CS244828B2 - Způsob výroby polyakrylamidového pojidla k fixaci jemnozrnných sorpčních vrstev - Google Patents

Abstract

Způsob výroby polyakrylamidového pojidla vhodného k fixaci jemnozrnných sornčních vrstev s rozsahem velikosti částic 2 až 20/um a zvláště s úzkým rozmezím velikostí částic v rozsahu Δ/im< 2 na bázi organických nebo/a anorganických látek nebo/a s případně vázanou apolární fází pro přetlakkovou jednovrstvou a'vícevrstvou chromatografií, vyznačující se tím, že se z polyakrylanidového pelového základu vzniklého ze směsi 1,6 až 2,5% vodného roztoku akrylamidu a 0,6 až 1,0% vodného roztoku -methylen-bis-akrylamidu působením katalyzátorů, jako Ν,Ν,Μ',Ν'-tetramethylethylendiaminu a aminiumperoxydisulfátu při teplotě mezi 21 a 30 °C po homogenizaci rozpouštědlem rozpustným ve vodě, vysráží pomocí acetonu, měthanolu nebo ethanolu frakce vhodná jako pojidlo, získaná sraženina se potom působením vody zkašovatí a poté se proces srážení a zkaěóvatění alespoň jednou opakuje.

Description

Způsob výroby polyakrylamidového pojidla vhodného k fixaci jemnozrnných sornčních vrstev s rozsahem velikosti částic 2 až 20/um a zvláště s úzkým rozmezím velikostí částic v rozsahu Δ/im< 2 na bázi organických nebo/a anorganických látek nebo/a s případně vázanou apolární fází pro přetlakkovou jednovrstvou a'vícevrstvou chromatografií, vyznačující se tím, že se z polyakrylanidového pelového základu vzniklého ze směsi 1,6 až 2,5% vodného roztoku akrylamidu a 0,6 až 1,0% vodného roztoku -methylen-bis-akrylamidu působením katalyzátorů, jako Ν,Ν,Μ',Ν'-tetramethylethylendiaminu a aminiumperoxydisulfátu při teplotě mezi 21 a 30 °C po homogenizaci rozpouštědlem rozpustným ve vodě, vysráží pomocí acetonu, měthanolu nebo ethanolu frakce vhodná jako pojidlo, získaná sraženina se potom působením vody zkašovatí a poté se proces srážení a zkaěóvatění alespoň jednou opakuje.

Předložený vynález se týká způsobu výroby polyakrylamidového pojidla k fixaci jemnozrnných sorpčních vrstev se speciálním vlastnostmi, která je vhodná k odpovídající fixaci jemnozrnných sorpčních vrstev se speciálními vlastnostmi, která je vhodná k odpovídající fixaci jemnozrnných sorbentů /zvláště s velikostí částic v úzkém rozmezí/ sestávajících z organické základní látky /celulózy, syntetická polyamidová pryskyřice atd./ nebo/a organická základní látky /silikagelu, oxidu hlinitého nebo silikagelu opatřeného chemicky vázanou nebo/a nevázavou apolární fází atd./ a jejich směsí na různá nosná desky a která je použitelná pro jednovrstvou a vícevrstvou chromatografii.

Srovnání vývojových směrů laboratorní přístrojová techniky ukazuje dnes zcela jednoznačný růst chromatografických technik a tato tendence se může v příštích létech ještě výrazněji projevit. Zcela zvláště se to týká způsobu kapalinové chromatografie pracujících se systémem sloupce a s rovinným uspořádáním.

Varianty tzv. vysoce účinné kapalinová chromatografie /označované zkratkou HPLC podle anglického názvu/ zaujímají již dnes - vzhledem ke svá účinnosti - vedoucí místo při analýze nejrůznějších skupin sloučenin, avšak i jejich preparativní použití je rovněž významné /viz například Engelhardt: Hochdruck-Flussigkeitschromatographie, 2. vydání, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, 1977/.

Vývoj vysoce účinné kapalinová chromatografie a výsledky, kterých se pomocí tohoto způsobu dosahuje, vyžadují rovněž základní obnovu nejrozšířenější techniky kapalinové chromatografie s rovinným uspořádáním, tj. chromatografie na vrstvě.

Nevýhoda klasické chromatografie na vrstvě /při níž mobilní fáze /směs rozpouštědel/ migruje na zakotvené či stacionární fázi /na.směsi rozpouštědel popřípadě adsorbentů/ a s rozdílnou rychlostí sebou unáší jednu nebo několik látek spočívá v tom, že doba potřebná k.vyvíjení je dlouhá a pro krátkou vzdálenost vrstvy na desce není dělení vždy úplné a teoretický počet páter je omezen.

vývoj vysoce účinné chromatografie na vrstvách /HPTLC/ představuje značný pokrok /A. Zlatkis a R. E. Kaisers High-Performance Thin-Layer Chromatography, Elsevier, 1977s a W. Bertsch, S. Hara, R. E. Kaiser a A. Zlatkis: Instrumental HPTLC, Huthig, Heidelberg, 1980/) nejdůležitějšími charakteristickými rysy této chormatografie na vrstvách je použití jemnozrnných adsorbentů na deskách a instrumentace.

