CS253971B1 - Production method of high active biological effective compounds immobilized on carrier - Google Patents

Production method of high active biological effective compounds immobilized on carrier Download PDF

Info

Publication number
CS253971B1
CS253971B1 CS849621A CS962184A CS253971B1 CS 253971 B1 CS253971 B1 CS 253971B1 CS 849621 A CS849621 A CS 849621A CS 962184 A CS962184 A CS 962184A CS 253971 B1 CS253971 B1 CS 253971B1
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
carrier
biologically active
compounds
active compounds
alkylene
Prior art date
Application number
CS849621A
Other languages
English (en)
Other versions
CS962184A1 (en
Inventor
Peter Hermann
Jiri Coupek
Kornelia Smalla
Ingo Willhardt
Jaroslava Turkova
Original Assignee
Peter Hermann
Jiri Coupek
Kornelia Smalla
Ingo Willhardt
Jaroslava Turkova
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Peter Hermann, Jiri Coupek, Kornelia Smalla, Ingo Willhardt, Jaroslava Turkova filed Critical Peter Hermann
Priority to CS849621A priority Critical patent/CS253971B1/cs
Priority to DK544085A priority patent/DK544085A/da
Priority to DE8585308832T priority patent/DE3582032D1/de
Priority to AT85308832T priority patent/ATE61404T1/de
Priority to EP85308832A priority patent/EP0186347B1/en
Priority to JP60275223A priority patent/JPS61181376A/ja
Priority to US06/807,339 priority patent/US4775714A/en
Priority to AU51074/85A priority patent/AU597568B2/en
Publication of CS962184A1 publication Critical patent/CS962184A1/cs
Publication of CS253971B1 publication Critical patent/CS253971B1/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6427—Chymotrypsins (3.4.21.1; 3.4.21.2); Trypsin (3.4.21.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/087—Acrylic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/811—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an inorganic carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • General Factory Administration (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)

