CS254706B1 - Způsob přípravy imunologicky funkčních frakcí z lidských a zvířecích zhoubných nádorů - Google Patents

Abstract

Způsob spočívá v tom, že se supernatant po poslední centrifugaci při zatížení 90 až 110 x 10^ g extrahuje fenolem v objemovém poměru 1:0,5 až 1,5 v přítomnosti ionogenního tensidu a 8- -hydroxychinolinu při pH 7 až 7,5 nejméně dvakrát, získaná vodná fáze obsahující směs cytoplazmatických ribonukleových kyselin se rozdělí afinitní chromatografií na koloně plněné celulózou s navázanými oligonukleotidy deoxythimidinu, polyadenylované ribonukleové kyseliny se zachytí na koloně a eluují se vodou, vodný eluát se dále dělí vysokotlakou gelovou chromatografii, sbírají se frakce o mole5 4 kulové hmotnosti 3.10 az 1,5.10 , ktere jsou orgánově specificky aktivní v různých, převážně imunologických testech. Získané frakce jsou použitelné jako antigeny k imunizaci a dále v různých imunologických testech pro buňkami médiovanou imunitu, pro protisměrnou elektroforézu na agarozovém gelu, elektrofokusaci, pro značení radioizotopy, ke studiu hormonálních receptorů, pro experimentální práce v cytogenetice a genetickém inženýrství s cílem pomocí vybraných metod a antigenů stanovit včasnou diagnostiku a monitorování onemocnění.

Description

Vynález se týká zpracování vzorků lidské i zvířecí nádorové a kontrolní takzvané zdravé tkáně. Výsledkem je imunologicky účinná antigenní frakce.

Antigen, který se získává z lidské i zvířecí nádorové tkáně i z tkání zdravých jedinců, se dále používá v různých testech. Literární údaje o způsobu, jakým se antigen připravuje, jsou často rozporné a nejednotné. Liší se a není sjednocen postup odběru materiálu při operaci. Nebývá zajištěn přesný odběr materiálu histopatologem erudovaným v příslušném oboru, například materiál pro antigen plicníbyměl odebírat histopatolog pro obor plicní, pro gynekologické antigeny z oboru gynekologie atd. Vzorky nejsou uloženy v jednotné bance za jednotných podmínek zmražení, pokud nejsou ihned zpracovány. Způsob centrífugace bývá různý (rozličné g). Získané frakce nemají standardně upravené množství proteinů a obsah imuniaktivní složky je v takto připravených preparátech různý.

Podle dosavadní praxe si jednotlivá pracoviště vyrábějí z nádorů tzv. antigeny samostatně a nejednotně. Prozatím nedošlo k dohodě o sjednocení výroby. Výsledky různých testů s takovými antigeny jsou pak sice publikovatelné, ale nesrovnatelné

Způsob přípravy imunologicky funkčních frakcí získaných ze zhoubných nádorů, z šedé kůry mozkové u schizofreniků nebo ze srdečního svalu s infarktem myokardu postupnou centrifugací cytozolu a pomocí vysokotlaké gelové chromatografie podle vynálezu spočívá v tom, ze se suspernatant po poslední centrifugací pri zatizeni 90 az 110 x 10 g extrahuje fenolem v objemovém poměru 1:0,5 až 1,5 v přítomnosti iorogenního tensidu a 8 hydroxychinolinu při pil 7 až 7,5 nejméně dvakrát, získaná vodná táze obsahující směs cytoplasmatických ribonukleových kyselin se rozdělí afinitní chromatografií na koloně plněné celulózou s navázanými oligonukleotidy deoxythimidinu, polyadenylované ribonukleové kyseliny se zachytí na koloně a eluují se vodou, vodný eluát se dále dělí vysokotlakou gelovou chromatografií, sbírají se frakce o molekulové hmotnosti 3.10 až 1,5.10 , které jsou orgánově specificky aktivní v různých testech.

Jako mobilní fáze pro vysokotlakou gelovou chromatografií se používá fyziologický roztok, jako stacionární fáze se používá suspenzní kopolymer 2-hydroxyethylmethakrylátu £ ethylendiroethakrylátem s vylučovacím limitem kolony, vyjádřeným molekulovou hmotností

3.10 , velikost partikuli gelu je 32 az 40 yum, k detekci se používá diferenciální refraktonietr a UV spektrofotometr ε variabilní vlnovou délkou.

Na základě všech dosavadních zkušeností vypracovali autoři vynálezu způsob separace imunologicky aktivních frakcí z lidských i zvířecích zhoubných nádorů, který využívá k přípravě tuzemské dostupné techniky, sjednocuje postup pří manipulaci s tkáněmi a vylučuje příměs proteinů, protože separuje pouze tělu vlastní nebo cizí ribonukleové kyseliny a sice v definovatelném množství (ng na ml).

Způsob podle vynálezu vede k získání materiálu s vyšší selektivitou a imunologickou aktivitou při menší spotřebě biologického výchozího materiálu a významně nižším šumem akcesornich proteinových makromolekul. Na rozdíl od jiných způsobu přípravy imunologicky aktivních frakcí se podle vynálezu získá orgánově specifický antigen.

