokatalyzátor předem nabobtnalý ve vodě po dobu 24 hodin, jehož způsob přípravy byl uveden v příkladu 1, je uchováván v zásobnících 5>, kde je chlazen na teplotu 5 až 15 ’C. Koncentrace suspenze je definována sušinou.
Do reaktoru J5 se načerpá 1500 litrů demineralizované vody a takové množství suspenze ze zásobníku _5, aby vznikl výsledný objem homogenní suspenze 1920 litrů, obsahující 6 až 7 % sušiny kvasinek . litr Suspenze se za míchání vy temperu je na teplotu 37 *C a pH se upraví zředěnou čpavkovou vodou (1:1) na pH v rozmezí hodnot 7,9 až 8,0 že zásobníku T_. Množství sušiny stabilizované biomasy se volí podle konverzního testu, který byl uveden v popisu předmětného vynálezu. Do reaktoru se v průběhu míchání postupně vsype 130 kg draselné sole V-penicilinu. Enzymová hydrolýza trvá maximálně 2 hodiny. Průběžně se kontroluje spotřeba čpavkové vody a analyticky přírůstky koncentrací 6-APK. Skončení 259996 hydrolýzy je indikováno zastavením spotřeby roztoku alkálie a analyticky. Po skončení hydrolýzy je obsah reaktoru ihned co nejrychleji vypouštěn do skladovací nádrže 3.. Suspenze natékající do nádrže 1, je míchána a chlazena a ihned čerpána na deskový chladič £, kde je chlazena solankou na teplotu 5 *C. Z chladiče se vrací zpět ' do nádrže JL. Odtud, po vychlazení se ihned čerpá na sedimentační odstředivku 3_.
Odstředivka 2 je zapojena a předem vyzkoušena á včas nastartována na vodu. Průtok kapaliny je nastaven na 800 litrů . h-^. Parciální odstřel odstředivky v objemu 5 až 10 litrů v intervalech 5 až 8 minut. Po přepnutí odstředivky na vychlazenou suspenzi jsou uvedené parametry řízeny tak, aby průtok byl pokud možno maximální při nejvyšší hodnotě sedimentu a filtrátu mírně opalescentního, avšak bez buněk (mikroskopická kontrola). Supernatant je veden do krystalizačního kotle 9. Hustý sediment buněk s částí reakční směsi je shromaždován v chlazených kotlících .4.
V jedné z krystalizačních nádrží j)- se supernatant za míchání chladí. Po načerpání veškerého supernatantu do krystalizáčhí nádrže 9. se provede čeření supernatantu postupem podle čs. autorského osvědčení č. 218 182 takto:
pH roztoku se za míchání upraví 40 % objem/objem roztokem kyseliny sírové na hodnotu 6,4 až 6,8 z odměrky 10 a poté se za míchání k supernatantu z přenosné nádoby z plastické hmoty přidá 10 litrů zředěného roztoků Sedipuru CL 930, připraveného podle dále uvedeného postupu. Kapalina se asi 10 minut míchá a poté se ponechá v klidu. Soustava se ponechá asi 15 minut v klidu flokulovat. Po uplynutí této doby se vyflokulovaná chlazená soustava tlakem 0,15 až 0,20 MPa dávkuje na tlakový filtr 11.
Čirý, jiskrný filtrát se zachytává do další krystalizační chlazené nádrže 9. Po skončení filtrace se celé zařízení profouká tlakovým vzduchem a propláchne asi 50 litry demineralizované vody. Zásobní roztok Sedipuru CL 930 se připraví takto: ve 4,5 litrech destilované vody se rozpustí 0,5 kg Sedipuru a za míchání se dokonale rozpustí. Z tohoto zásobního roztoku se připraví tzv. pracovní roztok Sedipuru. Do nádoby z plastické hmoty, v které bylo předem předloženo 10 litrů destilované vody, se nalije 250 až 400 ml zásobního roztoku Sedipuru. Tento pracovní roztok se promíchá a použije k čeření supernatantní kapaliny podle následujících kritérií. Při nepatrně zakaleném supernatantu se použije k přípravě pracovního roztoku 250 ml (transmitance supernatantu 259996
-1380 %), při vyšším stupni zákalu še použije 350 až 400 ml zásobního roztoku Sedipuru do 10 litrů vody (transmitance supernatantu 60 % a menší). Zákal supernatantu se měří při 600 nm. Zásobní roztok Sedipuru (0,5 kg/4,5 litru) nesmí být starší než 1 týden.