Description

Vyiález se týká universálního způsobu výroby vysoce aktivních biologicky účinných sloučenin imooilisací kovalentní vazbou na mkroporewních polymertních nosičích v přítomnoosi vyšších koncentrací anorganických solí.
Výzkum a vyižití imobilisovaných biologicky účinných sloučenin představuje·v . dnešní době rozsáhlý obor vývojových i aplikačních projektů se značným prakticýýrn využitím.
Příprava a aplikace nerozpustných enzymů vazbou rozpustného enzymu na nosič dovoluje opakované použití katalytického systému ve vsádkovém nebo průtokovém uspořádání reakce,při níž má nerozpustný enzym funkci specifického heterogenního katalysát oiu..Toto uspořádání katalytické enzymatické reakce usnadňuje následné oddělení enzymu od substrátu a reakčních produktů a při násobném nebo kontinuálním provedení snižuje náklady a usnadňuje automatisaci procesu.
Při interakcích substrátu s kovalentně iaobiliovvanýa enzymem je rychlost enzym^^y katalysované reakce závislá nejen na typu a aktivitě enzymu ale i na charakteru vazby enzymu na nosič/na fysikálně chemických vlastnostech nosiče (velikost a distribuce pórů,hydroCilocst povrchu αtd.)Hydrodynlaaiiké parametry soustavy,rychlost průtoku subitrátu,těplcta atd. rovněž významně ovlivňují konečný výtěžek reakce.Podrobné poznatky o faktorech ovlivňujících ěozymaticCy katalysované reakce s využitím iaoЪilisovaolých enzymů byly získány i při studiu procesů v preparatiOzám měřítku (pei^i^(^:i^:Li^a^cyl^^sa) (I.CHIB.ATA,IImaЪilizěd Enzymes, J.Wiley and Sons.New York, 1970).
Velmi rozsáhlé použití nacházeei imooblisované biologicky aktivní látky v afinitní ihromatoggafii.Tato metoda využívá schopnc^si celé řady biologicky účinných sloučenin vytvářet sorpční kommlexy s ji^ný^mi sloučeninaai,př‘iěeaž charakter interakce· je velmi specifický a rěveгsibiloí.Jě -li jedna ze složek soípčního komplexu vázána na pevný nosič^ak za vhodných podmínek dochází z roztoku k selektivní sorpci pouze těch sloučěnin,Ctěré se vyznač^í specifickou afinitou k vázané látce.Pomocí nosiče lze sorpční kommlex snadno oddeěit od ostatních komponent v roztolm.Změnou podmínek (pH.iontová síla, teplota,přídavek komaPtiiivoích sorbátů a pod. ^čoclnáax
253 971 k disociaci sorpčního komplexu a k oddělení rozpustné komponenty od složky,která zůstává chemicky vázána na nosiči. Tento postup nachází uplatnění při isolaci a čištění enzymů, inhibitorů enszym,protilátek, antigenů,rozpustných bílkovin atd.Imobilisace bioaktivních sloučenin se s výhodou využívá v biochemické analyse při aplikaci radioaktivně značených sloučenin nebo při optickém značkování.
Jako nosiče biologicky účinných sloučenin se používá celé řady mattriálújjako na příklad poresního skLa,silikagelu, aktivního uhlí,celulosy a jejích derivátů,škroiu,tgtIOsy, sírovaných polydextranůsyitetických polymerů a kopolymerů (akrylamid, styren, polyamii,pol;yiiallernnnhddid,pplyakryláty, polymethh.akry.áty atd.).Některé typy jsou nevýhodné,protože nesou donogenní funkční skuppny,jiné se vyznačují silnými nespecifickými sorpčními vlastnostmi pro bílkoviny^i-né pak mají nedostatečnou aetChnidCil,hhdnoOyУickou,aikroЪiální nebo temickou stabilitu či nevhodnou distribuci velikosti pórů.Tím se značně zužuje okruh jejich použití.Homogenní hydro filní nosiče poly9tcharidovéhl typu většinou nesmějí vyschnout, což ztěžuje jejich skladování a dopravu.