Získané frakce jsou použitelné jako antigeny k imunizaci a dále v různých imunologických testech pro buňkami mediovanou imunitu, pro protisměrnou elektroforézu na agarozovém gelu, ciektrofokusaci, pro značeni radioizotopy, ke studiu hormonálních receptorů, pro experimentální práce v cytogenetice a genetickém inženýrství s cílem pomocí vybraných metod a antigenů stanovit včasnou diagnostiku a monitorování choroby.

Získané frakce jsou velj.ee časnými (až několik let před vypuknutím onemocnění) pozitivními markéry lidskému tělu . ti. ribonukleové kyseliny, která pravděpodobně kontaminuje lidské i zvířecí nádory, š.-dou kůru mozkovou u schizofreniků, srdeční sval postižený infarktem myokardu, jakož i endometrium žen, které potrácejí z gynekologicky nezjistitelné příčiny a u nichž byla vyloučena jiná virová onemocněni.

Způsob přípravy imunologicky funkčních frakcí je blíže osvětlen v příkladu, který nijak neomezuje předmět vynálezu.

Příprava imunoaktivní frakce z karcinomu mammy.

Biologický materiál se odebere peroperačně za spolupráce histopatologa do sterilní nádoby, uložené v suchém ledu. Po rozmražení se zbaví tuku, eventuálně nekrotických částí, po rozstříhání se homogenizuje a homogenát se třikrát kryolyzuje při -60 a +40 °C. Poté se centrifuguje při zatížení 3,5.10^g při teplotě +4 °C po dobu 40 min. Supernatant se znovu podrobí centrifugaci při zatížení 10 g při teplotě +4 °C po dobu 60 min. Získaný spernatant, který obsahuje bílkoviny, nukleoproteiny, nukleové kyseliny a nízkomolekulární komponenty, se 15 min při teplotě místnosti extrahuje fenolem v objemovém poměru 1:1 v přítomnosti natriumdodecylsulfátu o hmotnostní koncentraci 1 % z 0,01 % hmot. 8-hydroxychinolinu a pH se upraví na 7 až 7,5.

Pomocí centrifugy při zařízení 3.10 g se oddělí vodná fáze, která se opět třepe s fenolem. Získaná vodná fáze obsahující směs cytoplasmatických ribonukleových kyselin se dále dělí na koloně naplněné oligo dT celulózou (celulóza s navázanými oligonukleotidy deoxyth.imidinu), která má afinitu k polyadenylovaným zbytkům, charakteristickým pro informační ribonukleové kyseliny. Na koloně zachycené polyadenylované ribonukleové kyseliny se promyjí vodou, vodný eluát se dále purifikuje vysokotlakou gelovou chromatografii. Kolona je naplněna gelem Separon--Hema-300 glc který je suspenzním kopolymerem 2--hydroxyethyl-methakrylátu 5 a ethylendimethakrylátu s vylučovacím limitem 3.10 .

Detekce se provádí pomocí diferenciálního refraktometru R 043 a UV průtokového spektrofotometru s variabilní vlnovou délkou. Jako mobilní fáze se používá fyziologický roztok. Imunologicky aktivní a orgánově specifický antigen se získá v oblasti odebraného eluátu az 50 cm pri vlnové délce 340 nm.

Stejným způsobem se odebírá materiál z jakékoliv experimentální i lidské nádorové i kontrolní zdravé tkáně, z šedé kůry mozkové schizofreniků i zdravých osob, se srdečního svalu s infarktem myokardu i zdravého, přičemž u potrácejících žen se použije jako antigen materiál zhotovený z lidského karcinomu endometria a stejným způsobem se zpracuje.

Claims (3)

1. Způsob přípravy imunologicky funkčních frakcí z lidských a zvířecích zhoubných nádorů, popřípadě z šedé kůry mozkové schizofreniků nebo ze srdečního svalu s infarktem myokardu, postupnou centrifugaci cytozolu a pomocí vysokotlaké gelové chromatografie, vyzná-3 rující se tím, že se supernatant po poslední centrifugaci při zatížení 90 az 110.10 g extrahuje fenolem v objemovém poměru 1:0,5 až 1,5 v přítomnosti ionogenního tensidu a 8-hydroxychinolinu při pH 7 až 7,5 nejméně dvakrát, získaná vodná fáze obsahující směs cytoplasmatických ribonukleových kyselin se rozdělí afinitní chromatografii na koloně plněné celulózou s navázanými oligonukleotidy deoxythimidinu, polyadenylované ribonukleové kyseliny se zachytí na koloně a eluují se vodou, vodný eluát se dále dělí vysokotlakou gelovou chromatografii a sbírají se frakce o molekulové hmotnosti 3.±0^J až 1,5.10^, které jsou imunologicky a orgánově specificky aktivní. ²

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že jako mobilní fáze pro vysokotlakou gelovou chromatografii se používá fyziologický roztok, jako stacionární fáze se používá suspenzní kopolymer 2-hydroxyethylfliethak.rylátu s ethylendimethakrylátem s vylučovacím limitem

5 ¹

3 ...Ί0 o velikosti částic gelu 32 až 40 /Um.