CS254706B1

CS254706B1 - A method for preparing immunologically functional fractions from human and animal malignancies

Info

Publication number: CS254706B1
Application number: CS84453A
Authority: CS
Inventors: Anna Jandova; Jiri Coupek; Jaroslav Sanitrak; Karel Motycka; Otakar Mach; Jan Pekarek
Original assignee: Anna Jandova; Jiri Coupek; Jaroslav Sanitrak; Karel Motycka; Otakar Mach; Jan Pekarek
Priority date: 1984-01-19
Filing date: 1984-01-19
Publication date: 1988-01-15
Also published as: CS45384A1

Abstract

Způsob spočívá v tom, že se supernatant po poslední centrifugaci při zatížení 90 až 110 x 10^ g extrahuje fenolem v objemovém poměru 1:0,5 až 1,5 v přítomnosti ionogenního tensidu a 8- -hydroxychinolinu při pH 7 až 7,5 nejméně dvakrát, získaná vodná fáze obsahující směs cytoplazmatických ribonukleových kyselin se rozdělí afinitní chromatografií na koloně plněné celulózou s navázanými oligonukleotidy deoxythimidinu, polyadenylované ribonukleové kyseliny se zachytí na koloně a eluují se vodou, vodný eluát se dále dělí vysokotlakou gelovou chromatografii, sbírají se frakce o mole5 4 kulové hmotnosti 3.10 az 1,5.10 , ktere jsou orgánově specificky aktivní v různých, převážně imunologických testech. Získané frakce jsou použitelné jako antigeny k imunizaci a dále v různých imunologických testech pro buňkami médiovanou imunitu, pro protisměrnou elektroforézu na agarozovém gelu, elektrofokusaci, pro značení radioizotopy, ke studiu hormonálních receptorů, pro experimentální práce v cytogenetice a genetickém inženýrství s cílem pomocí vybraných metod a antigenů stanovit včasnou diagnostiku a monitorování onemocnění.The method consists in that the supernatant after the last centrifugation at a load of 90 to 110 x 10^ g is extracted with phenol in a volume ratio of 1:0.5 to 1.5 in the presence of an ionic surfactant and 8- -hydroxyquinoline at pH 7 to 7.5 at least twice, the obtained aqueous phase containing a mixture of cytoplasmic ribonucleic acids is separated by affinity chromatography on a column filled with cellulose with bound deoxythymidine oligonucleotides, polyadenylated ribonucleic acids are captured on the column and eluted with water, the aqueous eluate is further separated by high-pressure gel chromatography, fractions with a molecular weight of 3.10 and 1.5.10 are collected, which are organ-specifically active in various, mainly immunological tests. The obtained fractions can be used as antigens for immunization and in various immunological tests for cell-mediated immunity, for reverse agarose gel electrophoresis, electrofocusing, for radioisotope labeling, for the study of hormone receptors, for experimental work in cytogenetics and genetic engineering with the aim of determining early diagnosis and monitoring of diseases using selected methods and antigens.

Description

Vynález se týká zpracování vzorků lidské i zvířecí nádorové a kontrolní takzvané zdravé tkáně. Výsledkem je imunologicky účinná antigenní frakce.The invention relates to the processing of samples of human and animal tumor and control so-called healthy tissues. The result is an immunologically active antigen fraction.

Antigen, který se získává z lidské i zvířecí nádorové tkáně i z tkání zdravých jedinců, se dále používá v různých testech. Literární údaje o způsobu, jakým se antigen připravuje, jsou často rozporné a nejednotné. Liší se a není sjednocen postup odběru materiálu při operaci. Nebývá zajištěn přesný odběr materiálu histopatologem erudovaným v příslušném oboru, například materiál pro antigen plicníbyměl odebírat histopatolog pro obor plicní, pro gynekologické antigeny z oboru gynekologie atd. Vzorky nejsou uloženy v jednotné bance za jednotných podmínek zmražení, pokud nejsou ihned zpracovány. Způsob centrífugace bývá různý (rozličné g). Získané frakce nemají standardně upravené množství proteinů a obsah imuniaktivní složky je v takto připravených preparátech různý.The antigen, which is derived from human and animal tumor tissue as well as from tissues of healthy individuals, is further used in various assays. The literature on how antigen is prepared is often contradictory and inconsistent. The procedure for material removal is different and it is not unified. Accurate collection of material by a histopathologist skilled in the art is not assured, for example, lung antigen material should have been collected by a lung histopathologist, gynecological antigens from the gynecology field, etc. Samples are not stored in a single bank under uniform freezing conditions unless processed immediately. The method of centrifugation is different (different g). The fractions obtained do not have a standardized amount of proteins and the content of the immuniactive component varies in the preparations thus prepared.

