CS252600B1 - Bakteriální kmen Bacillus subtilis CCM 3853 - Google Patents

Abstract

Řešení se týká bakteriálního kmene Bacillus subtilis bez termorezistentních spor syntetizujícího exocelulární proteázy, uloženého v československé sbírce mikroorganismů v Brně pod číslem CCM 3 853. Výhodou mutantního kmene je to, že při kultivaci v tekutých nebo pevných médiích nevytvoří v průběhu 48 hodin při 28 °C termorezistentní spory. Bakteriální kmen Bacillus subtilis lze využít k průmyslové produkci exocelulárních proteáz, použitelných například k přípravě pracích prášků i k hydrolýze a odstraňování různých bílkovinných materiálů.

Description

Vynález ae týká nového bakteriálního kmene Bacillus substilis CCM 3 853 bez thermorezistentních spor a syntetizujícího exocelulární proteázy. Charakteristickými znaky nového kmene je schopnost růstu a tvorby proteáz ve stejných tekutých živných médiích jako výchozí kmen, v nichž však nevytvoří během 48 hodin při 28 °C termorezistentní spory. Spory nevytvoří během 48 hodin ani ve zvláštním sporulačním médiu.

Je známo, že při výrobě exocelulárních enzymů, včetně proteáz, pomocí bacilů, je produkt kontaminován termorezistentními sporami produkčního kmene. To představuje určitou nevýhodu jak z hygienického hlediska, tak i z technologického hlediska,, protože se zvyšují nároky na následnou sterilizaci fermentačního zařízení. Současně se zvyšuje nebezpečí kontamiace jiných fermentací a výrobků termorezistentními sporami Bacillus subtilis.

Naproti tomu je většina asporogenních mutant bacilů neschopná tvořit exocelulární proteázy.

Tyto nevýhody odstraňuje .bakteriální kmen Bacillus subtilis bez termorezistentnich spor a syntetizující exocelulární proteázy. Po mutagenním působení a výsevu mutant na pevné agarové živné médium obsahující kasein byla sledována současně u jednotlivých kolonií jak schopnost tvořit proteázu, tak i změněný tvar kolonie, který obvykle indikuje ztrátu schopnosti sporulovat. Tento postup vedl k získání mutanty syntetizující exocelulární proteázy bez termorezistentních spor.

Kmen byl získán po působení mutagenu ethylmetansulfonátu na vyklíčené spory následujícím způsobem: spory výchozího kmene 115 (AO 201 638, uloženého v čs. sbírce mikroorganismů pod číslem CCM 3 622) byly aktivovány v 0,1 M fosfátovém pufru o pH 7,2 zahřátím na 70 °C po dobu 15 minut a vyklíčeny v roztoku minerálních solí o pH 7,2 doplněných glukózou (5 mg/ml) a kvasničným extraktem (0,2 mg/ml) během 1 hodiny při 35 °C. Vyklíčená kultura byla přenesena do fosfátového pufru a mutagenizována působením 0,1 M etylmetansulfonátu za třepání po dobu 17 hodin při 30 °C. Stupeň přežití vyklíčených spor byl 1%.

Mutagenizovaná kultura byla odstředěna, promyta fosfátovým pufrem a po resuspendováni ve fosfátovém pufru vyseta na kaseinový agar. Kolonie lišící se od výchozího kmene bud morfologicky, nebo velikostí zóny netráveného kaseinu byly podrobeny podrobnějšímu zkoumání. Získané kmeny byly lyofilizovány v 10% laktinu.

Dále jsou uvedeny charakteristiky vlastností nového bakteriálního kmene 115/6. Vzorek této mutanty je uložen v československé sbírce mikroorganismů v Brně pod číslem CCM/3 853.

a) Morfologická a růstová charakteristika

Výchozí kmen 115 i mutanta 115/6 jsou tenké grampozitivní tyčinky, rostoucí v médiu s minerálními solemi a glukózou 5 mg/ml většinou jednotlivě nebo ve dvojicích. Specifická růstová rychlost obou se v tomto, médiu při 30 °C pohybuje v rozmezí 0,43-0,55 h~^ (generační doba 1,3-1,6 h). Při výsevu na živnou půdu (Nutrient agar Difco) roste kmen 115 ve formě hladkých kolonií s mírně nepravidelnými okraji a mutanta ve formě velkých nízkých kolonií, uprostřed lesklých, s rýhami paprsčitě se rozbíhajícími od středu.

b) Schopnost tvořit proteázy

Výchozí sporulující kmen 115 i od něho odvozená mutanta byla kultivována za třepání 48 hodin při 28 °C v médiu obsahujícím 5% sladinku, 1 % sušených kvasnic, 2 % sušeného mléka Laktino a 5 % uhličitanu vápenatého (výchozí pH 7,5). Po 48 hodinách byly kultury odstředěny a v supernatantech stanovena proteolytická aktivita při pH 7,2 a 1% kaseinovým substrátem. Proteolytická aktivita je vyjádřena v tyrosinových jednotkách (TU/ml).

kmen

115

115/6

1. pokus 59,5 51,0

2. pokus 33,7 39,0

3. pokus 26,7 28,2

c) Schopnost tvořit termorezistentní spory

Kultury vyrostlé za 8 hodin při 30 °C v minerálním médiu s 1 % glukózy a 0,2 mg/ml kvasničného extraktu byly odstředěny a resuspendovány na optickou hustotu odpovídající 1 mg/ml sušiny ve sporulačním médiu následujícího složení MgSO^.7 I^O - 0,5 mM; KjHPO^ 10 mM; CaClj 0,3 mM; ooťan sodný 5 mM; jantaran sodný 2 mM; pH 7,2.

Kultury byly potom za třepáni inkubovány 48 hodin při 28 °C. Obsah termorezistentnich spor byl zjištován vyočkováním vzorků inaktivovaných 15 minut při 75 °C na Nutrient agar Difco Počet kolonií vyrostlých po zředění 0-10^-? byl zjištován po 24 hodinách. V rodičovské kultuře (115) byla zjištěna přítomnost 2.3χ10⁴θ termorezistentnich spor v 1 ml.

V kultuře mutanty nebyla zjištěna přítomnost žádných termorezistentnich spor. Ani mikroskopickou kontrolou nebyly u mutanty v buňkách spory zjištěny. V pokuse v produkčním sladinkovém médiu (viz b) vytvořil rodičovský kmen po 48 hodinách 2,9x10 termorezistentnich spór

Q v 1 ml (z 1,7x10 buněk/ml). Mutanta termorezistentní spory nevytvořila.

Mutantu podle vynálezu lze využít k průmyslové produkci exocelulárních proteáz, použitelných například k přípravě pracích prášků i k hydrolýze a odstraňování různých bílkovinných materiálů.

Claims (1)

1. Bakteriální kmen Bacillus subtilis CCM 3 853 bez termorezistentnich spór syntetizující exocelulární proteázy.