CS241075B2 - Method of microbial protein preparation - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby mikrobiální bílkoviny v živném prostředí obsahujícím methanol a anorganické soli za účelem získání buněčné hmoty bohaté na bílkoviny. Buněčné hmoty bohaté na bílkoviny se používá především při krmení zvířectva, lze ji však používat po odpovídajícím čištění též k výživě lidí, což má velký význam.

Potíže související s celosvětovým nedostatkem bílkovin v souvislosti s demografickou explozí a jejich závislosti ukazují jasně na to, že bílkovina je látkou strategického významu. Proto se provádějí poslední roky neobyčejně široce a intenzívně výzkumné práce k odhalení nových pramenů bílkovin a k jejich výrobě. Nové perspektivy byly zjištěny také opět pro výrobu jednobuněčných bílkovin fermentací: na jedné straně mikrobiologickou přeměnou celulózových látek, jež jsou k dispozici ve velkých množstvích a stále se obnovují, na druhé straně pak použitím nekonvenčních substrátů, tj. uhlovodíků a derivátů, jež nezávisí na zemědělské výrobě.

Na základě pokusných zkušeností je dnes již jisté, že využití jednobuněčných bílkovin na bázi uhlovodíků a jejich derivátů pro krmné účely není v žádném případě omezeno toxikologickými hranicemi, ani jinými požadavky . . kladenými na výživu, takže jejich budoucnost závisí zcela od hospodárnosti technologie a celkovém zájmu.

Hospodárnost výroby jednobuněčných bílkovin kvašením je ovlivňována mnohými činiteli: nejdůležitější jsou fyziologické vlastnosti použitého mikroorganismu, jakož i vlastnosti ovlivňující jeho kultivaci, jeho výživná hodnota, druh použitého zdroje uhlíku a energie, tj. substrátu, jakož i technologické požadavky takto stanoveného průmyslového fermentačního postupu, které se týkají v prvé řadě opatření kyslíku, výměny tepla a otázek zpracování.

Ze substrátů na bázi uhlovodíku a jednoho uhlovodíkového derivátu je z hlediska fermentace nejvýhodnější použití methanolu. V porovnání s methanolem a kapalnými uhlovodíky je při fermentaci za použití methanolu spotřeba kyslíku, jakož i vznikající teplo menší; dále, methanol se míchá neomezeně s vodou, lze jej od produktu snadno oddělit a v neposlední řadě lze jej vyrábět s vysokou čistotou.

Z mikroorganismů jsou při použití methanolu jako jediného zdroje uhlíku vhodné plísně, kvasinky a bakterie. U plísní a kvasinek jest však rychlost růstu, počet buněk, vztaženo na methanol a obsah bílkovin v produktu podstatně menší, než u bakterií.

Je známo více druhů bakterií, jichž se používá k výrobě jednobuněčných bílkovin za použití methanolu jako zdroje uhlíku, mimo jiné kmeny Pseudomonas sp. ATCC č. 21439 a ATCC č. 21438, Corynebacterlum sp. ATCC číslo 21232 a ATCC č. 21236 (německý patentový spis č. 2 059 277], kmeny Pseudomonas rosea (rakouský patentový spis číslo

324 997), kmen Methylomonas methanolica

NRRL B-5458 (britský patentový spis číslo

420 264), kmen Methylomonas espexii (britský patentový spis č. 1 480 684), kmeny Pseudomonas utilis FERM-P 1690 a FERM-P 1691, jakož i Pseudomonas inaudita FERM-P 1693, FERM-P 1694 (německý patentový spis číslo

402 217).

Nedostatky použití shora uvedených kmenů bakterií spočívají v tom, že jejich generační doba je dlouhá a možný výtěžek je nízký, anebo. většina kmenů bakterií nepředstavuje žádné obligátní methylotropní bakterie.

V německém patentovém spise č. 2 458 851 je uveden pro výrobu jednobuněčných bílkovin kmen Methylomonas sp. DSM 580 zužitkovávající nezbytný methanol. Nedostatek použití tohoto kmene je v tom, že výtěžek jednobuněčných bílkovin je nízký (Y = 0,40 až 0,46), jakož i to, že vzniká slabě růžový pigment, což při užití jako živiny zeslabuje stravitelnost.

Pro výrobu jednobuněčné bílkoviny z methanolu, jakožto zdroje uhlíku se doposud nejlépe osvědčil používaný kmen Methylomonas probus FERM-P 3193 (německý patentový spis č. 2 708 112). Generační doba shora uvedeného kmene je sice krátká, avšak dosahovaný výtěžek je malý (Y = 0,45 až 0,49).