Podle dosavadní praxe si jednotlivá pracoviště vyrábějí z nádorů tzv. antigeny samostatně a nejednotně. Prozatím nedošlo k dohodě o sjednocení výroby. Výsledky různých testů s takovými antigeny jsou pak sice publikovatelné, ale nesrovnatelnéAccording to current practice, individual workplaces produce so-called antigens from tumors separately and inconsistently. There is no agreement on unification of production yet. The results of various tests with such antigens are then publishable, but incomparable

Způsob přípravy imunologicky funkčních frakcí získaných ze zhoubných nádorů, z šedé kůry mozkové u schizofreniků nebo ze srdečního svalu s infarktem myokardu postupnou centrifugací cytozolu a pomocí vysokotlaké gelové chromatografie podle vynálezu spočívá v tom, ze se suspernatant po poslední centrifugací pri zatizeni 90 az 110 x 10 g extrahuje fenolem v objemovém poměru 1:0,5 až 1,5 v přítomnosti iorogenního tensidu a 8 hydroxychinolinu při pil 7 až 7,5 nejméně dvakrát, získaná vodná táze obsahující směs cytoplasmatických ribonukleových kyselin se rozdělí afinitní chromatografií na koloně plněné celulózou s navázanými oligonukleotidy deoxythimidinu, polyadenylované ribonukleové kyseliny se zachytí na koloně a eluují se vodou, vodný eluát se dále dělí vysokotlakou gelovou chromatografií, sbírají se frakce o molekulové hmotnosti 3.10 až 1,5.10 , které jsou orgánově specificky aktivní v různých testech.A method for the preparation of immunologically functional fractions derived from malignant tumors, from cerebral cortex in schizophrenics or from myocardial infarction heart muscle by successive centrifugation of cytosol and by high pressure gel chromatography according to the invention is characterized in that the suspernatant after final centrifugation is 90 to 110 x 10 g is extracted with phenol in a volume ratio of 1: 0.5 to 1.5 in the presence of iorogenic surfactant and 8 hydroxyquinoline at pH 7 to 7.5 at least twice, the aqueous phase obtained containing a mixture of cytoplasmic ribonucleic acids is separated by affinity chromatography on a packed cellulose column deoxythimidine oligonucleotides, polyadenylated ribonucleic acids are collected on the column and eluted with water, the aqueous eluate is further separated by high pressure gel chromatography, fractions having molecular weights of 3.10 to 1.5.10 are collected, which are organ specific activity in various assays.

Jako mobilní fáze pro vysokotlakou gelovou chromatografií se používá fyziologický roztok, jako stacionární fáze se používá suspenzní kopolymer 2-hydroxyethylmethakrylátu £ ethylendiroethakrylátem s vylučovacím limitem kolony, vyjádřeným molekulovou hmotnostíSaline is used as the mobile phase for high pressure gel chromatography, and a suspension copolymer of 2-hydroxyethyl methacrylate-ethylenediroethacrylate with a molecular weight exclusion limit is used as the stationary phase.

3.10 , velikost partikuli gelu je 32 az 40 yum, k detekci se používá diferenciální refraktonietr a UV spektrofotometr ε variabilní vlnovou délkou.3.10, gel particle size is 32 to 40 µm, differential refractonieter and UV spectrophotometer ε of variable wavelength are used for detection.

Na základě všech dosavadních zkušeností vypracovali autoři vynálezu způsob separace imunologicky aktivních frakcí z lidských i zvířecích zhoubných nádorů, který využívá k přípravě tuzemské dostupné techniky, sjednocuje postup pří manipulaci s tkáněmi a vylučuje příměs proteinů, protože separuje pouze tělu vlastní nebo cizí ribonukleové kyseliny a sice v definovatelném množství (ng na ml).Based on all the experience so far, the inventors have developed a method for separating immunologically active fractions from human and animal malignancies, which it uses to prepare domestic available techniques, unifies the procedure for tissue manipulation and excludes the admixture of proteins by separating only the body's own or foreign ribonucleic acids. in definable amounts (ng per ml).

