CS259231B1 - Myši lymfocytámy hybridóm produkujúci monoklonálnu protilátku inhibujúcu hemaglutinačnú aktivitu virusu Newcastleskej choroby - Google Patents

Description

259231

Vynález sa týká myšieho lymfocytárneho hybridómu produkujúceho monoklonálne protilátkyproti virusu Newcastleskej choroby s hemaglutinačnoinhibičnou aktivitou.

Doposial sa protilátky proti virusu Newcastleskej choroby připravujú tak, že sa virusinjikuje pokusným zvieratám, najma králikom a ovciam. Vzhladom na to, že nestač! jedna dávkavirusu pre vyvolanie dostatočne vysokej protilátkovej odpovede, je potřebná ho injikovaťviackrát opakované v různých dávkách a časových intervaloch. Sérum takto imunozovaných zvieratslúži ako zdroj protilátok najmS pri diagnostickém vyšetřeni chovov hydiny. Zmienený postupimunizácie má niekolko nevýhod.

Ziskava sa heterogénna zmes protilátok, ktorej rozloženie sa v organizme producentamění, je velmi různorodé, kvalitativně a kvantitativné kolíše od jedného odběru po druhýa je neopakovatelné. Okrem toho sérum obsahuje vela protilátok proti nežiadúcim prímešiam,ktoré sa nachádzajú vo vírusovom materiáli použitom pre imunizáciu. V důsledku toho je potřebnéséra upravovat zložitými postupmi, čím získáváme heterogénne a nestandardně preparáty.

Využitelnost takto připraveného diagnostického séra je znižená aj tým, že jeho Specificképolyklonálne protilátky sú z hlediska interakcie s vlrusom velmi různorodé. Naviac přípravavirusu pre imunizačné účely je nákladná.

Hybridům NDV-NTP-3 bol připravený známým spůsobom, klonováním skupiny hybridómov v mSkkomagare, vzniklých fúziou buniek myšej 2-amino-6-hydroxy-8-azapurin /8-azaguanín/ rezistentnejmyelómovej linie označenéj NSO a slezinových buniek inbrédnej linie myší ΒΑΧ,Β/c, imunizovanýchpurifikovaným vírusom NDV, kmeň L Kansas /G. Kůhler, C. Milstein, G. W. Butcher, J. C. Howard:Nátuře 286, 550 /1977//.

Uvedené nevýhody v podstatnéj miere odstraňuje vynálezu, ktorého podstata spočívá v myšomlymfocytárnom hybridóme NDV-NTP-3, produkujúcom monoklonálnu protilátku podtriedy IgGl,kappa, inhibujúcu hemaglutinačnú aktivitu virusu Newcastleskej choroby. Výhodou hybridómu je, že produkuje izotypovo a idiotypovo homogénnu špecifickú protilátku,tzv. monoklonálnu protilátku, ktorá Specificky inhibuje hemaglutinačnú aktivitu virusuNewcastleskej choroby a tým je ho možné použit na jeho identifikáciu vo vyšetřovaných vzorkáchz různých chovov hydiny. Jednobunkový lymfocytárny hybridóm NDV-NTP-3 rastie in vivo v perito-neálnej dutině BALB/c myší za súčasnej tvorby ascites. Rastie aj in vitro v kultivačnýchmédiach vhodných pre živočišné buňky.

Taktiež pozmrazeni a uložení v tekutom dusíku a po opStovnom rozmraženi si zachovávásvoju schopnost produkovat monoklonálnu protilátku viažucu virus Newcastleskej choroby.Neobsahuje na rozdiel od konvenčných antisér nevhodné, balastné protilátky. Příklad 1 7

