CS204402B1 - Způsob immobilizace -fruktosidázy na nerozpustný nosič - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu immobilizace $-truktosidázy na nerozpustný nosič, obsahující vhodné reaktivní skupiny vázané na pevné kostře schopné reakce s komplementárními skupinami enzymu, které nejsou součásti aktivního centra, tzn. Se nedochází k výraznému snížení aktivity immobilizovaného enzymu.

Jedním z hledisek při výběru způsobu immobilizace je volba spojení nosiče s enzymem. V současné době se používá čtyř základních způsobů:

1. Fyzikální adsorpce, která ovšem v řadě případů nesplňuje požadavek pevné vazby mezi enzymem a nosičem a při změně vnějších podmínek (pH, iontová síla prostředí atd.) může dojít k vymytí enzymu z nosiče.

2. Zachycení a uzavření enzymu v gelové matrici při kopolymerizaci probíhající _k v přítomnosti.enzymu. Přitom však většinou dochází k výrazné ztrátě aktivity enzymu, nebol iniciační reakce, jakož i růst řetězců probíhají za podmínek enzymům nepříznivých (vysoká energie, teploty, přítomnost volných radikálů apod.).

3. Opouzdření roztoků enzymů ve formě drobných kapek propustnou membránou z přírodních nebo syntetických polymerů. Tento způsob immobilizace enzymů má také četné nevýhody. Při mechanickém porušení membrány při manipulaci může dojit ke kontaminaci zpracovávaného

204 402

204 402 média volným enzymem. Kromě toho i mechanická pevnost těchto částeček, při dostatečně tenké membráně umožňující rychlou difúzi, je nízká.

4. Kovalentnl vazba enzymu k nosiči prostřednictvím reaktivních skupin nosiče a od povídajících skupin enzymu, které nejsou součástí jeho aktivního centra. V současné době existuje již velký výběr reakci, respektive aktivaci, umožňujících provést tento způsob za velice jemných podmínek, při nichž nedochází k inaktivaci enzymu. Na druhé straně nosič mívá od samého počátku již žádané mechanické i fyzikální vlastnosti a enzym bývá vázán natolik pevně, aby změnou vnějších podmínek nedocházelo k jeho eluci do zpracovávaná ho média. Při samotné vazbě enzymu k nosiči se uplatňují zejména skupiny bočních řetězců aminokyselin, jako je například -aminoskupina lysinového zbytku, karboxylové skupina kyseliny asparagové nebo glutamová, hydroxylová skupina tyrosinu nebo šeřinu a dalěl. Podle typu skupin, naznačených v předchozí větě, se potom voli i způsob aktivace, respek tive funkční skupina nosiče.

Bez ohledu na funkční skupiny je na nosič kladena řada požadavků, postulujících vlastnosti ideálního nosiče:

1. Dobré mechanické, fyzikální a hydrodynamická vlastnosti.

2. Reaktivní skupiny vázané na dostatečně dlouhém postranním řetězci, který je fle· xibilnl.

3. Hydrofilita.

4. Chemická stabilita.

5» Dostatečná kapacita.

6. Vhodná reaktivita bez složité aktivace.

7. Minimální nespecifická eorpee.

8. Dostatečně velký povrch přístupný reakci.

Jedním z mála nosičů, splňujících většinu těchto požadavků, je například polymerní materiál obsahující reaktivní epoxidové skupiny podle čs. autorského osvědčeni č. 175112 jenž skýtá pro vazbu enzymů řadu možnosti. Jednou z možnosti je například přímá vazba amfolytických látek, popsaná v čs. autorském osvědčeni č. 185717.

Tento nosič má ověem i dalěl vlastnosti, která lze s výhodou použit v oblasti immobilizace enzymů. Jednoduchým způsobem je možná modifikovat v něm obsaženou epoxidovou skupinu a získat polymerní nosič se skupinami výrazně odlišnými. Tak například reakce s diaminem, jak je popsána v čs. autorském osvědčeni č. 162535, vede k produktu, který obsahuje volné primární aminoskupiny, přičemž původní vlastnosti výchozího polymeru s epoxidy zůstávají zachovány. Tyto volná aminoskupiny jsou potom schopny následující reakci vázat látky, obsahujíc! například karbonylovou skupinu, za vzniku tzv. Sehiffovy báze.

204 40

Tato reakce je však z hlediska vazby enzymů málo obvyklá, nebol samotný enzym zpravidla neobsahuje dostatek reaktivních karbonylových skupin. S výhodou však lze této reakce použít, jestliže se jako aktivačního činidla použije dialdehydu, čímž vznikne z jedné jeho karbonylové skupiny Schiffova báze (iminomethylenová vazba), zatímco zbývající druhá skupina je k dispozici pro vazbu enzymu prostřednictvím jeho aminoskupin. Další možností je chemická modifikace enzymu takovým způsobem, aby nakonec obsahoval aldehydovou skupinu,

-Fruktoaidáza (invertéza, aacharáza, -fruktofuranosid-fruktohydroláza, E.C.