Věěšinu uvedených nedostatků nemma! nosiče připravené klpolynatisací 2-hydrlxyalkylaethaakydátů s'alkylendiatthakryláty^teié jsou pio daeliiistční reakci aktivovány subbtitucí na hydroxylové skupině (J.OOUPEK,J.TUOOVVÁ,O.HUB.BOKOVB a M.KKIVVK0VÁ,(Á.A.0.č. 167530).
Další podrobné studie mechanismů daoOilistce biologicky účinných sloučenin ukázaly,že kovaa-eiitní vazba musí .být hydrolyticky co nej stabilnější,což nemůže zaručit na příklad aktivace brlmakynemmmtaonl, sutUlddckk,esttrlvá a další vazebné skupiny^a^ ntjvýhodnější se ukazuje iaaOiiistce vyιžžvatící reaktivních epoxidových skupin podle následujícího schématu:
—CHO- C — CHO + HON - Prot,—— CHO-C—-CHO—NH--Prot.
2\/22 2 i 2 . ,c _ . 0 OH kdffe Pnt-biag-í bílkovinný zbytek.
Pokusy s daoOiiittcí na ^polymeru gldcindlaethakrylátu s tthylenddaethakrylátea (J.OUJ0OVB,K.bUHA,M.PABANÍ0OVÁ,
253 971
- .>
D.VAJCNEROVÁ,F.SVEC and. J.K^:L^LJ3b3ch^en^^BBophys.J^cta,5424 (1978)162) ukázaly.že reaktivní glycidyl rneethkrylátcvé skupiny uzavřené v hustě zesilované matrici kcpclymeru nelze plně využít prc imoCiiisaci a jejich následná desaktivace je cbtížná.Pictc iyl s výhodou užit jakc ncsič mmkroppresní kcpolymer 2-hydrcxyethylmmehyykylátu s ethylendimethakiyláeem aktivcivaný epichlcichydrinem,který cisahuje epcx;y?rcpylcvé funkční skupiny pcee na vnitřním pcvrchu pórů (J.TUKTOVÁ, KbBLÁHA,J.OOIÁČ!EK,JvAAJCNER,A.FF.TPRYCHOVÁ and J.COTPEK.Jb Chucnatocr., 215(1981 )l65-179i?a na pcvrchu částic.
Při přímé vaziě iílkcviny na epcxy^rcpylcvý derivát hydrcxyethylmmehhkiryl-átcvéhc kcpclymeru je však v některých případech výtěžek imociliscvané aktivity příliš nízký.Tentc nedocsatek^který se vyskytuje i u řady jiných známých aktivací syntetických pclymeraích eosičů,cdstIaňujz předmět tchctc vynálezu.
Jehc pcdstatcu je způscb výrciy vyscce aktivních imoiiiiscvaných iiclcgicky aktivních slcučenin prc chemickcu přeměnu látek enzymmaickcu katalyscu a prc preparativní a analytické separační techniky pcmocí vyscce stabilní kovalentní vazby iiclcgicky účinných slcučenin na mmkrocpresní pclymerní ncsič, charakterisováný tím,že se iiclcgicky účinné slcučeniny váží na aktivcvaný ncsič v přítomnocti ancrganických socí,přidaných v koncentraci 0,5 až 3,0 mocllitB,Udaná koncentrace ancrganických sclí při vazeiné reakci vyvolává cmezení nehc eliminaci sclvatační cbálky iílkc>vinných mocekul.V prvním stupni pak dochází k hydrcfciní adscrpci iiclcgicky účinných slcučenin na ncsič a ve druhém stupni pak účinné slcučeniny reagují s funkčními skupinami nosiče za vzniku kovaleniní vazhy.
Mkn^cpc^e^í^ixí pclymerní nosiče jscu vyirány ze skupiny syntetických kcpclymerů hydгcxyalkylmeZhakrylátů (alkyl C£až C^) s alkyl end.imethakryláZem (alkylen C^až C^jkcpclymerů styrenu s divinylbenzenem neic s alkylendimzthaIryláeem (alkylen (jaž C4), kcpclymerů glycidylmethakrylátu s ethylendimethakrylátem, pcresníhc skla neic silikkgzlu.
- 4 253 971
Polyoeemí nosič pe před imobilisačni reakcí muaí akti- * vovat.Reaktivní funkční skupiny jsou vybrány ze skupiny epoxidů, aldehydů,prlmárních nebo sekundárních aminů,karboxylu a thiolů.S výhodou má mmkkoooresní polymermí nosič rigidní strukturu a sférický tvar. Pro ověření účinku vynálezu byly vybrány sloučeniny ze skupiny enzym, iiúiibitorů enzynm,případně imunoaativiních bílkovin.
Soli,jejioiž příoomnost při vazbě bioaktivníci sloučenin podstatně zvyšuje výtěžek navázané bílkoviny i výtěžek aktivity, jsou vybrány ze skupiny síranů a fosforečnanů amonných, a sodných.Teplota reakce je určena reaktivitou funkčních skupin nosiče i bioaktivní sloučeniny určené k imoHiisaci a leží v oboru -5° až 30°C.Reakce probíhá při pH 3-10 po dobu 0,5 až 40 hodin.