K asi 1700 až 1800 litrům vyčeřeného, vychlazeného supernatantu po filtraci, předloženého v krystalizačním kotli se za míchání přidá 500 litrů destilovaného butylacetátu a průběžně se za okyselování 40 % roztokem objem/objem kyseliny sírové z odměrky 10, upraví pH na 4,3. Po konečné úpravě pH se suspenze ponechá asi 1 hodinu míchat a poté se ponechá 1 až 2 hodiny v klidu krystalizovat za chlazení. Poté se zapne míchadlo a produkt se vede na filtrační odstředivku 12. Matečné louhy se vedou do zásobníku 15. Vlhký produkt na filtrační odstředivce 12 se prokryje asi 10 litry studené destilované vody a suspenduje pomocí rychloběžného míchadla v 60 litrech vychlazené směsi aceton/ethanol (3:1), předložené v suspendačním kotlíku 13. Suspenze se vede opět na filtrační odstředivku 12, kde se prokryje asi 5 litry ledového acetonu. Všechny promývací roztoky musí být předem.vychlazeny na 5 *C. Promytý vlhký produkt se ukládá na tácy překryté polyethylenovými fóliemi a suší se v zařízení 14 po dobu 24 hodin. Po usušení se suchý produkt zhomogenizuje a zváží.
Matečné louhy s prokrývkami organických rozpouštědel se shromažďují v zásobníku 15. Analyticky se určí obsah 6-APK ve vodné fázi. Koncentrace^6-APK v matečních louzích se pohybuje v rozmezí 2000 až 30ŮQ ýUg . ml-^. Vodná fáze matečných louhů se gravitačně oddělí přes průhledítko a vede se k likvidaci. Organická fáze se přetlačí do extrakčního kotle 16, a za mícháni se přidá kolem 300 litrů demineralizované vody a upraví se pH 40 % hmota/objem roztokem MaOH v rozmezí hodnot 7,8 až 8,0. Po asi 30 minutách míchání se v.klidu obě fáze gravitačně oddělí,'vodná fáze se přetlačí do zásobníku 15, a organická fáze se vede k regeneraci destilací. Vodná fáze se přetlačí ze zásobníku 15 zpět do extrakčního kotle 16 a regeneruje se z ní fenoxyoctová kyselina takto: míchaná vodná fáze se okyselí na pH 2,0 40 % hmota/objem roztokem kyseliny sírové a intenzivně se chladí (5 *C). Poté se míchadlo zastaví a fenoxyoctová kyselina se ponechá v klidu krystalizovat 2 až 3 hodiny. Poté se vlhký produkt za míchání vede na filtrační odstředivku 12, odstředěný druhý produkt se promyje asi 25 litry studené demineralizované’ vody a suší na tácech odděleně v zařízení 14. Takto se regeneruje asi 85 % fenoxyoctové ky259996
-14seliny. Matečné louhy se vedou k likvidaci.
Použitý biokatalyzátor ve formě zahuštěné chlazené suspenze stabilizovaných’ kvasinek obsahující část reakční směsi z předcházejícího cyklu, se čerpá zpět do reaktoru 6, kde je předloženo 1500 litrů demineralizované vody. Po načerpání suspenze po- , užitého biokatalyzátoru se zkontroluje obsah sušiny, objem v reaktoru se nastaví opět na 1920 litrů přídavkem demineralizované vody, suspenze se za míchání vytemperuje na 37 *C a zahájí se další cyklus enzymové hydrolýzy V-penicilinu popsaným způsobem. Časová prodleva mezi jednotlivými cykly nemá být delší než 4 hodiny. Při delším skladování použitého biokatalyzátoru s částí reakční směsi z předcházejícího cyklu se začíná nepříznivě projevovat vzrůst degradačních produktů 6-APK.
S cílem zvýšení kvality 6-APK lze popřípadě zařadit ještě další čištění supernatantu po konverzi a čeření před izolací pomocí ultrafiltrace takto: čirý, jiskrný, vychlazený supernatant po filtraci na zařízení 11, se z krystalizačního kotle 9 tlakem dávkuje na ultrafiltrační jednotku 17. Supernatant v průběhu ultrafiltrace recirkuluje přes druhý deskový chladič JB tak, aby jeho teplota nevystoupila nad 5 ’C. Získaný permeát se čerpá do dalšího krystalizačního kotle 9^, kde se chladí a míchá. Získá se asi 1600 litrů pérmeátu a asi 200 litrů koncentrátu. Krystalizace produktu z permeátu se provádí odděleně v přítomnosti organických rozpouštědel popsaným způsobem. Koncentrát po ultrafiltraci se zpracovává odděleně takto: chlazený koncentrát se za intenzivního míchání upraví 40 % roztokem kyseliny sírové na hodnotu 2,0 až 2,1. Po úpravě pH se za míchání přidá takové množství pevného síranu amonného, aby vznikl roztok s jeho 60 % saturací. pH během přidávání pevného síranu amonného udržovat v rozmezí uvedených hodnot. Po vnesení veškerého síranu amonného se roztok míchá asi 30 minut a poté se ponechá 30 minut v klidu. Roztok se vakuově přefiltruje na nuči s vloženou kalolisovou plachetkou přes vrstvu křemeliny. Přefiltrovaný roztok se převede do chlazené a míchané nádoby a za míchání se nastaví pH zředěným roztokem NaOH na 4,3.