Známá skutečnost, že při HPTLC je možno dosáhnout účinného rozdělení na jemnozrnné /například 5 yum/ vrstvě, ukazuje však rovněž na meze této techniky, vzhledem k tomu, že dobrého rozdělení je možno dosáhnout jen na krátké vzdálenosti, zatímco na delší vyvíjecí vzdálenosti /například 15 až 20 cm/ se - vzhledem ke zpomalení proudu rozpouštědla - zvýší difuse a skvrny /nebo pruhy/ se protáhnout.

Bylo tudíž logické uvažovat· 0 vývoji takové techniky, která by se přiblížila dobře standardisovatelným poměrům sloupcové chromatografie za zachování nenahraditelných výhod chromatografie na vrstvách /možnost vizuálního vyhodnocení, možnost použití agresivních reagencií, identifikace na způsob mapy atd./.

Tyto nároky splňuje tzv. vysokotlaká chromatografie na vrstvách /OPLC/, která spojuje výhody klasické chromatografie na vrstvách /TLC/, vysoce účinné chromatografie na vrstvách /HPTLC/ /tato technika je založena především na použití jemnozrnných vrstev na deskách/ a vysoce účinné kapalinové chromatografie /HPLC/.

Základním přístrojem je přetlaková ultramikrokomora, ve které je vrstva sorbentů /například silikagelu, oxidu hlinitého, mastku atd./ výhodně přitlačována tlakem - prostřednictvím ohebné membrány - udržovaným vodním polštářovým systémem v komoře a tím se eliminuje prostor par nad vrstvou.

244R2R

Přívodní míkročerpadlo vede eluent requlovatelným přetlakovým proudem do vrstvy sorbentu /srov. maáarský patentový spis č. 173 749, britský patentový spis 6. 1 570 760 a americký patentový spis č. 4 346 001/.

Změnou místa přívodních otvorů eluentu existuje možnost vyvíjení jak v jednom 61 dvou směrech, tak i lineárního, cirkulačního, triangulárního /anticirkulačního/.

Při používání účinná, lineární vysokotlaká chromátografie na vrstvě /OPLC/ se musí okraj vrstev sorbentu uzavřít, nejúčelněji impregnací nebo potažením vrstvou filmu z plastická hmoty a tak nemůže eluent v důsledku přetlaku unikat.

Migrace eluentu lineárním čelem se může zajistit kanálem kolem přívodního otvoru eluentu nebo připevněním drátu /desky z plastická hmoty/. Podle nového způsobu se to řeší tak, že se na vrstvu sorbentu nacházející se na nosné desce vloží vsuvná deska /která ostatně chrání polštář vodního systému, je vyměnitelná atd./, na které je v části nacházející se kolem přívodního otvoru eluentu na straně od sorbentu upraven jeden nebo několik kanálů pro vedení eluentu.

V poslední době bylo zjištěno, že vysokotlaká ultramikrokomora je vhodná k vyvíjení současně na několika vrstvách. Jestliže nosné desky vrstev jsou pro tento účel zvlášř upraveny tak, že jsou kolem místa přívodu eluentu na vrstvu perforovány v libovolném tvaru a velikosti .

Vrstvy na deskách perforované tímto způsobem se mohou umístit společně s vrstvou na desce, jejíž okraje jsou uzavřeny obvyklým způsobem, do jednoho systému, který se pak stává vhodným k vyvíjení rozdílného typu jakož i k současné analýze zejména více vzorků. To je pak vysokotlaká vícevrstvá chromatografie.

K fixaci vrstvy sorbentu hotových vrstev na deskách v případě klasické chromátografie na vrstvě /TLC/ a vysoce účinné chromatografie na vrstvě se používá lepidel na bázi nejrůznějších surovin, z nichž jsou zvláště výhodné ty, které jsou odolné vůči agresivním reagenciím a které jsou relativně inertní.

Pro skupinu dosud používaných obvyklých fixačních prostředků či lepidel /například agar-agar, škrob, polyvinylalkohol, pojyvinylacetát/ je příznačné, že tyto látky jsou citlivé vůči agresivním reagenciím, hlavně ve vodných systémech se částečně rozpouštějí a jejich používání je tudíž dnes již překonáno /srov. například německý patentový spis č. 1 442 446, str. 7 až 8, maďarský patentový sp$| č, 161 267/.

Místo těchto látek se používají inertní lepidla na bázi organických polymerů nebo anorganická lepidla, která odolávají vodným systémům, organickým rozpouštědlům a částečně také agresivním činidlům. V německém patentovém spisu č. 1 442 446 se jako pojidla používá polymeru na bázi akrylové a metakrylové kyseliny popřípadě jejich solí nebo na bázi kopolymerů ethylenu a maleinové kyseliny popřípadě jejich solí s vysokým polyraeračníra stupněm.

*>

V'německém patentovém spisu č. 1 517 kých a anorganických látek, nejrůznějšího a jejich derivátů.

929 se používá k fixaci sorbentů na bázi organictypu, polyakrylamidu.nebo/a polymetakrylamidu

V německém patentovém spisu č. 1 915 963 se opět jako pojidla používá křemičitanu alkalického kovu. Tato lepidla na bázi organických surovin mají vSak tu nevýhodu, že nejsou yždy dostatečně odolná zvláště vůči agresivním činidlům /například vůči kyselině sírové/, hlavně při vysokých teplotách vyvíjení, zbarvují se a dále pak mezi těmito lepidly se odehrává tak důležitá reakce, jako je ninhydrinová reakce, v témíře, že pak kvantitativní vyhodnocení naráží na potíže. U lepidel na bázi křemičitanu alkalického kovu je obtížné zajistit staúdarďní podmínky.