Byly vyvíjeny snahy použít kmen, který zužitkovává methanol, a kromě toho, že má výjimečně dobré růstové vlastnosti (krátkou generační dobu), vytváří produkt s vysokým obsahem bílkovin a ve velkém výtěžku, dále, přičemž vzniklou buněčnou hmotu lze snadnou z fermentační břečky izolovat . a složení aminokyselin produktu odpovídá předpisům FAO.

Z přírodních zdrojů bylo izolováno více methylotropních bakteriových kmenů, z nichž jeden odpovídá shora stanovenému cí- li. Izolovaná bakterie představuje dosud neznámý, nepopsaný obligátní methylotropní kmen bakterií, který je označen názvem Methylomonas nov. spec. č. 7 — 3 a je uložený v maďarské. národní sbírce kmenů . v maďarském Institutu hygieny pod číslem ' 00196.

Způsob výroby mikrobiální bílkoviny se tedy podle vynálezu uskutečňuje kultivováním kmene Methylomonas. Kultivace se provádí v přítomnosti methanolu jako jediného zdroje uhlíku a energie, v živném roztoku obsahujícím anorganické soli za aerobních podmínek.

Podstata způsobu podle vynálezu spočívá v tom, že se požívá kmene Methylomonas nov. spec. č. 7 — 3, který je uložený u maďarského institutu hygieny pod číslem 00196. Kultivace se provádí při teplotě mezi 30 až 37 °C a hodnota pH fermentační břečky se udržuje mezi 6 a 8.

Kmen Methylomonas nov. spec. č. 7 — 3 má tyto vlastnosti:

Morfo-logické vlastnosti

V kapalném MSM živném roztoku (Methods in Microbiol. Vol. 3/b) s obsahem methanolu 1 procento objemu lze při kultivaci při teplotě 30 ^C'C po dobu 24 hodin pozorovat tyčinkovité buňky o průměrné velikosti 0,5 — 1 X 1 — 2 μ. Buňky se pohybují pomocí polárního bičíku obvykle samotné, ale často také po dvou. Mnohdy tvcří tři buňky spletený řetězec. Kmen je gramnegativní. Kolonie vyvíjející se na tuhé MSM živné půdě měly ve stáří dvou dní hladký povrch, jejich průměr byl 0,5 až 1 mm, byly bezbarvé a jejich okraj byl zoubkovaný. Tři až pět dní staré kolonie mají velký bezbarvý hladký dvorek, jejích průměr je asi 2 až 2,5 mm, jejich okraj je „fjordovitý“, střed kolonie je slabě nahnědlý. jejich povrch je namodralý.

Fyziologické vlastnosti a vlastnosti ovlivňující růst

Izolovaný kmen Methylomonas nov. spec, č. 7 — 3 roste toliko· na methylotropních substrátech: na methanolu velmi dobře, na dimethylaminu a formaldehydu jen slabě, methan se nezužitkovává. Na jiných substrátech, obsahujících vazbu uhlík—uhlík, jako jsou různé cukry, organické kyseliny, ami nokyseliny, alkoholy nebo uhlovodíky, r pozorován žádný růst.

Ze zdrojů dusíku roste tento kmen nt • na amonných solích; na dusičnanech, m< vině, kasaminokyselině a kvasinkovém 1 traktu roste slaběji.

Růst kmene není stimulován růstovými niteli (biotinem, thiaminem nebo extrakte kvasinek).

Optimální teplota je mezi 33 a 36 °C, a také při 25, popřípadě 39 °C lze pozorov· množení. Hodnota pH optimální pro· růst j

6,5 až 7,5, ale i pří hodnotách. pH 5,5, resi 9 se ještě kmen množí.

Maximální rychlosti množení lze dosáhnout při koncentraci methanolu pod 0,6 procenta objemu.

Nejvyšší měrná rychlost množení kmene činí podle pokusů provedených na principu plynulého chemostatu ,,... — 0,691 · ¹ {generační doba asi 1 hodina), dosažený nejlepší výtěžek byl naproti tomu Y = 0,55 g buněk/g methanolu.

V eubmrrení kultuře je základní barva pěstěného· produktu žlutobílá, při limitu kyslíku zelenkavá, v živném roztoku bez zdroje uhlíku má po několika hodinách hladovění hědavé zabarvení.

Účinek kmene na růst různých antibiotik je uveden v následující tabulce (tabulka 1).