Způsob imoHlisace biologicky účinných sloučenin v přítomno oti vyšších k(lncenOгací anorganických solí podle vynálezu má velmi universální charakter a jeho οθ^^οΙ^^ byl podrobně studován a . ověřen na řadě vzájemně se.lišících biologicky účinných sloučenin.V dalším je předmět vynálezu vysvětlen a doložen na řadě příkladů,které však jeho rozsah nijak neomeeují.
Příklad 1.
mg enzymu aoinoacylasy (3·5·1·14·) bylo rozpuštěno v 5 ml 0,2M roztoku fosfátového tlumiče pH 7.Po úplném rozpuštění bílkoviny byl přidán síran amonný tak,aby konečná koncentrace soli činila 1,75 irno/l rautlku.Plté bylo přidáno 100 mg kopo^me^ 2-hydroxyethylmethakiry.átu s ethylendimethakrylátem (SEPARON 1000 E,vylučovací limit 2.106daltlO o velikosti částic 40-80/Um s kapacitou povrchově vázaných epoxidových skupin 1,77 mmol/gg.Pro urychlení penetrace roztoku do mkTOppresní struktury nosiče byla suspense udržována po 5 minut ve vakuu . vodní pumpy (15 mm Hg slljOce).Iooaillsace acylasy probíhala po dobu 30 hodin za mírného třepání suspense při teplotě 4°C.Po skončené im^oii^isační reakci byl nosič promyt tluoivýo roztokem (fosfát pH 7) a 1 M roztokem NaCl.
- 5 253 971
Následně byl stanoven obsah vázané bílkoviny a její enzymtická aktivita.Výtěžek vázané předložené bílkovině a 20% aktivity činil 10% vzhledem k vzhledem k vázané bílkovině.
Příklad 2.
analogicky jako v příkladu 1 s tím
Reakce byla provedena rozdílem,že probíhala v přítomnooti optimálního mnnossví monohydrogenfosfátu amonného (1,5 moO/1).Výtěžky aktivity byly stejné jako v příkladu 1.
Příklad 3.
mg enzymu th^ermitasy (3.4,21.14) bylo rozpuštěno v ml 0,2 M fosfátového tlumiče pH 8,0,Byl přidán roztok síranu amonného tak,že celková koncentrace soli činila 2,0moo/l, Stejně jako v příkladu 1 bylo přidáno 100 mg nosiče obsahujícího epoxiskupiny na kopolymeru 2-hydroxyethylmeehakir/látu s ethylendimethakrylátem (1,77 mnoo/g) a suspense byla po dobu 5 minut evakuována na vodní pum^^.R^^kce trvala v tomto případě 40 hodin při teplotě 20°C za mírného aktivity čin.l 10%.
třepání.Výtěžek
Příklad 4· v příkladu 3 s tím soli (síranu sodného) byla pro-vedena analogicky jako optimální koncentrace přidané mol/1.Reakční podmínky a výtěžek aktivity imob
Reakce rozdíl em,že činila 1,25 lioo varného enzymu byly shodné jako u příkladu 3.
Příklad 5.
mg enzymu peniciliiacylasy (3·5·1·11) v 5 ml fosfátlumiče (0,2M,pH 8) bylo přidáno 100 mg aktivovaného o velikosti částic 100 - 200^um a pak po částech naroztok síranu amonného tak,že konečná koncentrace soli 2,5 moo/1.Reakce'trvala 40 hodin při 4°C za mírného
K tového nosiče sycený činila třepání. Zpracování reakční směsi bylo provedeno stejně jako v příkladu 1„Výtěžek aktivity činil 45%·
- 6 Příklad. 6. 253 971
Κ 5 mg enzymu elastasy (3.4.21.36.) v 5ml 0,2 M fosfátového tlumiče pH 8,0 bylo přidáno 100 mg kopolymeiu 2-hydroxy?ropyl mmehakrylátu sírovaného butylendimethakrylátmm (vyltoovací l.imto 8. lO^ddLtonjVeliítos^t částic 80-10°/Um) aktivovaného epoxiskupinami (kapacCta 1,25 mml/g).Byl přidán roztok hydrogensÍránu sodného na konečnou koncentraci 1,5 molll.Při 4°C trvala reakce za mírného třepání 20 hodin. Výtěžek aktivity 17%.
Příklad 7.