Pre přípravu hybridněj buňkovéj linie sa použije 2.10 buniek myšej 2-amino-6-hydroxy--8-azapurin (8-azaguanín/ rezistentnej myelómovej bunkovej linie, ktoré sa pomocou 1 ml p 50 % hmot. polyetylénglykolu spoj'a s 1.10 slezinových lymfoidných buniek myši imunizovanéj10 jug virusu. V priebehu 14 dní vyrastú pod selektívnym tlakom kyseliny 4-amino-pteroyl-tglutámovej /aminopterínu/ hybridně, buňkové linie, ktoré produkujú monoklonálne protilátkyproti virusu Newcastleskej choroby, ktoré sa s ním viažu a ovplyvňujú jeho biologickúaktivitu. Tieto buňky potom klónujú tak, že sa zmieša 0,5 % hmot. agaru s 5.10® až 10.10® myších slezinových buniek v médiu RPMI 1 640, ktoré obsahuje 100 mg.ml-1 tetrahydrátu dusičnanu-1 -1 -1 vápenatého, 2 000 mg.ml D-glukózy, 100 mg.ml heptahydrátu síranu horečnatého, 400 mg.ml chloridu draselného, 1 512 mg.ml-1 hydrogenfosforečnanu sodného, 6 000 mg.ml"1 monohydrátudihydrogenfosforečnanu sodného, 100 mg.ml-1 kyseliny 2-amino-5-guanidinovalérovej /argininu/, 50 mg.ml-1 kyseliny 2-aminosukcínamovej /asparagínu/, 20 mg.ml-1 kyseliny 2-aminojantárovej/kyseliny asparágovej/, 50 mg.ml-1 kyseliny 3',3'-ditiobis/2-aminopropánovej / /cystínu/, 3 259231 20 mg.ml-1 kyseliny 2-aminoglutárovej /kyseliny glutamovej/, 300 mg.ml-1 kyseliny 2-amino-glutarámovej /glutamínu/, 1 mg.ml-1 kyseliny 2-aminoglutaraminyl-2-merkaptopropionyl-amino-octovej /glutationu tj. glutaminyl-cysteinyl-glycínu/, 10 mg.ml-1 kyseliny aminooctovej/glycínu/, 15 mg.ml kyseliny alfa-amino-l-imidazol-4-propiónovej /histidínu/, 50 mg.ml-1 kyseliny 2-amino-3-metylvalérovej /izoluecínu/, 50 mg.ml-1 kyseliny 2-amino-4-metylvalérovej/leucínu/, 40 mg.ml-1 kyseliny 2,6-diaroinohexánovej /lyzínu/, 15 mg.ml-1 kyseliny 2-amino-4--/metyltio/-raaslovej /metioninu/, 15 mg.ml kyseliny 2-amino-3-fenylpropiónovej /fenyl- alanínu/, 20 mg.ml-1 kyseliny 2-pyrolidínkarboxylovej /prolinu/, 30 mg.ml-1 kyseliny 2-amino--3-hydroxypropiónovej /serínu/, 20 mg.ml-1 kyseliny 2-amino-3-hydroxymaslovej /treoninu/, 5 mg.ml-1 kyseliny 2-amino-3-/3-indolyl/propiónovej /tryptofánu/, 20 mg.ml-1 kyseliny 2--amino-3-/4-hydroxyfenyl/-propiónovej /tyrozínu/, 20 mg.ml-^ kyseliny 2-amino-3-metylmaslovej/valínu/, 0,2 mg.ml 1 kyseliny 5-/2-oxoimidazolidíno/4,5-c/tiol-2-yl/pentánovej /biotínu/, 0,005 mg.ml-1 kobalt alfa/alfa-/5,6-dimetylbenzimidazolyl//-kobalt-beta-kyanokobamid vitamínuB12/, 0,250 mg.ml 1 D-N-/2,4-dihydroxy-3,3-dimetylbutyryl/-beta-2-aminopropionát vápenatý/pantotenát vápenatý/, 3 mg.ml-^ 2-hydroxyetyltrimetylamóniumohlorid /cholínchlorid/, 1 mg.ml-1 kyseliny N-/2-amino-4-hydroxypteridín-6-ylmetyl/-p-aminobenzoovej /kyseliny listovej/,35 mg.ml-^ /1,2,3,5/4,6/cyklohexándexol/ /myoinozitolu/, 1 mg.ml-1 pyridin-3-karboxyamídu/nikotinamidu/, 1 mg.ml * kyseliny 4-aminobenzoovej /kyseliny p-aminobenzoovej/, 1 