Tabulka 1

Účinná látka	Množství účinné látky	Účinek na růst	Průměr brzdné zóny cm
Penicilín	3 NE	’ 0
Oxacilin	10 ,ug	0
Methícilin	20 μξ,	0
Chloramfenikol	30 ^g	0
Oleandomycin	30 ^g	0
Streptomycin	30 μ%	0
Tetracyklin	30 ug	—	2,5
Oxytetracyklin	30 íig	—	3
Chíortetracyklin	30 μ§	—	5
Neomycin	100 gg	—
Polymycin B	15 j«g	—	1
Erythromycin	10 μ§	—	1
Vankomycin	50	0
Kanamycin	30 fig	—	1,3
Spíramycin	30	0
Novobiocin
Ampicilin	20 μ%	0
Kolistin	20 μ%	0
Linkomycin	10 ^g	0
Nevígramon	30 ;ťg	—	1,5
Gentamycin	20 μ§	—	1
Karbenicilin	50 ug	0

růst není ovlivňován — růst je brzděn

Biochemické vlastnosti kmene Methylomonas nov. spec. č. 7 — 3 jsou charakterizovány výsledky následujících biochemických testů:

Hexulosefosfát-synthetasa (HPSj, aktivita + HydroxypirLivat-reduktasa (HPR), aktivita — Asimilace dusičnanu+

Redukce dusičnanu na dusitan+

Produkce indolu na MeOH—

Hydrolýza škrobu—

Produkce HžS—

Rozplývání želatiny—

Produkce acetonu+

Potřeba růstových faktorů—

Produkce ureasy+

Produkce katalasy+

Halotolerance 3 %

Shora uvedený kmen bakterií, který tvoří předmět tohoto vynálezu, patří na základě svých morfologických, růstově mírných, fyziologických, popřípadě biochemických vlastností podle publikace Bergey‘s Manual of Determinative Bacteriology, 8. vydání [vydáno autory Buchana, Gibbons, Cowan, Holt, Liston Murray, Niven, Ravim a Starmer; The Williams and Wilkins Gompany), k rodu Methylomonas. Podle příručky autora Bergeye patří k rodu Methylomonas tři populace: Methylomonas mechanica, Methylomonas ' methanooxidans a Methylomonas methanitrificans. Bakterie tvořící předmět tohoto vynálezu liší se od shora uvedených tří populací Methylomonas a také od bakterií popsaných dosud v odborné literatuře, jež zužitkovávají methanol, co do morfologických vlastností, ve využití zdrojů uhlíku, tvorbě pigmentu, tvorbě extracelulárního hlenu, v optimální hodnotě teploty růstu a v kinetických charakteristikách růstu. Bakterie podle vynálezu je, pokud se jedná o její generační dobu, téměř shodná s dosud popsanými kmeny bakterií, jež asimilují methanol, pokud se však jedná o její výtěžek vztažený na methanol je lepší než dosud popsané kmeny.

Zpracování fermentační břečky a získávání celulózové hmoty může se dít filtrací, separací, flokulací, flotací, s výhodou jejich kombinací. Zvlášť výhodný je postup, při němž se fermentační roztok podrobí před tím, než se z něj získá celulózová hmota, alkalickému a tepelnému zpracování, čímž se sníží obsah nukleinových kyselin v produktu z 14 až 15 % na zhruba 9 %. Tím se zlepší stravitelnost.

Způsob podle tohoto vynálezu je blíže objasňován na podkladě následujících příkladů, jež však vynález nijak neomezují.

Složení fermentačního živného roztoku odpovídalo v každém případě následující koncentraci solí:

(NH4)2SO4 5 _g

CaC12. H2O 0,1 g

MgSOu. 7H2O OA ₈

KH2PO4 4,7 g

NazHPOd . 12H2O 13,0 g a stopové prvky.

Množství bakterie činí v každém případě:

procenta objemu (v inokulu s obsahem buněk 4 g/1).

I ·& >.

Příklad 1

Diskontinuální fermentace v biofermentoru

Podmínky:

Užitečný obsah Intenzita větrání

Počet otáček za minutu ' litrů

0,5 obj./obj. min.

(1 objem vzduchu na objem fermentačního roztoku za minutu]

700

Při podmínkách stanovených ze shora uvedených parametrů a měřeno technikou sulfitové oxidace činí v uvedeném fermentoru rychlost přenosu kyslíku 90 mmol Oaai.h. Počáteční koncentrace methanolu je 1 % objemu.

Teplota: 30 °C.

Hodnota pH: přídavkem 10% NHiOH byla udržována mezi 6,7 a 7,2.

