CS259204B1 - Spósob přípravy enzýmových koncentrátov β -D-fruktofuranozidázy - Google Patents

Description

259204

Vynález sa týká spdsobu přípravy enzýmových koncentrátov beta-D-fruktofuranozidázy.

Beta-D-fruktofuranozidáza /EC 3.2.1.26/ je enzým, uplatňující sa v rĎznych odborochpotravinářského priemyslu pri hydrolýze sacharózy na glukózu a fruktózu. Vyskytuje sa v hubách,nejma kvasinkách, schopných využívat sacharózu ako jediný zdroj uhlíka a energie. V buňkáchkvasiniek sa tento enzým vyskytuje prevažne vo formě externého glykoproteínu a v malommnožstve aj ako cytoplazmatická neglykozylovaná beta-D-fruktofuranozidáza v izolovanejalebo imobilizovanej formě, ako aj jej aktivita v kvasinkách, sú významné z hladiska biotechno-logického vo viacerých odboroch potravinářského priemyslu.

Jej navýznamnejěím zdrojom sú pekárske kvasinky. Doterajšie známe spĎsoby přípravybeta-D-fruktofuranozidázy sú značné komplikované a nadobudli vSčšinou iba laboratorně prepa-ratívny význam. Využitie alkylglykoléterov a trietylénglykolu na priemyselnú výrobu enzýmu/Čsl. pat. S. 101 971/ /1960/ sa zatial z ekonomických a hygienických dóvodov neujalo. V súčasnosti popři výrobě bielkovín pre potravinářské účely z jednobunkových mikro-organizmov je snaha komplexně využit kvasničnú biomasu i na izoláciu biologicky aktívnýchbielkovín, ako aj iných cenných látok, ktoré sme zatial ako produkty mikrobiálrieho metabolizmuu nás nevyrábali.

Tak je tomu i v případe beta-D-fruktofuranozidázy, ktorá sa pre potravinářsky priemysel,najmS cukrovinkárský, zatial k nám iba dováža. Výhodou spůsobu přípravy beta-D-fruktofuranozidázy podlá vynálezu je skutočnosť, žepostup zohledňuje požiadavky komplexnej frakcionácie kvasničnej biomasy a vedie k prídavkominvertázy o vysokej špecifickej aktivitě, obzvlášt ak je aplikovaný na kmene, schopné výraznejnadprodukcie tohoto enzýmu. Naviac balastné bielkoviny, ako mezdiprodukt izolačného postupu,sú po úpravě použitelné pre potravinářské alebo krmovinárske účely.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že beta-D-fruktofuranozidáza sa najprv uvolní z buniekkvasiniek do roztoku, a to bud autolýzou buniek, indukovanou elektrolytmi a organickýmirozpúšťadlami alebo enzymatickým, resp. mechanickým rozrušením buňkových stien.

Solubilizovaná beta-D-fruktofuranozidáza z viac ako 50 % zostáva po sedimen£áciipartikulárnych buňkových štruktúr v bezbunkovém extrakte. Specifická aktivita beta-D-frukto-furanozidázy v extrakte sa zvýši hydrolýzou, resp. sedimentáciou balastných makromolekúlpo ich kyselej denaturácii a izoelektrickej precipitácii. Vzniknutý supernatant s beta-D--fruktofuranozidázou se zbaví nízkomolekulárnych látok ultrafiltráciou a obsah beta-D-frukto-furanozidázy sa mĎže dalej skoncentrovat dehydratáciou za zníženého tlaku alebo precipitáciouetanolom, resp. acetónom. Týmto spĎsobom možno získat pri 30 až 45 % výťažnosti preparátybeta-D-fruktofuranozidáza, ktorých Specifická aktivita je vyššia ako 75 000 ϋ/g sušiny,resp. 7 500 U/ml přípravku.

Vynález je" možné prakticky uskutečňovat podlá niektorého z nasledujúcích príkladovbez toho, aby sa iba na ne výlučné obmedzoval. Příklad 1

R

Buňky kvasiniek Saccharomyces serevisiae kmeňa M2A-C 2 /3,5 g Sušiny/ sa suspendovaliv destilovanej vodě a dezintegrovali s účinnosťou viac ako 98 % v homogenizátore firmyBraun v přítomnosti skleněných guličiek /priemer 0,45 mm/ pri 4 °C po dobu 3 min. Homogenáty,připravené z dvakrát 3,5 g sušiny buniek sa spojili, guličky sa odstránili filtráciou cezfritu Sintr Sl, premyli a celkový objem homogenátu sa upravil na 100 ml. Sedimentácioubuňkových stien, jadier a nerozbitých buniek vznikol bezbunkový extrakt beta-D-fruktofurano-zidázy. Jeho pH sa upravilo na hodnotu pH 6 a extrakt sa inkuboval 2 hod. pri 50 °C zaobčasného premiešania.