mg.ml”^3-hydroxy-4,5-bis/hydroxymetyl/-2-metylpyridínchloridu /pyridoxínchloridu/, 0,2 mg.ml""^7,8-dimetyl-10-/l'D-ribityl/izoaloxazínu /riboflavinu/, 1 mg.ml-1 3-/4-amino-2-metyl-pyrimidyl- ’-5-metyl/-5-/2-hydroxyetyl/-4-metyltiazolu /tiamínchloridu/, 2 000 mg.ml 1 hydrogenuhličitanusodného doplnenom s 2 romol kyseliny 2-aminoglutarámovej /glutamínu/, 5.10-5 mol 2-merkapto-etanolu, 100 jug.ml 0-alfa-L-2-deoxy-2-/metylamino/-glukopyranozyl-/l-2/-0-alfa-L-deoxy--3-C-formyllyxofuranozy1-/1-4/-1,3-deoxy-l,3-diguanidoscyloinožitsulfátu /streptomycín-sulfátu/, 100 jednotiek na mililiter kyseliny 6-/N-fenylacetoamido/-penicilánovej /pěnici- ' línu G/, 1 mmol kyseliny N-2-hydroxyetylpiperazin-N'-2-etán sulfónovej /Hepesu/ sa rozpustív třikrát redestilovanej vodě a doplní trikrát redestilovanou vodou na objem 900 ml roztoku,ktorý sa doplní 100 ml normálneho inaktivovaného koňského séra. Výsledné pH takto připravovaného kultivačného média je 7,2. Po zatuhnutí agaru sa na vrstvu0,5 % hmot. agaru nanesie 100 hybridných buniek v 0,25 % hmot. agaru. Po 10 dňoch vyrastú kolonie, ktoré sa pomnožia v médiu RPMI 1 640 doplnenom s 2 mmol kyseliny 2-aminoglutarámovej-5 -1 /glutamínu/, 5.10 mol 2-merkaptoetanolu, 100 jug.ml 0-alfa-L~2-deoxy-2-/metylamino/-gluko-pyranozyl-/1-2/-0-alfa-L-deóxy-3-C-formyllyxofuranozy1-/1-4/-1,3-deoxy-l,3-diguanidoscyloinozit-sulfátu /streptomycínsulfátu/, 100 jednotiek na.mililiter kyseliny 6-/N-fenylacetamido/--penicilánovej /penicilínu GZ, 1 mmol kyseliny N-2-hydroxyetylpiperazín-N"-2-etánsulfónovej/Hepesu/ sa rozpustí v trikrát redestilovanej vodě a doplní trikrát redestilovanou vodouna objem 900 ml roztoku, ktorý sa doplní 100 ml normálneho inaktivovaného koňského séra. Výsledné pH takto připraveného kultivačného média je 7,2. V 1 ml kultivačného médiasa nachádza 350 až 700 tisíc hybridómov NDV-NTP-3 produkujúcich 10 až 100 jug monoklonálnejIgGl, kappa, protilátky. Příklad 2

Postupuje sa ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa v kultivačnom médiu použije ne-predtestované běžné telacie fetálne sérum. Do takto připraveného kultivačného prostrediapřenesené buňky po fúzii nie sú schopné rást a produkovat monoklonálne protilátky.

Myší lymfocytárny hybridóm NDV-NTP-3 sa kultivuje pri teplote 37 °C. Stredný generačnýčas je 22,4 h, modálny počet chromozómov je 24 mesiacov po fúzii 70 chromozómov. Produkovanámonoklonálna protilátka je myší imunoglobulín triedy IgGl, kappa.

Monoklonálna protilátka produkovaná myším lymfocytárnym hybridómom NDV-NTP-3 mňže byťpoužitá vo veterinárněj praxi pre zisťovanie virusu Newcastleskej choroby v chovoch hydiny.

Claims (1)

1. 259231 PREDMET VYNALEZU MySX lymfooytárny hybridem NDV-NTP-3,' produkujúci monoklonálnu protilátku inhibujúcuhemaglutinaSná aktivitu virusu Newcastleskej choroby, podtriedy IgGl kappa. Severografia, n. p., MOST Cena 2,40 Kčs