mg cystathion-^-syithetasy (4.2.1.22.) bylo rozpuštěno v 5 ml 0,2 M TRIS HC1 pufru pH 8,7,přidáno 100 mg nosiče stejného složení jako v příkladu 1 a roztok síranu amonntho,jehož optimální koncentrace činí 2,5 mo1/1.Reakce trvala 40 hodin při teplotě-4°C.Zpracování reakční směsi bylo provedeno dle příkladu ^Výtěžek aktivity činil 35%.
Příklad 8. .
K 1 mg karboxyoeptidasy A (3.4.17.1.) rozpuštěné v 5 ml
0,2 M fosfátového tlumiče bylo přidáno 100 mg nosiče připraveného kopolyneeisaci glycidylmetbakrylátu s ethylendimethakrylátm 1:2 (vylučovací limit 110°ddlton,velikost částic 100200/um).Vazebná reakce probíhala v přá^-^om^<^£^i^:i 2,0 mml/1 síranu amonného při 4°C po dobu 20 hodin.Po zpracování produktu dle příkladu 1 byl stanoven výtěžek aktivity na předloženou bítkovitu,ktpiý činil 11,5 %·
Příklad 9.
mg lnti-clthptsit D-IgG bylo rozpuštěno v 5 ml 0,2 M fosfátového tlumiče JH 8,0 a bylo vázáno na 100 mg nosiče stejného jako v příkladu 1 v přítomiosti 1,5 mml/1 síranu amonného po dobu 2< hodin při 25°C za mírného třepání.Po skončení reakce byl nosič s vázanou bílkovinou odsát,promyt výchozím tlumičem,tlpltěn do kolony a testován pro aplikaci v afinitní chromettggilii d^epsi-nu D-IgG.
- 7 Příklad 10.
253 971
250 mg nosiče podle příkladu 1 bylo při 50°C ponecháno reagovat s 1 g hexamehylendiaminu v 5 ml vody při mírném promíchávání po dobu 3 hodin.Reakční směs byla promyta vodou. Vlhký nosič po promyyí byl rozmíchán ve 2 ml 5% vodného roztoku glutaiaildehydu,třepán 20 hodin,promyt vodou na negativní reakci s difenylhydrazínem.Vlhký aktivovaný nosič byl smíchán s roztokem trypsin-inhibitoiu isolovaného z brambor (1 mgrnll.bylly přidány 2 ml 1,25M NagSO^ a po 5 hodinách mírného třepání při 25°C byla reakční směs odssáta a nosič byl promyt vodou.Tllbilisová'iý inhibitor byl použit pro afinitní chromát grafii trypsinu.
Příklad 11.
mg chyB^Ty^i^ (3*4í21«1*) bylo rozpuštěno v 5 ml 0,2 M fosfátového pufru pH 8 a ke siisí bylo přidáno 100 mg nosiče na basi epox;y?ropylového derivátu silikagelu (vylučovací temte 5· 10k Mal;on tkapacita 0,5 mml/.g).Po ^ídav^ síranu amonného (2,5 moo/1) byla vazebná reakce provedena po dobu 20 hodin při teplotě 30°C.Po promytí podle příkladu 1 byl stanoven výtěžek aktivity vázaného činil 8,5%. '
Příklad 12.
Pokus byl proveden analogicky jako v příkladu 11 s tím rozdílem,že jako nosiče bylo . použito poresního skla se středním průměrem pórů 500 Ž . Nosič byl aktivován reakcí s triethoxyepooάy)ropylsílanel.Výtěžek aktivity vázaného chynmorypsinu činil 9,7%.
Příklad 13.
mg trypsinu (3.4.21.4«) bylo rozpuštěno v 5 ml 0,2 M fosfátového tlumiče pH 8 a přidáno 100 mg nosiče dle příkladu PPři konieniraci síranu amonného 2,5 moo/1 trvala reakce po dobu 20 hodin při pokojové teplotě.
Příklad 14»
253 971 mg pepsinu (3·4·23·1·) ' v 5 ml O1 M acetátového tlimíče pH 4,0 bylo smícháno analogicky jako v příkladu 1 se 100 mg nosiče. Při optimální koncentraci síaanu amonného 1,25 mol/1 probíhala reakce 24 ho (din při teplotě 25OC.Pl promytí podLe příkladu 1 byl nalezen výtěžek imooiiisace aktivity 15%.
Příklad 15.
K 10 mg insulinu v 5 ml 0,05 M fosfátového tlimiče pH 8 bylo přidáno 100 mg epoxy-aktivovaného nosiče podle příkladu 1. Vazebná reakce probíhala v přítomnosti monthhУrolentosfátu sodného 1,75 md/l při 25°C po dobu 50 hodin.Vázaný insulin byl použit pro afinithí chrsmaáosrrafi protilátek proti insulinu z attiinsultlovéhs sera v 0,1 M barbiturátu sodném pH 8,8 s obsahem 3% albuminu.Desorpce protilátek byla provedena roztokem 3 M HCI·