Claims (1)

1. 3 259204 Po okyslení základného extraktu s HC1 na pH 3,6 sa balastné makromolekuly oddělilisedimentáciou. Vzniknutý supernatant sa podrobil ultrafiltrácii a diafiltrácii cez membránu,zachytávajtícu částice o molekulovej hmotnosti 50 000 a neprepúšťajúcu beta-D-fruktofuranozidázuVzniknutý retentát o aktivitě 8 360 U/ml sa podrobil lyofilizácii za vzniku bezvodého preparátubeta-D-fruktofuranozidázy o špecifickej aktivitě 87 030 U/g sušiny. Příklad 2 O 100 g droždia z produkčného kmeňa s. cerevisiae M2A-C 2 sa podrobilo autolýze v přítomno-sti NaCl /5 g/100 ml/a etanolu /6 g/100 ml/ v celkovom objeme 120 ml pri 40 °C po dobu70 hod. Suspenzia autolyzovaných buniek sa odstředila, 1-krát premyla vodou a supernatantysa spojili. Vzniknutý extrakt beta-D-fruktofuranozidázy sa podrobil ultrafiltrácii cezmembránu, zachytávajúcu částice o molekulovej hmotnosti 50 000. Retentát sa vákuovo zahustilza vzniku preparátu beta-D-fruktofuranozidázy o špecifickej aktivitě 70 500 U/g. Přiklad 3 R Buňky kvasiniek Saccharomyces cerevisiae kmeň M2A-C 2 sa podrobil enzymatickej dezinte-grácii glukanázami, připravenými zo žalúdka slimákov. Buňky /10 g sušiny/ sa najprv vystavilidvojminúťovému účinku 0,5 M merkaptoetanolu pri pH 9,3. Potom sa odstředili, suspendovaliv 100 ml vody, obsahujúcej 1 g enzýmového výtažku zo žalúdka slimákov a nechali inkubovaťpri 30 °C po dobu 70 minút. Po sedimentácii.osmoticky, resp. enzymaticky rezistentnýchbuniek, vznikol bezbunkový extrakt beta-D-fruktofuranozidázy, ktorý sa dalej podrobil tepelnejdenaturácii, izoelektrickej precipitácii a ultrafiltrácii, ako je uvedené v příklade 1. Retentát po ultrafiltrácii mal aktivitu 7 750 U/ml. Po dialýze retentátu oproti vodě pri4 °C a jeho lyofilizácii, vznikol bezvodý preparát beta-D-fruktofuranozidázy o špecifickejaktivitě 76 300 U/g sušiny. Vynález nájde široké použitie v potravinárskom priemysle pri priemyselnej výrobě beta--B*fruktofuranozidázy a jej aplikácii pri výrobě invertného cukru, ktorý je sladší a v roz-tokoch stabilnější, resp. rozpustnější ako repný cukor sacharóza. PŘED MET VYNÁLEZU SpSsob přípravy enzýmových koncentrátov beta-D-fruktofuranozidázy z buniek kvasiniekSaccharomyces cerevisiae , s výhodou kmeňov nadrpodukujúcich tento enzým, po uvlnení beta--D-fruktofuranozidázy do roztoku autolýzou, enzymatickou alebo mechanickou dezintegrácioubuniek, vyznačujúči sa tým, že z cytosolu, vzniknutého po sedimentácii buňkových štruktúr,sa balastné makromolekuly odstránia dalšou sedimentáciou po predcházajúcom vystavení cytosoluúčinkom teploty 20 °C až 60 °C s výhodou 50 °C, pri pH 3 až 8 s výhodou pH 6, po dobu 15 minaž 240 min s výhodou 120 min, bez alebo s následnou úpravou pH na hodnotu 3 až 4, na čosa beta-D-fruktofuranozidáza skoncentruje ultrafiltráciou, na ultrafiltroch zachytávajúcichčástice o molekulovej hmotnosti 50 000 až 500 000, a odpařením vody za zníženého tlaku priteplote 4 °C až 50 °C.