Pro tyto nevýhody jsou tudíž tato lepidla nevhodná k výrobě vrstev na deskách určených pro vysokotlakou chromatografii na vrstvách /OPLC/. Na lepidla použitelná pro tyto účely je nutno klást následující nároky:

1. Při vysokotlaká chromatografii na vrstvě nebo na více vrstvách putuje směs rozpouštědel proti nucenému proudu /pomocí přívodního čerpadla/, přičemž se mohou používat taká viskózní směsi rozpouštědel /vodné pufry atd./, a lepidlo popřípadě na něm fixovaná vrstva musí snáSet tyto vodné viskozní směsi a nesmí se rozpouštět nebo porušovat atd.

2. V přetlakové ultramikrokomoře je vrstva na desce současně vystavena významnému vnějšímu tlaku a proto musí přilepení vrstvy sorbentu snést i tento tlak.

3. Mírná citlivost lepidla vůči ninhydrinové reakci je zvláště důležitá, protože vysokotlaká chromatografie na jedné a na několika vrstvách je zvláště výhodná při kvantitativní analýze aminokyselin a peptidů. Zejména nutno zdůraznit důležitost důkazu stop aminokyseliny /například N^c -methylovaného lyseinu/, které se případ od případu ztrácejí na světle fialově zbarveném pozadí.

4. K požadavkům na vysokotlakou jednovrstvou a vícevrstvou chromatografii náleží rovněž vyřešení vedle sebe-prováděného lepení jemnozrnných sorbentů, jejichž velikost částic se pohybuje v úzkém rozmezí a které jsou na'bázi organických a anorganických látek, jakož i rpvněž bezpečné lepení libovolné směsi sorbentů na bázi organických a anorganických látek, tj. látek z různých zdrojů, přičemž ani další vlastnosti látek nesmí proces lepení ovlivňovat.

5. Značná výhoda vysokotlaké jednovrstvé a vícevrstvé chromatografie spočívá v tom, že je vhodná také pro použití zvláště jemnozrnných /například 3 až 5 yura/ a zvláště tenkých /na zp&sob filmu/ /například o tlouštce 45/um/ vrstev sorbentu na deskách, což současně umožňuje dělení, které je dokonalejší než všechna předcházející. Lepidlo musí být tudíž vhodné i k lepení takovýchto sorbentů.

6. Při vysokotlaké jednovrstvé a vícevrstvé chromatografii je - nezávisle na velikosti částic - základním požadavkem použití takových vrstev na deskách, u nichž velikost částic sorbentu spadá do úzkého rozmezí, protože v důsledku nuceného proudění rozpouštědla vede nerovnoměrné lokální proudění mezi částicemi v případě sorbentů, jejichž částice se od sebe velikostí částic podstatně odlišují, ke zvýšené podélné difusi. Fixování takovýchto sorbentů je však obtížnější než fixování sorbentů rozdílné velikosti, avšak příslušné lepidlo musí být vhodné také pro tento účel.

7. Nepochybná nevýhoda hotových vrstev ha deskách oproti plněným sloupcům spočívá v tom, že přítomnost lepidla používaného k fixování vrstev sorbentu snižuje účinnost vyvíjecího procesu a hlavně hodnověrnost naměřených hodnot. Je proto zapotřebí takové pojidlo, které by i v nepatrném množství zajistilo požadovaný stupeň fixace.

8. Při účinnosti dělení vysokotlaké jednovrstvé a vícevrstvé chromatografie hraje zvláště velkou roli teplota. Optimální hodnota teploty je vždy poněkud jiná a může být jak vysoká/ tak i nízká. Je tedy účelné vyrobit takové pojidlo, které by bylo stejně stálé vůči odpovídající desce /například hliníkové fólii/ a krycí desce /například teflonu/ v rozsahu teplot mezi +5 a +120 °c.

Úkolem předloženého vynálezu bylo vyrobit pojidlo pro zhotovování desek sloužících pro TLC- a HPTLC-chromatogtafii, které by odstranilo nedostatky dosud známých a používaných pojidel a které by uspokojovalo speciální nároky kladené na vysokotlakou jednovrstvou a vícevrstvou chromatografii, které byly uvedeny v předcházející části.

Předložený vynález je založen na poznatku, že pojivová schopnost polyakrylamidových gelů, vyrobených různých způsobem, vůči sorbentn je rozdílná v závislosti na Kvalitě, množství monomeru vytvářejícího skelet jakož i na teplotě polymerisace, a že monomery a oligomery zbylé v gelovém skeletu nepříznivě ovlivňují pojící schopnost a rozdílnou povrchovou vlastnost polyakrylamidu, a že se tudíž musí v zájmu vytčeného cíle odstranit z polyakrylamidového gelu.

Dále bylo zjištěno, že frakce vhodné k pojení vrstvy sorbentu se vysráží z gelového skeletu vyrobeného a homogenizovaného v řízeném rozsahu teplot rozpouštědlem nerozpustným. ve vodě, výhodně acetonem, a že tato frakce se může jednoduchým způsobem oddělit od monomerů a oligomerů, které nepříznivým způsobem ovlivňují vlastnosti pojidla.

