CS254163B1 - Sposob přípravy ohromolytického substrátu na stanovenie /(1-3) glukanázy - Google Patents

Description

,234163 3 4

Vynález sa týká sposobú přípravy chromo-lytického substrátu na stanovenie /3(1-+3)glukanázy, EC 3.2.1.6. V posledných rokoch osvědčeným sposo-bom stanovenia polysacharid-hydrolázovýchenzymových aktivit je sposob fotokolorimet-rický. Spočívá v tom, že sa enzým necháreagovat s nerozpustným polysacharidovýmgélom, na ktorom je kovalentne viazanévhodné farbivo. Počas hydrolýzy účinkompřítomných příslušných enzýmov polysacha-rid-hydroláz stává sa chromolytický gél po-stupné rozpustný, pričom intenzita zafarbe-nia supernatantu je úměrná aktivitě enzý-mu. Pochopitelné, toto platí iba za předpo-kladu, že polysacharidový chromolytickýgél je dokonale přístupný molekule enzýmua že kovalentne viazané farbivo na polysa-charid nemá inhibičný účinok na samotnúenzýmovú reakciu [K. Kenedy: Advances incarbohydrate chemistry and biochemistry,29, (1974) str. 350—376). Sú známe· aj u náspostupy na přípravu roznych polysacharido-vých chřomolytických substrátov Čs. AO192 210, 203 676, 219 575, 224 156. Jedná saváčšinou o polysacharidy v přírodě najčas-tejšie sa vyskytujúce a teda najviac výskum-ne i priemyslovo využívané. Příprava vodo-rozpustných chřomolytických substrátov ivzácnějších polysacharidov je predmetomČs. AO 237 101.

Je známe, že rožne polysacharidy sa líšiachemickou a nadmolekulovou strukturou,ktorá sa musí respektovat pri príprave chro-molytického substrátu vhodného pre stano-venie príslušnej enzýmovej polysacharid--hvdrolázovej aktivity. K málo preštudovaným mikrobiálnym po-lysacharidom patří /3(1-+3) glukán, ktorý jesúčasťou buněčných stien kvasinkovýchmikroorganizmov, z ktorých sa izoluje. Je topolvsacharid nerozpustný vo vodě a velmimálo reaktívny pri následných modifikač-ných reakciách tak v alkalickom alebo kys-lom prostředí. Z uvedených dovodov je pria-me viazanie farbiva na tento polysacharidnevhodné za účelom přípravy dostatočne cit-livého chromolytického substrátu pre sta-novenie /3(1-+3) glukanázovej enzýmovej ak-tivity.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že v pr-vom stupni sa /3(1-+3) glukán alkylu je ety-lénoxidom alebo kyselinou monochlórocto-vou v alkalickom prostředí na stupeň sub-stitúcie 0,2 až 0,3 a v druhom stupni sa naalkyl-polysacharid naviaže farbivo dvojsod-ná sol kyseliny 8-amíno-5-[3-(sulfoetylsul-f onyl) anilíno) 6-antrachinón-sulf onove j v množstve 10 až 12 % hmot. na hmotnost po-lysacharidu pri teplote 15 až 25 °C a kon-centrácii hydroxidu sodného 1,0 až 2,0 %hmot. po dobu 2 až 4 hodin. Připravený chromolytický gél má napúča-cí objem 12 až 15 ml/g, čo je dostatočné prepožadovanú citlivost na stanovenie enzýmo-vej aktivity. Optimálny stupeň substitúcie jepre hydroxyetyl 0,2 a pre karboxyetyl 0,3.