3.2.1.26) je enzymem skupiny hydraláz, tzn. hydrolyzuje sacharózu na fruktózu a glukózu.

-Fruktoaidáza je svojí chemickou podstatou glykoprotein o molekulové hmotnosti 260 000, z čehož proteinová složka má mol. hmotnost 135 000. 50 % tvoří mannan á 3 % glúkosamin. Každá molekula obsahuje na 20 až 30ti místech shluk vázaného mannanu.

Literatura skýtá v principu tři typy nosičů pro immobilizaci $-fruktosidázy:

a) anorganické nosiče, jako jsou sklo, betonit, cihlové drl, které se aktivují například thionylchloridem, kyanurchloridem nebo -aminopropyltriethoxysilanem, tedy vesměs látkami obtížnými při manipulaci;

b) přírodní polymery, jako jsou deriváty celulózy, kolagen, želatina, které jsou však napadány mikroorganismy a jejichž mechanické vlastnosti nesplňují potřebné technologické požadavky pro provozní aplikaci;

c) syntetické polymery, jako jsou polyakrylamidový gel, póly(akrylonitrii), aminostyrenový gel, fenolformaldehydové pryskyřice, kopolyméry 2-methoxy-4-formylfenylmethakrylátu, póly(vinylalkohol).

Při použití všech uvedených nosičů se enzym immobilizuje všemi dříve vyjmenovanými způsoby.

Společným znakem dřívějších řešení, který překonává způsob podle vynálezu, je poměrně nízká zachovaná relativní aktivita (tj. aktivita navázaného množství enzymu, vztažená ke stejnému množství enzymu nativního), dosahující hodnot 0,5 % (polyaminostyren) až 80 % (polyakrilamidový gel), a současně i nevýhodné mechanické a hydrodynamické vlastnosti.

Předmětem vynálezu je způsob immobilizace/^ -fruktosidázy na nerozpustný nosič, spočívající v tom, že nosič na bázi glycidylových esterů, který obsahuje primární aminoskupiny a je reakčním produktem vzniklým chemickou reakcí zesilovaného polyglycidylakrylétu nebo polyglycidylmethakrylétu s amoniakem nebo primárním diaminem, se aktivuje glutardialdehydem, načež se při teplotě 0 až 80 °C smísí s roztokem/^ -fruktosidázy a při pH směsi 4 až 8 ponechá reagovat 0,1 až 30 hodin.

Immobilizovaná/^ -fruktpsidáza se může potom použít při výrobě invertního cukru, tj. směsi fruktózy a glukózy ze sacharózy, který je okamžitě použitelný i pro potravinářské účely. Běžně používaná metoda inverze sacharózy roztokem kyseliny sirové tento produkt většinou nedává, protože invertní cukr obsahuje stopová množství kovů v potravinářství

204 402 nepřípustných, jako je například arsen. Metoda používající ionexů má nevýhodu v nízká pro duktivitě. Rovněž použití nativního enzymu není příliš výhodné, nebol enzym má pouze jednorázové užití a bílkovina zůstává po reakci přítomna v konečném produktu, což není žádou cí nebo se musí pracně odstraňovat.

V dalším je vynález blíže objasněn příklady použití, aniž hy se jimi omezoval.

Příklad 1 g kopolymeru glycidylmethakrylát-ethylendimethakrylát (specifický povrch 60 m²/g, obsah epoxidů 3,05 mmol/g) byl v Erlenmeyerově baňce 3 hodiny zahříván epolu β 5 ml ethylendiaminu na teplotu 80 °C za občasného míchání protřepáním. Pevná fáze byla odfiltrována a na skleněné fritě promývána vždy 100 ml 0,5 N HC1, vodou, 0,5 N NaOH a opět vodou. Vysušený produkt obsahoval 1,8 mmol/g primárních aminoskupin.

Vzniklý nosič byl suspendován 3 hodiny ve 100 ml vody a po odeátí promyt 200 ml fosfátového pufru pH ³ 6,9. Potom byl opět suspendován ve 20 ml téhož pufru a spolu s 8 ml glutardialdehydu (25 %ní roztok ve vodě) třepán 18 hodin při teplotě 37 °C, promyt 400 ml pufru pH ³ 6,9 a 200 ml vody.