Claims (7)

1.Způsob výroby vysoce aktivních imobilisovaných biologicky účinných sloučenin pro chemickou přeměnu, lát ek,nnz patičkou katalysu a pro amlytické a prepar^t^vní separační techniky hydrolyticky stabilní ko^vilentní vazbou b&ogicky účinných sloučenin na makroopresní polymerní nosiče, vyznačený tím,že se biologicky účinné sloučeniny váží na aktivovaný makroopresní polymerní nosič v přítomnooti roztoků anorganických solí přidaných v koncennracích 0,5-3 moo/1,přičmž udaná koncentrace anorganické soli příoomné při vazebné reakci vyvolává dvoustupňovou reakci, v jejímž prvním stupni doelhází k hydrofobní adsorpci biologicky účinné sloučeniny na nosič a ve druhém stupni pak biologicky účinná látka reaguje s nosičem za vzniku kovalentni vazby,
2. Způsob podle bodu 1} vyznačený tím,že mmaroppresní polymerní nosiče jsou vybrány ze skupiny kopolymerú hydroxyalkylmethakrylátů (alkyl C^až ) s alkylendimethakryláeem (alkylen ^^až C^^kopolymerů styrenu s divinylbenzenem nebo s alkylendimethakrylátem (alkylen C^až C^^kopolymerů gLycidylmeehakr^látu s alkyl^endim^e^l^í^l^i^r^y^i^^ty (alkylen C^iaž C^), poresního skla nebo silikagtlu.
3. Způsob podle bodů 1 a 2^ vyznačený tím,že m.aroppresní polym mírní nosiče obsahují funkční skupiny vybrané ze skupiny epoxidů,aldehydů,primárních nebo sekundárních aminú,karboiylu nebo thiolů.
4. Způsob podle bodů 1až3,vyznačený tm m,že makroporesní polymerní nosiče mj. rigidní strukturu a sférickou fornu.
5. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím,že kovalentně vázané biologicky účinné sloučeniny jsou vybrány ze skupiny enzymů, inhibitoru enzymů a imunoaktivních bílkovin. 2g3 971
6. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že soli jsou vybrány ze skupiny natřiumfosfátů, amoniumfosfátů,natrium~ sulfátů a amoniumsulfátů.
7. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím,že vazebná reakce probíhá v teplotním oboru -5 až 30°C,v oboru pH 3 až 10 a po dobu 0,5 až 50 hodin.
CS849621A 1984-12-11 1984-12-11 Production method of high active biological effective compounds immobilized on carrier CS253971B1 (en)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS849621A CS253971B1 (en) 1984-12-11 1984-12-11 Production method of high active biological effective compounds immobilized on carrier
DK544085A DK544085A (da) 1984-12-11 1985-11-25 Fremgangsmaade til fremstilling af paa en baerer immobiliserede, hoejaktive, biologisk virksomme forbindelser
DE8585308832T DE3582032D1 (de) 1984-12-11 1985-12-04 Verfahren zur herstellung von auf einem traeger immobilisierten hochaktiven biologischen verbindungen.
AT85308832T ATE61404T1 (de) 1984-12-11 1985-12-04 Verfahren zur herstellung von auf einem traeger immobilisierten hochaktiven biologischen verbindungen.
EP85308832A EP0186347B1 (en) 1984-12-11 1985-12-04 Method for producing high-active biologically efficient compounds immobilized on a carrier
JP60275223A JPS61181376A (ja) 1984-12-11 1985-12-09 固定化された生物学的活性化合物の製造方法
US06/807,339 US4775714A (en) 1984-12-11 1985-12-10 Method for producing highly-active biologically active compounds immobilized on a carrier
AU51074/85A AU597568B2 (en) 1984-12-11 1985-12-10 Method for producing high-active biologically efficient compounds immobilized on a carrier