Způsob podle vynálezu vede k získání materiálu s vyšší selektivitou a imunologickou aktivitou při menší spotřebě biologického výchozího materiálu a významně nižším šumem akcesornich proteinových makromolekul. Na rozdíl od jiných způsobu přípravy imunologicky aktivních frakcí se podle vynálezu získá orgánově specifický antigen.The method of the invention results in a material with higher selectivity and immunological activity with less consumption of biological starting material and significantly lower noise of accessory protein macromolecules. In contrast to other methods for preparing immunologically active fractions, an organ specific antigen is obtained according to the invention.

Získané frakce jsou použitelné jako antigeny k imunizaci a dále v různých imunologických testech pro buňkami mediovanou imunitu, pro protisměrnou elektroforézu na agarozovém gelu, ciektrofokusaci, pro značeni radioizotopy, ke studiu hormonálních receptorů, pro experimentální práce v cytogenetice a genetickém inženýrství s cílem pomocí vybraných metod a antigenů stanovit včasnou diagnostiku a monitorování choroby.The obtained fractions are useful as antigens for immunization and further in various immunological tests for cell-mediated immunity, for agarose gel counter electrophoresis, ciektrofocusing, for radioisotope labeling, for hormone receptor study, for experimental work in cytogenetics and genetic engineering using selected methods and antigens to establish early diagnosis and monitoring of the disease.

Získané frakce jsou velj.ee časnými (až několik let před vypuknutím onemocnění) pozitivními markéry lidskému tělu . ti. ribonukleové kyseliny, která pravděpodobně kontaminuje lidské i zvířecí nádory, š.-dou kůru mozkovou u schizofreniků, srdeční sval postižený infarktem myokardu, jakož i endometrium žen, které potrácejí z gynekologicky nezjistitelné příčiny a u nichž byla vyloučena jiná virová onemocněni.The obtained fractions are largely early (up to several years before disease outbreak) positive markers for the human body. ti. ribonucleic acid that is likely to contaminate human and animal tumors, gray cortex in schizophrenics, heart muscle affected by myocardial infarction, as well as the endometrium of women who abort for a gynecologically undetectable cause and in whom other viral diseases have been excluded.

Způsob přípravy imunologicky funkčních frakcí je blíže osvětlen v příkladu, který nijak neomezuje předmět vynálezu.The preparation of immunologically functional fractions is illustrated in more detail by the following non-limiting example.

Příprava imunoaktivní frakce z karcinomu mammy.Preparation of immunoactive fraction from mammary carcinoma.

Biologický materiál se odebere peroperačně za spolupráce histopatologa do sterilní nádoby, uložené v suchém ledu. Po rozmražení se zbaví tuku, eventuálně nekrotických částí, po rozstříhání se homogenizuje a homogenát se třikrát kryolyzuje při -60 a +40 °C. Poté se centrifuguje při zatížení 3,5.10^g při teplotě +4 °C po dobu 40 min. Supernatant se znovu podrobí centrifugaci při zatížení 10 g při teplotě +4 °C po dobu 60 min. Získaný spernatant, který obsahuje bílkoviny, nukleoproteiny, nukleové kyseliny a nízkomolekulární komponenty, se 15 min při teplotě místnosti extrahuje fenolem v objemovém poměru 1:1 v přítomnosti natriumdodecylsulfátu o hmotnostní koncentraci 1 % z 0,01 % hmot. 8-hydroxychinolinu a pH se upraví na 7 až 7,5.The biological material is collected peroperatively in collaboration with a histopathologist into a sterile container stored in dry ice. After thawing, it is freed of fat or possibly necrotic parts, after shearing it is homogenized and the homogenate is cryolyzed three times at -60 and +40 ° C. It is then centrifuged at a load of 3.5 x 10 < 6 > g at +4 [deg.] C. for 40 min. The supernatant is again centrifuged at a load of 10 g at + 4 ° C for 60 min. The resulting supernatant, which contains proteins, nucleoproteins, nucleic acids and low molecular weight components, is extracted for 15 min at room temperature with 1: 1 by volume phenol in the presence of 1% w / w sodium dodecyl sulfate at 0.01% w / w. The pH is adjusted to 7 to 7.5.