Předmětem předloženého vynálezu je tudíž způsob výroby polyakrylamidového pojidla k fixaci jemnozrnných sorpčních vrstev s rozsahem velikosti částic 2 až 20/um a zvláště s úzkým rozmezím velikosti částic v rozsahu 4>um<2 na bázi organických nebo/a anorganických látek nebo/a s případně vázanou apolární fází pro přetlakovou jednovrstvou a vícevrstvou chromatografii, který spočívá v tom, že se z polyakrylamidového gelového základu vzniklého ze směsi 1,6 až 2,5 % /v textu jsou uváděna % hmotnostně-objemová, není-li uvedeno jinak/ vodného roztoku akrylamidu a 0,6 až 1,0% vodného roztoku Ν,Ν'-methylen-bis-skrylamidu působením katalyzátorů, jako Ν,Ν,Ν',Ν'-tetramethylethylemdiaminu a amoniumperoxydisulfátu při teplotě mezi 21 a 30 °C po homogenisaci rozpouštědlem rozpustným ve vodě, vysráží pomocí acetonu, methanolu nebo ethanolu frakce vhodná jako pojidlo, získaná sraženina se pak působením vody zkašovatí a poté se proces srážení a zkašóvatění alespoň jednou opakuje.

Polyakrylamidové gelové pojidlo vyrobené postupem podle vynálezu je vhodné k fixaci vrstev sorbentu pro vysokotlakou jednovrstvou a vícevrstvou chromatografii. Specifická hmotnost pojidla se pohybuje mezi 1,004 a 1,008 g/ml, jeho viskozita Ί_rel mezi 2 a 20, odolává většině ve vodě nerozpustných agresivních činidel nepropustných pro vodu /například vůči hydrogensulfátu vanilinu/, není citlivé na ninhydrin» sorpční vrstvy připravené pomocí takovéhoto pojidla nejsou rovněž citlivé na účinek vnějšího a vnitřního tlaku měřitelného v přetlakové mlkrokomoře jakož i na vyšší teploty používané při vyvíjecím procesu.

Takováto pojidla si zachovávají svou původní formu a jsou rovněž vhodná k pojení jemnozrnných a do úzkého rozsahu velikosti částic spadajících sorbentů na bázi organických nebo/a anorganických látek jakož i jejich směsí.

Vrstvy sorbentu fixované pojidlem, které bylo vyrobeno postupem podle vynálezu, odpovídají požadavkům na kvantitativní vyhodnocování lépe, než sorpční vrstvy vyrobené za použití dosud známých a používaných pojidel.

Při postupu podle vynálezu se k vodnému roztoku akrylamidu a N,N'-methylen-bis-akrylamidu přidá Ν,Ν,Ν',Ν'-tetramethylethylendiamin /TEMED/, potom se přidá další katalyzátor, účelně amoniumperoxydisulfát v rozsahu teplot ód 21 do 30 °C a získaný polyakrylamidový gel se homogenizuje v homogenizátoru.

Takto se získá kapalný, opálový roztok. 7 tohoto roztoku se přídavkem rozpouštědla rozpustného ve vodě, účelně acetonu, získá tvarohovitá sraženina, která se po uvolnění rozpouštědla přidáním původního množství vody znovu zkašovatí, a tento stupeň se podle potřeby několikrát opakuje.

Opálový vodný roztok, který vznikne při posledním převedení tvarohovitá sraženiny na kaši působením vody, je roztokem lepidla.

V následující části se popisují výhodné varianty provedení postupu podle vynálezu.

Při velmi výhodné variantě postupu podle vynálezu se vychází z 2,0% vodného roztoku, vztaženo na akrylamid, a z 0,8% vodného roztoku, vztaženo na N,N'-methylen-bis-akrylamid.

Jako katalyzátoru se používá výhodně N,N,N*,N'-tetramethylethylendiaminu /TEMED/ společně s amoniumperoxydisulfátem /NH^/jS^Op, i když se mohou používat rovněž další páry sloučenin Jakožto katalyzátor, jako například amoniumperoxydisulfát a 3-dimethylaminopropionitril nebo ribeflavin a Ν,Ν,Ν',Ν'-tetramethylethylendiamin.

Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethylethylendiamin /TEMED/ se přidává k reakční směsi přímo, zatímco amoniumperoxydisulfát se rozpustí v několika ml vody a tento roztok se přikape doprostřed nejdříve silně míchaného roztoku.

Míchání poté samo ustane. Amoniumperoxydisulfát je možno přidat k uvedenému roztoku také v pevném stavu. Také zde míchání samo ustane. Opalizace začne po 4 až 5 minutách a ustává obecně po 30 minutách.

Teplota gelovacího procesu se účelně volí tak, že se začíná při teplotě 22 až 23 °C a může se zvýšit nejvíce na 28 až 30 °C.

Ztuhlý gel se zkašovatí ve Waringově mísidle v průběhu až 5 sekund a poté je takto získaný tekutý opálový roztok vhodný k frakcionaci pomocí rozpouštědla.

Z opálového, zkašovatělého roztoku gelu se mohou vysrážet hodnotné velké molekuly rozpouštědlem rozpustným ve vodě, jako acetonem, methanolem, ethanolem atd., malé molekuly zůstávají však v roztoku.