Pri týchto úrovniach substitúcie má chro-molytický gél maximálně výtažky a ešte sapri vymývaní volného farbiva nerozpúšťa vovodě. Pri vyšších stupňoch substitúcie sa užrýchlo zvyšuje rozpustnost vo vodě, čím do-chádza ku značnej strate chromolytickéhogélu pri premývaní. Hydroxyetyl-derivát salepšie vyfarbuje ako karboxymetyl-derivát,posledný sa však 1'ahšie připravuje. Výhodou nového postupu přípravy chro-molytického gélu /3(1-+3) glukánu je, že u-možňuje připravit z tohto málo reaktívne-ho polysacharidu dostatočne citlivý enzýmo-vý substrát vhodný pre kolorimetrické sta-novenie príslušnej enzýmovej aktivity. Příklad 1 200 g suchého /3(1-+3) glukánu izolované-ho z buněčných stien kvasiniek Saccharo-myces cerevisiae sa suspenduje v 200 mletanolu (o koncentrácii 96 % hmot.), v kto-rom sa predom rozpustilo 75 ml vodnéhoroztoku hydroxidu sodného o koncentrácii600 g. 1_1. Suspenzia sa mieša pri teplote20 °C po dobu 40 minút a potom sa přidávápo častiach 40 g kyseliny monochlóroctovej.Reakčná zmes sa potom postupné vyhrievana teplotu 55 °C v priebehu 1 hodiny a prikonečnej teplote 55 °C sa reakčná zmes u-držuje za stálého miešania celkove 3 hodi-ny. Potom sa volný hydroxid sodný neutra-lizuje konc. kyselinou octovou, reakčná zmessa přefiltruje a na filtri sa nerozpustný kar-boxymetyl-/3 (1-+3) glukán premýva najprvdestilovanou vodou, potom alkoholom a al-kohol sa odsaje. Produkt sa suspenduje v 2litroch hydroxidu sodného o koncentrácii2 % hmot. a pri teplote 15 °C sa po častiachpřidává v priebehu 30 minút farbivo dvoj-sodná sol' kyseliny 8-amono-5-[3-(sulfoetyl-sulfonyl) anilíno ] 6-antrachinónsulfonove j vmnožstve 20 g. Potom sa do roztoku přidá100 g octanu sodného a reakčná zmes sapri teplote 15 až 25 °C mieša 4 hodiny. Po u-končení vyfarbovania sa reakčný roztokzneutralizuje konc. kyselinou octovou, od-saje sa nerozpustný produkt a premýva sana filtri destilovanou vodou tak dlho, ažpremývacia voda je bezfarebná. Nakoniecsa voda z produktu vytěsní etanolom a na-koniec sa etanol odpaří vol'ne na vzduchualebo vo vákuovej sušiarni pri teplote do60 °C. Vysušený produkt sa vytriedi na si-tách a použije sa frakcia s vefkosťou čas-tíc medzi 80 až 250 μΐη. Hotový· gél má napú-čací objem vo vodě 12 až 15 ml. g-1 a jevel'mi dobrým substrátom na stanovenie/3 (1-+3) glukanázy. Příklad 2 K 200 g suchého práškového /3(1-+3) glu-kánu izolovaného z buněčných stien kvasi-niek Saccharomyces cerevisiae sa za mieša-nia přidává 200 ml vodného roztoku hydro-

Claims (1)

1. 254 5 xidu sodného o koncentrácii 20 % hmot. anechá sa aktivovat po dobu 1 hodiny. Po-tom sa aktivovaný glukán zaleje v zatvore-nom reaktore s 2 litrami acetonu a privádzasa cez ventil postupné 22 ml etylénoxidu.Reakčná zmes sa vyhřeje na 40 °C a pri tej-to teplote sa reakčná zmes udržuje 2 hodi-ny. Po ukončení reakcie sa volný hydroxidsodný v reaktore neutralizuje konc. kyse-linou octovou, nerozpustný produkt hydro-xyetyl-/3(l-3) glukán sa odfiltruje, premyje 6 3 6 vodou, nakoniec etanolom a ďalej sa vyfar-bí podl'a postupu v příklade 1 s 12 g farbi-va dvojsodnej soli kyseliny 8-amíno-5-[3-- (sulf oetylsulf onyl) anilíno ] 6-antrachinón-sulfonovej. Výsledný produkt /3(1-3) glukáns kovalentne viazaným farbivom je velmidobrým substrátom na stanovenie /3(1—3)-glukanázovej enzýmovej aktivity. Vynález může nájsf široké použitie v ana-lytike enzýmov, biotechnologii pri meraní/3(1-3) glukanázovej enzýmovej aktivity. PREDMET Sposob přípravy chromolytického substrá-tu na stanovenie ^(l-3)glukanázy, EC 3.2.1,-6 vyznačený tým, že v prvom stupni sa/3(1-3) glukán izolovaný z buněčných stienkvasiniek Saccharomyces cerevisiae alkylu-je etylénoxidom, alebo kyselinou mono-chlóroctovou v alkalickom prostředí na stu-peň substitúcie 0,2 až 0,3 a v druhom stupni sa na alkyl-polysacharid naviaže farbivo;dvojsodná sol kyseliny 8-amíno-5-[3-(sulfo-etylsulf onyl) anilíno ] 6-antrachinónsulf ono-vej v množstve 10 až 12 % hmot. na hmot-nost polysacharidu pri teplote 15 až 25 °Ca koncentrácii hydroxidu sodného 1,0 až 2,0percent hmot. po dobu 2 až 4 hodin.