CS255180B1 - Způsob preparativní izolace (6-3H)-thyminu - Google Patents

Abstract

(6- H)-thymin je používán jako stopovací látka v biochemickém, biologickém a lékařském výzkumu. Dále slouží jako výchozí látka pro syntézu složitějších biologicky aktivních látek, tj. (6-3H)-thymidinu, resp. 5'-fosfátů (6- H)-thymidinu. Cílem řešení bylo zajistit výtěžky (6-3H)-thyminu, zkrátit separačnf cyklus a zlepšit kvalitu výsledného produktu. Vyšší účinek spočívá ve využití vysokoúčinné kapalinové chromatografie, což umožňuje získávat radioohemioky čistý (6-3H)-thymin o vyšším výtěžku v kratším výrobním cyklu. Uvedeným postupem bylo dosaženo výtěžku 85 až 90 % (6-3H)-thyminu, vztaženo na obsah této látky v reakčni směsi. Radiochemická čistota a chemická čistota je 97 až 98 %.

Description

Vynález se týká způsobu preparativní izolace (6- H)-thyminu z reakční směsi po jeho přípravě chemickou syntézou (ěs. AO 192 238).

Obvyklými způsoby izolace uvedené sloučeniny z reakčních směsí po její syntéze jsou me3 tody preparativní papírové chromatografie. Zejména při přípravě (6- H)-thyminu o vysoké molové aktivitě má tento způsob izolace řadu nedostatků. Především dochází k izolačním ztrátám (30 %) a izolovaná sloučenina není chemicky čistá. Při dnešních požadavcích na vysokou molovou aktivitu sloučenin značených radionuklidem nejsou izolační ztráty při aplikacích standardních postupů z ekonomického hlediska již zanedbatelné. Nízký stupeň chemické čistoty preparátů izolovaných preparativní papírovou chromatografií je zapříčiněn zejména přítomností výluhů z chromatografického papíru, případně nečistoty z rozpouštědel. Při aplikaci takto přípravováného (6- H)-thyminu v enzymatických syntézách (6- H)-thymidinu, (6- H)-thymidinu-5'-monoO fosfátu a (6- H)-thymidinu-5’-trifosfátu nelze vyloučit úplnou ztrátu katalytické účinnosti enzymových preparátů.

Další nedostatek papírové chromatografie spadá do úseku bezpečnosti práce s radioaktivními látkami. Manipulace s radioaktivními sloučeninami při nanášení na chromatografické papíry, vlastní chromatografie, autoradioohromatografie a eluce v podstatě zvyšují možnost kontaminace prostředí i osob. Navíc nutno konstatovat, že preparativní papírová chromatografie je časově náročná metoda.

Doposud používaný technologický způsob izolace (6- H)-thyminu z reakční směsi po jeho chemické syntéze se provádí metodou papírové chromatografie na chromatografickém papíru Whatmann-3 v soustavě butanol-propanol-amoniak-voda (7:5:7:2), R_f,thyminu v této soustavě je 0,45. Identifikace radioaktivních sloučenin na ohromatogramech se provede jejich porovnáním s neaktivními standardy. Proužek, odpovídající radioaktivnímu thyminu, se vystřihne a eluuje redestilovanou vodou. Protože se nedosáhne požadované radiochemické čistoty, je třeba papírovou chromatografií zopakovat v jiné vyvíjecl soustavě, čímž se dále zvyšují ztráty izolovaného preparátu.

o

Podstata způsobu preparativní izolace (6- H)-thyminu (o molové aktivitě vyšší než 0,8 GBq/ /mmol eluční vysokoúčinnou chromatografií podle předmětného vynálezu spočívá v tom, že se 3 směs sloučenin vznikajících při přípravě radioaktivního (6- H)-thyminu děli na sloupci hydrofobního specifického sorbentu, za použiti 0,6% vodného roztoku čistého etanolu jako eluentu. Povrch silikagelu (kyselina tetrahýdrokřemičitá H^SiO^) je pokryt oktadecylovými skupinami a zbytkové silanoly jsou blokovány methylovými skupinami. S výhodou lze použít sorbent SEPARON SIX-C-18.