V případě nejúčelnějšího rozpouštědla, tj. acetonu, činí nejpříznivější poměr opálového roztoku : acetonu 1 : 1 /objem/objera/.

Tvarohovitá sraženina vysrážená pomocí acetonu se účelně po dobu 30 sekund v každém případě převádí na kašovitý produkt působením vody. Přidáním acetonu vznikne teplo a tudíž se roztok oddělí dekantací chlazením.

Kvalita lepidla je tím lepší, čím častěji se opakuje proces srážení. Je však účelné provádět srážení třikrát.

Obsah polyakrylamidu v opálovém roztoku sě pohybuje mezi 1,6 a 2,2 í. Na základě této skutečnosti se vypočte procentuální množství lepidla připadající na sorbent. Podle druhu adosrbentu a podle tlouštky vrstvy pohybuje se toto množství účelně mezi 0,5 a 5,0 %·.

Postup podle vynálezu blíže objasňují následující příklady. Tyto příklady však rozsah vynálezu v žádném .směru neomezují.

Přikladl

A/ Výroba polyakrylamidového lepidla g akrylamidu a 8 g N,N'-methylen-bis-akrylamidu se rozpustí v 1 000 ml destilované vody. κ roztoku se přidají 3 ml Ν,Ν,Ν',π'-tetramethylethylendiaminu /TEMED/ a vodný roztok upravený na teplotu 22,5 °C se důkladně promíchá mícháním v jednom směru,, načež se dopros/třed rozmíchaného roztoku přidá roztok 0,8 g /NH^/gSjjO^ ve 3 ml vody.

Po 4 minutách začíná opalizace, přičemž se teplota směsi zvýší na 29 °C a po 30 minutách proces gelování ustane.

Gel se potom ve.Waringově mísidle během 5 sekund zkašovatí a potom se k 1 000 ml opálového roztoku přidá 1 000 ml acetonu. Roztok se chlazením oddekantuje a izolovaná tvarohovitá sraženina se společně se sraženinou vysráženou na stěně nádoby vyjme 1 000 ml vody a směs se po dobu 30 sekund převádí na kaSi. K takto získanému opálovému roztoku se znovu přidá 1 000 ml acetonu, předchozí stupen se opakuje, tj. vysrážení pomocí acetonu se provede ještě jednou. /Roztoky získané při dekantaci se dají vždy stranou./

Obsah polyakrylamidu v 1 000 ml opálového roztoku, který byl získán v posledním stupni, činí 0,021 g/ml, specifická hmotnost: 1,004 g/ml a η _re^ 4,65.

B/ Výroba sorbčníoh vrstev

Za použití lepidla vyrobeného podle odstavce A/ se nanese následující vrstva:

Ke 44 g silikagelu s průměrnou velikostí částic 6 _/Aim a s vnitřním průměrem 90.10^-10 m se přidá 57 ml lepidla zředěného 87,5 ml vody /2,7 % vztaženo na silikagel/. Takto získaná kaše se pečlivě promíchá a během 60 sekund se zkašovatí ve Waringově mísidle.

Takto získaná smetanová kaše se neustálým natíráním nanáší na hliníkovou fólii o tlouštce 0,1 mm až k získání vrstvy o tlouštce 0,2 mm. Po vysušení se získá vrstva o tlouštce 0,16 mm. PO Ohranění se získá 7 vrstev na deskách o rozměrech 20 x 20 cm.

C/ Vyvíjení vysokotlakou chromatografií na jedné vrstvě jedné z vrstev na desce, která byla vyrobena podle odstavce B/, se na třech stranách v šířce 5 mm adaorbent odškrábne a pomocí disperze plastické hmoty /obsahují polyvinylacetát a polyakrylamid/ se vytvoří film z. plastické hmoty odolný vůči vodě a rozpouštědlům.

3,0 cm od impergnované hrany, ve vzdálenosti vždy 9 mm se nanese 15 testovacích barviv /výrobek firmy CAMAG II/ ve stejném množství. Po vysušení míst, kde byly aplikovány vzorky, se deska vloží do přetlakové ultramikrokomůrky /typ Chrompres 10/ opatřené vsuvnou deskou s kanálem z teflonu pro usměrnění rozpouštědla.

Tlak polštáře činí 1,2 Pa, rychlost proudění rozpouštědla: 185 ml/h, rozpouštědlem je methylenchlorid a doba vyvíjení činí 4,6 minuty. Získaný chromatogram se vyhodnocuje pomocí chromatogram-spektrofotoraetru a pro každé barvivo byla pozorávna odchylka - 1,5 %.

D/ Vyvíjení při přetlakové vícevrstvé /čtyřvrstvé/ chromatografii

Z vrstev na desce, který byly připraveny podle odstávce B/, se čtyři vrstvy na deskách impregnují na svých třech hranách v šířce vždy 5 mm disperzní plastické hmoty za vzniku filmu plastické hmoty odolného vůči vodě a rozpouštědlům, přičemž se film podrobí působení teploty 100 °c po dobu 10 minut.

Ze 4 vrstev na deskách s impregnovanou hranou se horní tři ve vzdálenosti 15 mm od nepřímo uzavřené hrany perforují v šíři 185 mm otvorem, jehož průřez činí 2 mm. Na tři podobným způsobem připravené perforované vrstvy na 'deskách se 15 mm od perforovaného sloupce nanese ve yzdálenosti vždy 9 mm v alikvotním množství petroletherový extrakt získaný z květů 3 x 15 rostlin heřmánku.