K 0,2 g aktivovaného nosiče, promytého 100 ml pufru pH ³ 6,9, bylo přidáno 15 ml téhož pufru a 10 ml konc. roztoku enzymu (cca 200 mg bílkoviny na 1 g nosiče). Reakce probíhala při teplotě 4 °C 15 hodin a 2,5 hodiny při teplotě 18 °C. Pevná fáze byla promyta pufrem β NaCl (vždy po 500 ml). Specifická aktivita immobilizovaného enzymu je 17,971 a relativní aktivita 71 %·

Příklad 2

Immobilizace byla provedena postupem podobně jako u příkladu 1 a tím rozdílem, že k suspenzi nosiče v roztoku glutaraldehydu v pufru pH = 5 bylo po 18 hodinách reakce přidáno 10 ml roztoku/^ -fruktosidázy a reakce probíhala dále při teplotě 4 °C 20 hodin. Specifická aktivita preparátu byla 15,0 u kat a relativní aktivita 60 %·

Příklad 3 g kopolymeru glybidylakrylát-ethylendimethakrylát (specifický povrch 35 nr/g, obsah epoxidů 3,05 mmol/g) bylo suspendováno v 10 ml 25 %nlho vodného roztoku amoniaku a po dobu 5. hodin zahříváno pod zpětným chladičem na teplotu 90 °C. Po separaci pevné fáze a promytí, shodném jako v příkladě 1, bylo nalezeno v produktu 1,7 mmol/g primárních aminoskupin.

Vzorek nosiče byl suspendován 2 hodiny v 10 ml fosfátového pufru pH 7 a potom přidáno 5 ml 25 %ního roztoku glutardialdehydu a při teplotě 25 °C třepáno 1 hodinu, potom promyto 100 ml stejného pufru, 100 ml vody a 100 ml acetátového pufru pH = 4.

Po odsátí bylo k nosiči přidáno 10 ml koncentrovaného roztoku /íř-fruktosidázy v 15 ml acetátového pufru pH = 4 a při teplotě 37 °C třepáno 30 hodin. Preparát byl odseparován a promyt jako v příkladě 1. Specifické aktivita činila 16,3^ kat a zachovaná relativní aktivita 65 %·

Příklad 4

Kopolymer glycidylmethakrylát-2-hydroxypropylendimethakrylát (specifický povrch o m /g, obsah epoxidů 3,1 mmol/g) (1 g) reagoval s ethylendiaminem (5 ml) při teplotě 80 °C po dobu 3 hodin. Potom byl promyt jako v příkladě 1, vysuSen a nalezeno, že obsahuje 1,2 mmol/g navázaného diaminu. Reakce s glutardialdehydem probíhala shodně jako v příkladu 3. Aktivovaný nosič byl po promytí suspendován v 10 ml fosfátového pufru pH » 8 a přidáno 10 ml koncentrovaného roztoku enzymu.

Immobilizace potom probíhala při teplotě 80 °C 6 minut. Produkt byl odsát na skleněné fritě a promyt vždy 500 ml 1 %ního roztoku povrchově aktivní látky (Tween 20), fosfátového pufru pH - 8 a 0,5 N NaCl v témže pufru. Specifická aktivita činila 3,8^ kat.

Příklad 5 g kopolymerů glycidylmethakrylát-divinylbenzen (specifický povrch 45 m /g, obsah epoxidů 2,6 mmol/g) byl v autoklávu ochlazen na teplotu -70 °C a převrstven 5 ml kapalného amoniaku. Po uzavření byl autokláv zahříván 3 hodiny na teplotu 100 °C, opět ochlazen na teplotu 20 °G a otevřen. Vzorek byl převeden na Petriho misku a při teplotě 20 °C ponechán v exikétoru 1 hodinu za vakua vodní vývěvy. Produkt v suchém stavu obsahoval 2,1 mmol/g primárních aminoskupin.

Shora uvedený nosič byl 3 hodiny třepán s 50 ml fosfátového pufru pH = 7, přidáno 10 ml 20 $ního roztoku glyoxalu ve vodě a třepáno další 3 hodiny při teplotě 25 °C. Bez promývání byl k suspenzi přidán koncentrovaný roztok enzymu (20 ml) a směs třepána při teplotě 0 °C 10 hodin. Přebytečná činidla byla odstraněna stejným způsobem jako v příkladě 4. Immobilizovaný preparát vykazoval aktivitu 4,1kat a zachycené relativní aktivita byla 26 «.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob immobilizace^ -fruktosidézy na nerozpustný nosič, vyznačený tím, že nosič na bázi glicidylových esterů, který obsahuje primární aminoskupiny a je reakčním produktem vzniklým chemickou reakcí zesilovaného polyglycidylakrylátu nebo polyglycidylmethakrylátu s amoniakem nebo primárním diaminem, se aktivuje glutardialdehydem, načež se při teplotě 0 až 80 °C smísí s roztokem/^ -fruktosidézy a při pH směsi 4 až 8 ponechá reagovat 0,1 až 30 hodin .