Eluovaný radioaktivní (6-³H)-thymin se po dozimetrii a stanovení radiochemické čistoty naředí na expediční koncentraci a přímo expeduje, popřípadě se použije pro další chemické syntézy.

Výhody nového postupu spočívají v tom, že výtěžek radioaktivního produktu je v dlouhodobém průměru o 20 % vyšší než při jeho izolaci shora uváděným způsobem preparační papírové chromatografie.

□

Zásadní výhodou izolace (6- H)-thyminu podle předmětného vynálezu je možnost získání produktu o vysoké radiochemické čistotě (min. 97 %) a bez přítomnosti chemických nečistot. To umožňuje aplikovat takto izolovaný (6- H)-thymin jako výchozí radioaktivní substrát pro pří3 3 právu (6r H)-thymidinu a (6- H)-5-fosfátů thymidinu vhodnými enzymatickými postupy, aniž dochází k inhibici katalýzujících enzymů. Další výhodou je zkrácení doby výrobního cyklu separace .

Dělení kapalinovou chromatografií probíhá v kapalném prostředí v uzavřeném poloautomatizovaném systému. Odpadá autoradiografie a sušení chromatografických papírů, přičemž snadno může dojít ke kontaminaci radioaktivitou. Tím se podstatně zvyšuje bezpečnost práce při přípravě (6-²H)-thyminu.

□

Pro objasnění je dále uveden přiklad postupu izolace radioaktivního (6- H)-thyminu z reakční směsi po hydrogenaci neaktivního 6-bromthyminu (30 mg) v prostředí 1M KOH (0,4 ml) plynným tritiem (185 GBq). Jako katalyzátor se používá 4 mg 10% Pd na aktivním uhlí. Po chemické syntéze se z reakční směsi lyofilizací odstraní labilně vázané tritlm. Katalyzátor se odstraní odstředěním. K reakční směsi se přidá 1M HC1 tak, aby konečná hodnota pH byla 6-7. Celková radioaktivita takto připraveného vzorku by byla 65 285 MBq, z toho 91,2 % (6-³H)-thyminu. Chemické složení této směsi bylo: 38,4 % thyminu, 56,3 % 6-bromthyminu, 5,3 % neidentifikovatelné látky. Vzhledem ke kapacitě dělicí kolony byla reakční směs rozdělena na 3 díly a každý dil byl vždy zvlášt separován. Kolona byla plněna tuzemským sorbentem SEPARON SIX-C-18 a před vnesením vzorku byla 120 minut promývána 0,6% vodným roztokem CjH^OH o průtoku 100 ml/h. Po vnesení vzorku se kolona promývá stejným roztokem o stejném průtoku. Při takto nastaveném průtoku se po 36 minutách začala eluovat radioaktivní látka neznámého složení, která absorbovala v oblasti UV 254 nm. Po 50 minutách se začala eluovat druhá radioaktivní látka neznámého složení, která též absorbuje v oblasti UV 254 nm. Po 87 minutách se začal eluovat (6- H)-thymin, jehož doba eluce trvala 23 minut. Radioaktivní (6- H)-thymin se eluoval v objemu 40 ml. Po 3 skončení eluce (6- H)-thyminu se kolona začala promývat 96% C2H5OH. Tento eluent vytěsnil nezreagovaný 6-bromthyrain po 187 minutách od začátku promývání. Průměrná radiochemická čistota 3 3 (6- H)-thyminu byla 97,3 %. Bylo získáno 52 052 MBq (6- H)-thyminu, což představuje výtěžek 87,4 %.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob preparativní izolace (6- H)-thyminu z reakční směsi eluční vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii vyznačující se tím, že se směs sloučenin, vznikajících při přípravě (6-³H)-thyminu dělí na sloupci porézního iontoměniče na bázi silikagelu, jehož povrch je pokryt oktadecylovými skupinami za použiti 0,6% vodného roztoku čistého etanolu jako eluentu.