Pe vysušení míst, na která byly aplikovány vzorky, se desky vloží přesně na sebe, přičemž dolů se vloží nikoliv deska s perforovanou hranou, nýbrž čtvrtá deska s impregnovanou hranou. Tato deska se rovněž opatří vzorky extraktu 15 jiných heřmánků.

Takto upravený systém se vloží do přetlakové ultramikorkomůrky typu CHROMPRES 10.

K vyvíjení se používá benzenu, tlak polštáře činí 1,1 MPa, doba vyvíjení činí 16,2 minuty. Po Vyvíjení se desky vyjmou, vysuší se a postříkají se roztokem 90% kyseliny sírové s obsahem 0,2 % vanilinu, poté se zahřívají 5 minut při teplotě 105 °C načež se provádí hodnocení vizuálně a chromatogram-spektrofotometrem. Na vrstvách bylo možno pozorovat shodnou vzdálenost čela a shódhé hodnoty R^ s rozptylem v přípustných mezích.

Příklad 2

Vrstvy silikagelu nanesené podobně jako je popsáno v příkladu 1 se rozřežou na 20 cm a 40 cm kusy. z protilehlých stran těchto vrstev na deskách se adsorbent odškrábné v šířce Vždy 5 mm a v těchto místech se pomocí disperze plastické hmoty vytvoří film z plastické hmoty pro dvousměrnou přetlakovou chromatografií na vrstvě, který je odolný vůči působení vody a rozpouštědel.

Uprostřed vrstvy se v Šířce 180 mm vytvoří kanál k regulaci rozpouštědla, zatímco vždy 15 mm od dvou stran kanálu, ve vzdálenosti vždy 9 mm, se nanese alikvotní množství vždy 15 různých hydrolyzátů bílkovin z pšeničných semen.

Po vysušení míst, na která byly neneseny vzorky, se vrstva vloží do přetlakové ultramikrokomůrky typu CHROMPRES 10. Tlak polštáře činí 1,2 flPa. K vyvíjení se používá směsi n-butanolu, ledové kyseliny octové a vody v poměru 4:1:1. Doba vyvíjení činí 68 minut.

Po vyvíjení se vrstva na desce vysuší a poté se postříká ninhydrinovým činidlem nasyceným síranem měctnatým a obsahujícím 0,2% směsi methanolu a octové kyseliny. Deska se zahřeje a pak se barevný chromatogram vyhodnotí v ohromatogram-spektrofotometru.

Příklad 3

Pomocí pojidla popsaného v příkladu 1 se nanese následující vrstva:

g mastku š průměrnou velikostí částic 3 až 4^um se smísí s 40 ml pojidla, které bylo zředěno 40 ml destilované vody, směsi se míchá po dobu 75 sekund ve Waringově mísidle, a poté se získaná smetanová kaše nanáší v tloušřce 0,15 mra na tereftalátovou fólii z plastické hmoty rovněž o tlouštce 0,15 mm a to neustálým natíráním.

Takto se po vysušení získá vrstva mastku o tlouštce 0,1 mm. Po ohranění se získá 6 hoto vých vrstev na deskách o rozměrech 20 x 20 cm. Na třech stranách takto vyrobených vrstev se adsorbent odškrábné v šířce 5 mm a pomocí disperze plstické hmoty /obsahující polyvinylacetát a polyakrylamid/ se vytvoří film z plastické hmoty odolný vůči vodě a rozpouštědlům.

Na jednu z hotových desek, která má impregnovanou hranu, se nanesou rostlinné extrakty náprstníku /Digitalis/ a autentické srdeční glykosidy náprstníku v methanol-chloroformovém roztoku. Vrstva se potom vloží do ultramikrokomůrky typu CHROMPRES 10.

Jako směsi rozpouštědel k vyvíjení se používá směsi methylethylketonu a vody v poměru 18 ; 85. Doba vyvíjení činí 25 minut.

Po vysušení se vrstva postříká 20% vodným roztokem fosforečné kyseliny a zahřívá se po dobu 20 minut při teplotě 120 °C. Získají se žluto-zelenavé skvrny, které se kvalitativně a kvantitativně vyhodnotí.

Přikládá

Pomocí pojidla popsaného v příkladu 1 se vytvoří zhuštěná zónová vrstva:

Do velké nádoby /s širší plochou pro nanášení/ se zvláště upravenou nanášecí hlavou se nalije suspenze 33 g silikagelu o průměrné velikosti částic 6/um a s vnitřním průměrem 90 . ΙΟ^-1®!» a 43 ml pojidla zředěného 66 ml destilované vody /2,7 % vztaženo na silikagel/ po odpovídajícím zkašovatění.

Do menší nádoby /s menší plochou pro nanášení/ se předloží kaše ll q křeneliny s průměrnou velikostí částic 15/im a 15 ml pojidla zředěného 21,5 ml vody. Tyto dva druhy kaší se»nanášejí ná 0,1 mm tlustou hliníkovou fólii neustálým natíráním v tloušřce 0,1 nm.

Po vysušení se získá zhuštěná zónová vrstva o tloušEce 0,08 mm a to s 4 cm širokým pru-, hem inaktivní křemeliny a 16 om Širokým pruhem aktivního, jemnozrnnáho silikagelu.