Po jeho krystalizací se produkt zpracovává popsaným způsobem s tím rozdílem, že se získaný vlhký produkt na filtrační odstředivce prokryje studenou destilovanou vodou, suspenduje napřed vé vychlazeném butylacetátu a znovu na filtrační odstředivce separuje, prokryje destilovanou vodou a suspenduje ve směsi aceton/ethanol a znovu zfiltruje, prokryje ledovým acetonem a odděleně suší. Organická rozpouštědla po zpracování permeátu a kon259996
-15centrátu jsou regenerována, stejně tak jako fenoxyoctová kyselina popsaným způsobem.
Výtěžek 6-APK z 1. cyklu se pohybuje mezi 50 až 65 % teorie. Výtěžek 6-APK v 2. a následujících cyklech se pohybuje v rozmezí 82 až 85 % teorie. V matečních louzích se pohybuje koncentrace 6-APK v rozmezí 2,0 až 3,0 g 6-APK . litr”1. Průměrná hodnota v matečných.louzích je 2,5 g 6-APK . litr”1, což je asi 10 %. Obsah účinné látky v suchém produktu se pohybuje v rozmezí 98 až 100 %. Manipulační ztráty biokatalyzátoru na bázi stabilizovaných kvasinek při jeho semikontinuálním cyklování činí maximálně 1 % ztrát hmoty sušiny/cyklus a jsou kompenzovány přidáváním zásobního nepoužitého biokatalyzátoru.
Claims (5)
1. Způsob enzymové výroby 6-aminopeniciÍánóvě’' Kyséliny z fenoxymethylpenicilinu stabilizovanými buňkami kvasinek, vyznačující se tím, že se enzymová hydrolýza provádí suspenzí kvasinek, obsahujících enzym V-penicilin amidázu, zejména suspenzí buněk kvasinky Cryptococcus sp. CCY 17-22-1, předem chemicky stabilizovaných působením bifunkčního činidla, jako jsou dialdehydy dlkarboxylových kyselin, s výhodou působením glutaraldehydu, a předem vypraných roztoky anorganických solí silných kyselin a/nebo zása<^ s výhodou síranem amonným, a s použitím roztoku fenoxymethylpenicilinu v koncentraci 1,0 až 10,0 % hmota/objem, s výhodou 4 až 7 % hmota/objem, při pH 7,0 až 8,5, s výhodou 8,0, při teplotě 10 až 45 *C, s výhodou 37 *C, v míchaném reaktoru a po ukončené hydrolýze a ochlazení reakční směsi na teplotu 0 až 5 *C se suspenze stabilizovaných a vypraných kvasinek oddělí a použije k hydrolýze čerstvé násady roztoku fenoxymethylpenicilinu a ze supernatantu, popřípadě z matečného louhu se po úpravě pH a teploty izoluje 6-aminopenicilánová kyselina, popřípadě regeneruje fenoxyoctová kyselina, přičemž se enzymová hydrolýza fenoxymethylpenicilinu a izolace 6-aminopenicilánové kyseliny, popřípadě regenerace fenoxyoctové kyseliny, alespoň dvakrát opakuje.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako substrátu použije roztoku fenoxymethylpenicilinu ve formě amonné, draselné nebo sodné soli.
3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako substrátu použije surového roztoku fenoxymethylpenicilinu ve formě kyseliny, získaného při zpracování vyfermentované živné půdy po ukončené kultivaci, nebo meziproduktů získaných z různých fází izolace a čištění fenoxymethylpeničilinu.
4. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že stabilizace vodné suspenze kvasinek a jejich praní se provádí za míchání při teplotách 10 až 40 *C, v rozmezí koncentrací glutaraldehydu 0,5 až 10 % objem/objem, s výhodou 2 % objem/objem, při koncentraci buněk 1 až 10 % hmota/objem sušiny, s výhodou 5 až 8 % sušiny hmota/objem, po dobu 0,5 až 5 hodin, s výhodou 3 hodiny, načež se suspenze stabilizovaných kvasinek
-17zředí vodou, buňky se oddělí, znovu suspendují ve vodě a za míchání ošetří vnášením pevného síranu amonného v rozmezí jeho koncentrací ve vodné suspenzi 0,1 až 5,0 mol . litr“1, s výhodou 2,0 mol . litr“1, po dobu 1 až 10 hodin, s výhodou 2 hodiny, suspenze se zředí vodou, kvasinky se oddělí a alespoň dvakrát promyjí vodou.