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS849621A CS253971B1 (en) 1984-12-11 1984-12-11 Production method of high active biological effective compounds immobilized on carrier

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS962184A1 CS962184A1 (en) 1987-05-14
CS253971B1 true CS253971B1 (en) 1987-12-17

Family

ID=5445756

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS849621A CS253971B1 (en) 1984-12-11 1984-12-11 Production method of high active biological effective compounds immobilized on carrier

Country Status (8)

Country Link
US (1) US4775714A (cs)
EP (1) EP0186347B1 (cs)
JP (1) JPS61181376A (cs)
AT (1) ATE61404T1 (cs)
AU (1) AU597568B2 (cs)
CS (1) CS253971B1 (cs)
DE (1) DE3582032D1 (cs)
DK (1) DK544085A (cs)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4529289A (en) * 1988-10-17 1990-05-14 Sepracor, Inc. Process for the covalent surface modification of hydrophobic polymers and articles made therefrom
US5166319A (en) * 1989-10-10 1992-11-24 Brunswick Corporation Interfacial condensation of bioactive compounds and the site-specific compounds and conjugates thereof
US5200471A (en) * 1990-11-05 1993-04-06 Minnesota Mining And Manufacturing Company Biomolecules covalently immobilized with a high bound specific biological activity and method of preparing same
DE4238389A1 (de) * 1992-11-13 1994-05-19 Bayer Ag Verfahren zur Durchführung immundiagnostischer Nachweise
WO1994022918A1 (en) * 1993-03-29 1994-10-13 Minnesota Mining And Manufacturing Company Method of coupling ligands within porous supports (p.e. azlactone) and uses thereof
CN115646466A (zh) * 2022-11-11 2023-01-31 南通裕弘分析仪器有限公司 核壳结构的有机无机杂化颗粒的制备方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CS179184B1 (en) * 1975-07-25 1977-10-31 Stanislav Vozka Method for preparation of precisely spherical particles of silica gel with controlled size and controled size pores.
US4440903A (en) * 1978-06-30 1984-04-03 Ramot University Authority For Applied Research And Industrial Development Ltd. Dihaloisocyanide derivatives of polymers for coupling nucleophiles
CS216992B1 (en) * 1980-07-21 1982-12-31 Miroslav Stol Composite polymere material for the biological and medicinal utilitation and method of preparation thereof
DE3106456A1 (de) * 1981-02-21 1982-10-07 Röhm GmbH, 6100 Darmstadt Verfahren zur herstellung von perlfoermigen, hydrophilen, gegenueber proteinen bindungsaktiven traegerpolymeren
DE3112336A1 (de) * 1981-03-28 1982-10-07 Röhm GmbH, 6100 Darmstadt "verfahren zur spaltung von milchzucker"
US4451568A (en) * 1981-07-13 1984-05-29 Battelle Memorial Institute Composition for binding bioactive substances
DE3243591A1 (de) * 1982-11-25 1984-05-30 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Vinylencarbonat-polymerysate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre anwendung

Also Published As

Publication number Publication date
DK544085D0 (da) 1985-11-25
EP0186347B1 (en) 1991-03-06
DK544085A (da) 1986-06-12
EP0186347A2 (en) 1986-07-02
AU5107485A (en) 1986-06-19
EP0186347A3 (en) 1987-08-19
CS962184A1 (en) 1987-05-14
ATE61404T1 (de) 1991-03-15
DE3582032D1 (de) 1991-04-11
US4775714A (en) 1988-10-04
JPS61181376A (ja) 1986-08-14
AU597568B2 (en) 1990-06-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4229537A (en) Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands
US5092992A (en) Polyethyleneimine matrixes for affinity chromatography
CA1334042C (en) Process for the preparation of a material for affinity chromatography
US4352884A (en) Carrier having acrylate copolymer coating for immobilization of bioactive materials
JP3499869B2 (ja) 活性化支持体材料、それらの調製および使用
US5085779A (en) Polyethyleneimine matrixes for affinity chromatography
EP0316492B1 (en) Polymeric matrix for affinity chromatography and immobilization of ligands
AU2007278481A1 (en) Solid support
JPH0144725B2 (cs)
US4582875A (en) Method of activating hydroxyl groups of a polymeric carrier using 2-fluoro-1-methylpyridinium toluene-4-sulfonate
CS253971B1 (en) Production method of high active biological effective compounds immobilized on carrier
EP0153763B1 (en) Affinity chromatography matrix with built-in reaction indicator
US4808530A (en) Protein immobilization by adsorption of a hydrophobic amidine protein derivative to a hydrophobic surface
EP0403700B1 (en) Polyethyleneimine matrixes for affinity chromatography
JP2010014716A (ja) 電気的中性の親水性外側表面を有する化学的に変性された多孔質材料
JPS61191700A (ja) エポキシ−ポリアルキレンイミン共重合体による生体物質の固定
CA1239357A (en) Method of activating polymeric carrier
JPS6155415B2 (cs)
Ayhan et al. Protein A immobilized poly (methylmethacrylate-co-hydroxyethylmethacrylate) microbeads for IgG adsorption
RU2029564C1 (ru) Адсорбент для извлечения атерогенных липопротеинов из биологических жидкостей
DK171394B1 (da) Understøtning eller bærer i fast fase, immobiliseret enzym i fast fase på en sådan understøtning, ligandbundet chromatografiaffinitetsmatrix samt fremgangsmåde til adskillelse eller rensning af et stof fra opløsning under anvendelse af understøtningen
CA1298578C (en) Polymeric matrix for affinity chromatography and immobilizaton of ligands
JPH0126709B2 (cs)
JPH0359080B2 (cs)
CS204402B1 (cs) Způsob immobilizace -fruktosidázy na nerozpustný nosič