Po rozřezání se získá 10 vrstev na deskách o rozměrech 20 x 20 cm, jejichž hrany se impregnují pro účely přetlakové jednovrstvé chromatografie podle příkladu 1. K dělení bylo použito heřmánkových olejů rozdílného původu, jejichž složky /polyiny, seskviterpenové alkoholy atd./ se rozdělovaly v ostrých pruzích.

Příklad 5

Za použití pojidla popsaného v příkladu 1 se připraví smíšená vrstva silikagelu a pryskyřice J

·. 28 g silikagelu s průměrnou velikostí částic 6/um a 16 g silného katexu s průměrnou velikostí částic 5 až 8/um se během 60 sekund smísí s 42,5 ml pojidla a 70 ml,destilované vody za vzniku kašovitého produktu.

Získaná kaše se nanáší na hliníkovou fólii o tloušEce 0,1 mm neustálým natíráním až do vzniku vrstvy o tloušEce 0,2 mm. Získá® tak 0,17 mm tlustá hladká světle žlutá vrstva.

Po rozřezání se získá 7 vrstev na deskách o rozměrech 20 x 20 cm.

Pro účely přetlakové jednovrstvé a vícevrstvé chromatografie se hrany vrstev Impregnují popřípadě perforují způsobem popsaným v příkladu 1.

K důkazu účinnosti vrstev se·na vrstvy nanesou vzorky hydrolyzátů různých rostlinných bílkovin a autentické směsi aminokyselin v chlorovodíkové kyselině. Po vysuSení se vrstva vloží do komůrky typu CHROMOPRES 10.

Jako vyvíjecího rozpouštědla bylo použito směsi oitrátového pufru o pH 3,45. Detekce byla prováděna za použití ninhydrinového činidla s obsahem 0,2 % směsi methanolu a octové kyseliny.

Příklad 6 g akrylamidu a 8 g Ν,Ν'-methylen-bis-akrylamidu se rozpustí v l 000 ml destilované vody. K získanému roztoku se přidá 2,8 ml TEMED a vodný roztok temperovaný na 23 °C se důkladně promísí mícháním v jednom směru a potom se doprostřed rozmíchaného roztoku přisype 0,9 g krystalického /NH₄/₂s₂0g. Opalizace začne po 5 minutách, proces gelování je ukončen po 30 minutách.

Gel se potom dále zpracovává způsobem popsaným v příkladu 1. Specifická hmotnost získaného opálového roztoku pojidla činí 1,005 g/ml a jeho viskosita 1} _re^ činí 6,8.

Za použití tohoto pojidla se nanese následující vrstva:

g silikagelu s průměrnou velikostí částic 3/um a s vnitřním průměrem 60 . 10~¹⁰ m se spolu s 56 ml pojidla zředěného 90 ml vody rozmíchá ve Waringově mísidle na kašovitý produkt. Tato kaše se potom nanáší na hliníkovou fólii o tloušEce 0,1 mra neustálým natíráním až do vzniku vrstvy o tloušEce 0,1 mm.

Tak se po vysuSení získá vrstva o tlouSEce 0,06 mm. Jednotlivé kousky se po rozřezání Impregnují na hranách a k testování se použije barviv pro systém přetlakové jednovrstvé chromatografie, při němž se na vrstvu aplikují zvláště nepatrná množství vzorků /například 5 až 10/ug/.

Přiklad 7

Pomocí pojidla, které se popisuje v příkladu 6, se vytvoří následující vrstva:

g oxidu hlinitého s průměrnou velikostí částic 10/um se smísí se směsí 39 ml vody a 28 ml pojidla během 224 sekund na kašovitý produkt. Potom se kaSe nanáší na skleněné desky o rpzměrech 20 x 20 cm a tloušťce 2 mm natíráním až do vzniku vrstvy o tlouštce 0,2 mm.

Tak se po vysušení získá vrstva oxidu hlinitého o tlouštce 0,16 mm.

Hrany vrstev na deskách, které byly aktivovány při teplotě 110 °C, se na třech stranách v šířce 4 mm odškrábnou a tam se vytvoří pomocí disperze plastické hmoty uzávěr tvořící film z plastické hmoty.

Na takto upravené vrstvy na deskách se 3 cm od neupravené impregnované hrany nanesou v alikvotním množství ve formě roztoku ve směsi methanolu a chloroformu v poměru 1:1 čisté extrakty obsahující alkaloidy vyrobené z jedné makovice.

Po vysušení míst, kam byly aplikovány vzorky, se deska s odpovídajícím ochranným rámem z plastické hmoty /k ochraně polštářového vodního systému v přetlakové ultramikrokomůrce proti řeznému účinku hran skleněných desek/ vloží do ultramikrokomůrky typu CHROMPBES 10.

Tlak polštáře činí 1,2 MPa. Jako eluentu bylo použito směsi heptanu, chloroformu a. etheru v poměru 40 : 50 : 10 a po vyvíjení bylo k detekci použito Dragendorffova činidla /podle Vágujfalvi/.

Příklade

Pomocí pojidla popsaného v příkladu 6 se nanáší podobná vrstva jako je tam popsaná siiikagelová vrstva a sice tak, že se připraví kaše ze silikagelu doplněná 1,8 % hmot. manganem aktivovaného křemičitanú zinečnatého jako UV indikátoru, vztaženo na sílikagel.