5. Způsob podle bodů la4, vyznačující se t í m , že stabilizované, vyprané a promyté kvasinky se před výrobou 6-aminopenicilánové kyseliny přechovávají ve formě zahuštěné vodné suspenze v chlazeném zásobníku při teplotách v rozmezí 1 až 30 *C, s výhodou 5 až 15 *C, nebo se tato zahuštěná suspenze za míchání krátkodobě ošetří silně podchlazeným acetonem nebo ethanolem v poměru 1 objemový díl buněčné suspenze na 2 až 5 objemových dílů acetonu nebo ethanolu, načež se buňky separují odstředěním nebo filtrací, vlhký koláč stabilizovaných buněk se homogenizuje a usuší při teplotě 10 až 45 *C, s výhodou 20 až 30 ’C, suchá hmota stabilizovaných · buněk se mechanicky homogenizuje a před použitím přechovává v dobře uzavřených obalech při teplotách 1 až 40 *C, s výhodou 15 až 20 *C.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS873060A CS259996B1 (cs) | 1987-04-30 | 1987-04-30 | Způsob enzymová výroby 6-amlnopenioilánové kyseliny z fenoxymethylpenicilinu stabilizovanými buňkami . kvasinek |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS873060A CS259996B1 (cs) | 1987-04-30 | 1987-04-30 | Způsob enzymová výroby 6-amlnopenioilánové kyseliny z fenoxymethylpenicilinu stabilizovanými buňkami . kvasinek |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS306087A1 CS306087A1 (en) | 1988-03-15 |
| CS259996B1 true CS259996B1 (cs) | 1988-11-15 |
Family
ID=5369562
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS873060A CS259996B1 (cs) | 1987-04-30 | 1987-04-30 | Způsob enzymová výroby 6-amlnopenioilánové kyseliny z fenoxymethylpenicilinu stabilizovanými buňkami . kvasinek |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS259996B1 (cs) |
-
1987
- 1987-04-30 CS CS873060A patent/CS259996B1/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS306087A1 (en) | 1988-03-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Papagianni et al. | The influence of glucose concentration on citric acid production and morphology of Aspergillus niger in batch and culture | |
| US4156630A (en) | Process and apparatus for carrying out a fermentation operation upon recycling of microorganisms | |
| Aksu et al. | Lactic acid production from molasses utilizing Lactobacillus delbrueckii and invertase together | |
| EP0771357B1 (en) | PROCESS FOR PREPARATION OF $g(b)-LACTAMS AT CONSTANTLY HIGH CONCENTRATION OF REACTANTS | |
| CA2063490A1 (en) | Extracellular preparation of high molecular weight homopolysaccharides and the use thereof, and the fungal strains therefor | |
| IE51455B1 (en) | A process for the production of isomaltulose(6-0-alpha-d-glucopyranosido-d-fructose)using imobilized microorganisms | |
| RU2015166C1 (ru) | Способ получения 6-оксиникотиновой кислоты | |
| CS259996B1 (cs) | Způsob enzymová výroby 6-amlnopenioilánové kyseliny z fenoxymethylpenicilinu stabilizovanými buňkami . kvasinek | |
| CN216663111U (zh) | 转化提取装置 | |
| US4113566A (en) | Process for preparing 6-aminopenicillanic acid | |
| CA2101063A1 (fr) | Xylanase, souches de bacillus productrices de xylanase et leurs utilisations | |
| FR3113067A3 (fr) | Procédé de préparation de bêta-galactosidase et son utilisation | |
| PL98632B1 (pl) | Sposob wytwarzania kwasu 6-aminopenicylanowego | |
| CN109929884A (zh) | 一种酮戊二酸的制备方法 | |
| CN105219809A (zh) | 一种移动纤维床反应器及应用于丁酸生产的方法 | |
| CN119060867B (zh) | 一种酵母细胞壁及其在酒精发酵领域的应用 | |
| Ghosh et al. | Production of penicillin with waste mycelium of Penicillium chrysogenum as the sole source of nitrogen | |
| EP4190898A1 (en) | Method for preparing beta-galactosidase and application thereof | |
| US5200326A (en) | Method for the fermentative production of L-amino acids from α-keto acids | |
| Lohmeyer et al. | Cultivation of immobilized cells of Claviceps purpurea in bioreactors | |
| NO134912B (cs) | ||
| KR900007000B1 (ko) | 칸디다 유틸리스의 변이주 sh 8636 및 이를 이용한 단세포단백질의 제조방법 | |
| Rosén | Preparation of Yeast for Industrial use in Production of Beverages | |
| SU1433981A1 (ru) | Способ получени ферментного препарата L-лизиндекарбоксилазы | |
| SU1254012A1 (ru) | Способ получени растворов сахаров |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20020430 |