Pomocí centrifugy při zařízení 3.10 g se oddělí vodná fáze, která se opět třepe s fenolem. Získaná vodná fáze obsahující směs cytoplasmatických ribonukleových kyselin se dále dělí na koloně naplněné oligo dT celulózou (celulóza s navázanými oligonukleotidy deoxyth.imidinu), která má afinitu k polyadenylovaným zbytkům, charakteristickým pro informační ribonukleové kyseliny. Na koloně zachycené polyadenylované ribonukleové kyseliny se promyjí vodou, vodný eluát se dále purifikuje vysokotlakou gelovou chromatografii. Kolona je naplněna gelem Separon--Hema-300 glc který je suspenzním kopolymerem 2--hydroxyethyl-methakrylátu 5 a ethylendimethakrylátu s vylučovacím limitem 3.10 .The aqueous phase is separated with a 3.10 g centrifuge and shaken again with phenol. The obtained aqueous phase containing a mixture of cytoplasmic ribonucleic acids is further separated on a column packed with oligo dT cellulose (cellulose with attached deoxyth.imidine oligonucleotides) having an affinity for the polyadenylated residues characteristic of the ribonucleic acid information. The column of captured polyadenylated ribonucleic acids is washed with water, and the aqueous eluate is further purified by high pressure gel chromatography. The column is packed with Separon-Hema-300 glc gel which is a suspension copolymer of 2-hydroxyethyl methacrylate 5 and ethylene dimethacrylate with an exclusion limit of 3.10.

Detekce se provádí pomocí diferenciálního refraktometru R 043 a UV průtokového spektrofotometru s variabilní vlnovou délkou. Jako mobilní fáze se používá fyziologický roztok. Imunologicky aktivní a orgánově specifický antigen se získá v oblasti odebraného eluátu az 50 cm pri vlnové délce 340 nm.Detection is carried out using differential refractometer R 043 and UV flow spectrophotometer with variable wavelength. Saline is used as the mobile phase. The immunologically active and organ-specific antigen is obtained in the region of the collected eluate up to 50 cm at a wavelength of 340 nm.

Stejným způsobem se odebírá materiál z jakékoliv experimentální i lidské nádorové i kontrolní zdravé tkáně, z šedé kůry mozkové schizofreniků i zdravých osob, se srdečního svalu s infarktem myokardu i zdravého, přičemž u potrácejících žen se použije jako antigen materiál zhotovený z lidského karcinomu endometria a stejným způsobem se zpracuje.In the same way, material is taken from any experimental and human tumor and control healthy tissue, from the cerebral cortex of schizophrenics and healthy persons, from myocardial infarction and healthy heart, and in abortive women, material made from human endometrial cancer and the same process.

Claims

Process for the preparation of immunologically functional fractions from human and animal malignancies, optionally from the cerebral cortex of schizophrenics or from myocardial infarction heart muscle, successive centrifugation of cytosol and by high pressure gel chromatography, characterized in that the supernatant after the last centrifugation at a load of 90 to 110.10 g it is extracted with phenol in a volume ratio of 1: 0.5 to 1.5 in the presence of ionic surfactant and 8-hydroxyquinoline at pH 7 to 7.5 at least twice, the obtained aqueous phase containing a mixture of cytoplasmic ribonucleic acids is separated by affinity chromatography on a column packed with cellulose-bound oligonucleotide deoxythymidine, polyadenylated RNA is captured on the column and eluted with water, aqueous eluate is further separated by high gel chromatography to collect fractions of molecular weight of the third ± 0 to 1,5.10 ^ ^J which are immunologically and organ specific active. ²

2. A process according to claim 1, wherein the mobile phase for high pressure gel chromatography is saline, the stationary phase is a suspension copolymer of 2-hydroxyethylfliethacrylate with ethylene dimethacrylate with an elimination limit.

5 ¹

3 ... Ί0 having a gel particle size of 32 to 40 µm.