Příklad 9 g akrylamidu a 16,2 g N,N'-methylen-bis-akrylamidu se rozpustí ve 2 000 ml destilované vody. K získanému roztoku se přidají 4 ml 3-dimethylaminopropionitrilu a vodný roztok temperovaný na 22 °C se důkladně promísí mícháním v jednom směru.

Potom se rychle přidá roztok 1,0 g /NH^/jSjOg ve 3 ml destilované Vody a to nakapáním roztoku do středu rozmíchaného roztoku. Opalizace začne po 8 minutách, gelovací proces je ukončen po 45 minutách.

Takto získaný gel se dále zpracovává postupem popeaným v příkladu 1. Hustota získaného opálového roztoku pojidla činí 1,006 g/ml a hodnota činí 4,3.

Za použiti tohoto pojidla se nanese následující vrstva:

g velmi čisté celulózy s průměrnou velikostí částic 5 >um se smísí s 30 ml pojidla zředěného 30 ml destilované vody. Kaše se nanáší na fólii z hliníku o tloušťce 0,9 mm obvyklým způsobem natíráním až do vzniku vrstvy o tloušťce 0,15 mm. '

Hrany rozřezaných desek se impregnují způsobem popsaným v příkladu 1 a desky se používají k testování aminokyselin v systému přetlakové jednovrstvé chromatografle. Jako směsi rozpouštědel k vyvíjení bylo použito směsi methylethylketonu, acetonitrilu, octové kyseliny a vody v poměru 3:4:1:2. Vnější tlak polštáře činil 1,4 MPa, doba vyvíjení /při přeeluaci/-.pák činila 59 minut.

Přiklad 10

Pojidlo popsané v příkladu 9 se používá k fixaci silikagelu opatřeného chemicky vázanou stacionární fází /silikagel RP-18/ na hliníkové folii:

g práškového silikagelu C-18 obrácená fáze se smísí s 80 ml polyakrylamidového pojidla a 60 ml isopropylalkoholu a směs se během 175 sekund přemění na kašovitý produkt. Získaná řídká kaše se nanáší natíráním na hliníkovou fólii o tlouštce 0,12 mm a to až do vzniku vrstvy o tlouštce 0,18 mm.

Vysušené vrstvy na deskách /po rozřezání a impregnování 'hran/ se používají v ultramikrokomůrce typu CHROMPRES 10 k děleni alkaloidů obsažených v máku v obrácené fázi ve směrů acetonitrilu a 0,005 M roztoku Kl^PO^ v poměru 6:4, Jako detekčního činidla se používá Dragendorffova činidla obsahujícího ethylacetát.

Příklad 11

Pomocí pojidla, které je popsáno v příkladu 9, se nanese následující preparativní vrstva:

g silikagelu s průměrnou velikostí částic 5a s vnitřním průměrem pórů 60 . 10¹⁰ m se smísí se 135 ml pojidla, které bylo zředěno 175 nl vody, během 85 sekund na Waringově mísidle za vzniku kašovitého produktu.

Získaná kaše se nanáší na hliníkovou fólii o tlouštce 0,11 mra zbavenou tuku natíráním až do vzniku vrstvy o tlouštce 0,65 mm. Tato vrstva má po vysušení tlouštku 0,5 mm.

Tato silikagelová vrstva se používá k preparativní přípravě -methylovaného lysinu vznikajícího samovolnou methylační a formylační reakcí probíhající mezi L-lysinem a formaldehydem. Jako eluentu Se používá vody. Tlak polštáře činil 1,3 MPa.

PŘEDMfiT VYNÁLEZU

1. Způsob výroby polyakrylamidového pojidla k fixaci jemnozrnných sorpčních vrstev

Claims (4)

1. Způsob výroby polyakrylamidového pojidla k fixaci jemnozrnných sorpčních vrstev s rozsahem velikosti částic 2 až 20>um a zvláště s úzkým rozmezím velikostí částic v rozsahu Δ /im <2 na bázi organických nebo/a anorganických látek nebo/a s případně vázanou apolární fází pro přetlakovou jednovrstvou a vícevrstvou chromatografií, vyznačující se tím, že se z polyakrylamidového gelóvého základu vzniklého ze směsi o hmotnostně-objemové koncentraci 1,6 až 2,5 » vodného roztoku akrylamidu a 0,6 až 1,0» vodného roztoku N,N*-methylen-bis-akrylamidu působením katalyzátorů, jako Ν,Ν,Ν',Ν'-tetramethylethylendiaminu a ampniumperoxydisulfátu při teplotě mezi 21 a 30 °C po homogenizaci rozpouštědlem rozpustným ve vodě, vysráží pomocí acetonu,, methanolu nebo ethanolu frakce vhodná jako pojidlo, získaná sraženina se potom působením vody zkašovatí a poté se proces srážení a zkašovatění alespoň jednou opakuje.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se akrylamid a N,N -methylen-bis-akrylamid používají ve vodném roztoku v hmotnostně-objemové koncentraci mezi 1,9 a 2,2 % popřípadě 0,8 a 1,0 %.

3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako katalyzátoru používá amoniumperoxydlsulfátu a 3-dimethylaminopropionitrilu.

4. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se polvmerisační reakce začíná při teplotě 22 °Ó.