CS252604B1 - Bakteriální kmen Bacillus subtilis CCM 3855 - Google Patents

Abstract

Řešení se týká bakteriálního kmene Bacillus subtilis CCM 3855, bez thermo- resistentních spor e syntetizující exocelulární proteázy. Výhodou mutantní- ho kmene ve srovnání s dosud používaným kmenem a delšími sporulujícími kmeny rodu Bacillus je to, že při kultivaci v tekutých nebo pevných médiích nevytvoří v průběhu 48 hodin při 28 °C thermo- resistentní spory. Produkce exocelulár- ních proteáz kmenem je stejná nebo poněkud vyšší než u původního produkčního kmene.

Description

Vynález se týká nového bekteriálního kmene Bacillus subtilis CCM 3855 bez thermoresistentních spor a syntetizujících exocelulární proteázy. Charakteristickými znaky nového kmene je schopnost růstu a tvorby proteáz ve stejných tekutých Sivnýeh mediích jako výchozí kmen, v nichž však nevytvoří během 48 hodin při 28 °C thermoresistentní spory. Spory nevytvoří během 48 hodin ani ve zvláštním sporulaěním mediu.

Je známo, že při výrobě exocelulárních enzymů, věetn? proteáz, pomocí bacilů je produkt kontaminován thermoresistentními sporami produkčního kmene. To představuje určitou nevýhodu jak z hygienického hlediska, tak i z technologického hlediska, protože se zvyšují nároky na následnou sterilizaci fermentačního zařízení. Současně se zvyšuje nebezpečí kontaminace jiných fermentací a výrobků thermoresistentními sporami Bacillus subtilis.

Neproti tomu jé většino asporogenních mut8nt bacilů neschopná tvořit exocelulární proteázy.

Tyto nevýhody odstraňuje bakteriální kmen Bacillus subtilis bez thermoresistentních spor a syntetizující exocelulární proteázy. Po mutagenním působení a výsevu ns pevné agarové živné medium obsahující kasein byla sledována současně u jednotlivých kolonií jak schopnost tvořit proteázu, tak i změněný tvar kolonie, který obvykle indikuje ztrátu schopnosti sporulovet. Tento postup vedl k získání mutanty syntetizující exocelulární proteázy bez thermoresistentních spor.

Kmen byl získán po působení metagenu ethylmethansulfonátu na vyklíčené spory následujícím způsobem: spory výchozího kmene 115 (AO 201 63Θ, uloženého v Ss. sbírce mikroorganismů pod číslem CCM 3 622) byly aktivovány v 0,1 M fosfátovém pufru o pH 7,2 zahřátím na 70 °C po dobu 15 minut a vyklíčeny v roztoku minerálních solí o pH 7,2 doplněných glukózou (5 mg/mL) a kvasničným extraktem (0,2 mg/mL) během 1 hodiny při 35 °C. Vyklíčená kultura byla přenesena do fosfátového pufru a mutagenizována působením 0,1 M ethylmethansulfonátu za třepání po dobu 17 hodin při 30 °C. Stupeň přežití vyklíčených spor byl 1 %.

Mutagenizovaná kultura byla odstředěna, promyta fosfátovým pufrero a po resuspendování ve fosfátovém pufru vyseta na kaseinový agar. Kolonie lišící se od výchozího kmene bu3 morfologicky nebo velikostí zóny netráveného kaseinu byly podrobeny podrobnějšímu zkoumání. Získané kmeny byly lyofilizovány v 10% laktinu.

Dále jsou uvedeny charakteristiky vlastností nového bakteriálního kmene 115/13. Vzorek této mutanty je uložen v československé sbírce mikroorganismů v Brně pod číslem CCM/3 855.

a) Morfologická a růstová charakteristika

Výchozí kmen 115 i mutants 115/13 jsou tenké gram pozitivní tyčinky, rostoucí v mediu s minerálními solemi o glukózou 5 mg/mL většinou jednotlivě nebo ve dvojicích. Specifická růstová rychlost obou se v tomto mediu při 30 °C pohybuje v rozmezí 0,43 až 0,55 h^-1 (generační doba 1,3 až 1,6 h. Při výsevu na živnou půdu (Nutrient agar Difco) roste kmen 115 ve formě hladkých kolonii s mírně nepravidelnými okraji a mutente ve formě velkých nízkých kolonií, uprostřed lesklých, s rýhami paprsčitě se rozbíhajícími od středu.

b) Schopnost tvořit proteázy

Výchozí sporulující kmen 115 i od něho odvozená mutanta byl8 kultivována za třepání hodin při 28 °C v mediu obsahujícím 5 % sladinku, 1 % sušených kvBsnic, 2 % sušeného mléka Laktino a 5 % uhličitanu vápenatého (výchozí pH 7,5). Po 48 hodinách byly kultury odstředěny a v supernatantech stanovena proteolytické aktivita při pH 7,2 s 1% kaseinovým substrátem. Proteolytická aktivita je vyjádřena v tyrosinových jednotkách (TU/mL).

kmen	1. pokus	2. pokus	3. pokus
115	59,5	33,7	26,7
115/13	45,5	51,8	33,4

c) Schopnost tvořit thermoresistentní spory

Kultury vyrostlé ze 8 hodin při 30 °C v minerálním mediu s 1 % glukózy s 0,2 mg/ml kvesničného extraktu byly odstředěny a resuspendovány na optickou hustotu odpovídající 1 mg/mL sušiny ve sporulačním mediu následujícího složení (MgSO^ . 71^0 0,5 mM; Κ^ΗΡΟ^ mM; CaClg 0,3 mM; octan sodný 5 mM; jantsran sodný 2 mM; pH 7,2Í,

Kultury byly potom za třepání inkubovány 48 hodin při 28 °C. Obsah thermoresistentních spor byl zjištován vyočkováním vzorků inaktivovaných 15 minut při 75 °C na Nutrient agar —7 *

Difco. Počet kolonií vyrostlých po zředění 0 až 10 byl zjištován po 24 hodinách. V rodičovské kultuře (115) byla zjištěna přítomnost 2,3 x 10 ⁰ thermoresistentních spor v 1 mL.

V kultuře mutanty nebyla zjištěna přítomnost žádných thermoresistentních spor. Ani mikroskopickou kontrolou nebyly u mutanty v buňkách spory zjištěny. V pokuse v produkčním sladinkovém mediu (viz b) vytvořil rodičovský kmen po 48 hodinách 2.9 x 10° thermoresistentních spor v 1 ml (z 1,7 χ 10⁹ buněk/ml). Mutanta thermoresistentní spory nevytvořila. Mutantu dle vynálezu lze využít k průmyslové produkci exocelulárních proteáz, použitelných na příklad k přípravě pracích prášků i k hydrolýze a odstraňování různých bílkovinných mate riálů.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Bakteriální kmen Bacillus subtilis CCM 3 855 bez thermoresistentních spor syntetizující exocelulární proteázy.