Výsledky:

1% objemově methanol byl spotřebován v 9 hodinách. Fermentační roztok byl zahříván při hodnotě pH mezi 7 a 8 po dobu 15 minut při teplotě mezi 45 a 65 °C, načež bylo pH upraveno na hodnotu 3,5. Vyloučená buněčná hmota byla dekantována, rozprášena v sušičce a vysušena. Vzniklo 3,69 g/1 buněčné sušiny. Výtěžek přepočtený na celkovou fermentaci činil 0,4659 g buněk/g methanolu. Nejkratší měřitelná generační doba při fermentaci byla 1,4 hodiny.

Příklad 2

Diskontinuální fermentace v tak zvaném fermentoru s ponorným proudem (Jet-typJ

Podmínky:

Užitečný obsah 130 litrů

Větrací poměry: za daných parametrů při metodě sulfidové oxidace jsou charakterizovány rychlostí přenosu kyslíku v hodnotě 45 mmol Oz/l.h

Hodnota pH: udržována pomocí NH4OH mezi 6,6 a 6,9

Teplota: mezi 29 a 35 °C

Počáteční koncentrace methanolu: 6 g/1

Y — 0,52 g buněk/g MeOH.

Fermentační roztok byl zpracován postupem uvedeným v příkladě 1.

Výsledky:

Methanol přidaný v jedné dávce byl spotřebován za 3,5 hodiny. Vzniklo 381,4 g buněk. Výtěžek vypočtený pro celkovou fermentaci činil: Y — 0,48 g buněk/g MeOH.

Příklad 3

Kontinuální fermentační pokusy

Kontinuální fermentační pokusy byly prováděny ve fermentoru typu Biofer s užitečným obsahem 6 litrů. Fermentační roztok byl zpracován jako v příkladě 1.

Větrací poměry: 1 obj./obj. min. větrací dávky

Počet otáček: 900 ot./minutu

Složení živného roztoku odpovídá shora uvedenému, koncentrace methanolu činila 2 g/1.

Výsledky kontinuálních pokusů pěstění provedených za různých hodnot pH a teploty:

3.1.1 pH = 6,5; t = 30 °C;

= 0,683 h^_1

D — 0,587 h-f

Při této rychlosti zřeďování činila koncentrace buněk v stacionárním stavu x = 1,2 g/1

Hodnota výtěžku:

Y = 0,55 g buněk/g MeOH;

3.1.2

D = 0,66 h^_1

Při této rychlosti zřeďování činila koncentrace buněk v stacionárním stavu x — 1,07 g/1, výtěžek byl

3.2.1 pH = 7;

t = 30 °C;

— 0,565 h'¹;

D = 0,51 h¹

Při této rychlosti zřeďování činila koncentrace buněk v stacionárním stavu x -- 1,06 g/1, výtěžek

Y = 0,49 g buněk/g MeOH.

3.2.2

O = 0,56 h¹

Při této rychlosti zřeďování činila koncentrace buněk v stacionárním stavu x = 0,25 g/1, výtěžek

Y — 0,53 g buněk/g MeOH.

3.3.1 pH = 7;

t = 33 °C;

(Uiain = 0,691 h^_1;

D = 0,575 1V¹

Při této rychlosti zřeďování činila koncentrace buněk v stacionárním stavu x — 0,96 g/1, výtěžek

Y = 0,44 g buněk/g MeOH.

3.3.2

D = 0,66 h-¹

Při této rychlosti zřeďování činila koncentrace buněk v stacionárním stavu n = 0,56 g/1, výtěžek

Y = 0,43 g buněk/g MeOH.

Příklad 4

Srovnání složení buněk produktu vyrobeného postupem podle příkladu 2 se složením buněk produktu Pruteen firmy ICI a produktu Probion firmy Hoechst.

Lysin Methionln Cystin Threonin Tryptofan Leuzin Valin Tyrosin Fenylalanin Histidin

ICI

4.6

1,8

0,5

3,5

1,0

5,3

3,5

4.2

2.7

1.3 % aminokyselin v produktu

BME	HOECHST
5,0	4,9
1,8	2,1
0,9	—
3,6	3,5
neměřeno	1,6
5,8	5,6
3,3	3,5
5,0	—
3,4	3,2
1,8	1,4

% aminokyselin v produktu

	ICI	BME	HOECHST
Arginin	3,5	4,4	2,5
Alanin	5,1	5,9	5,4
Asparagová kyselina	6,5	9,4	7,0
Glutamová kyselina	7,7	9,3	6,8
Glycin	4,0	2,9	4,2
Prolin	2,4	4,5	3,1
Serin	2,3	4,2	2,7
	62,2	69,0	60,0
Nukleové kyseliny	12	9	neměřeno

pRedmét vynálezu

Claims (1)

1. pRedmét vynálezu

   Způsob výroby mikrobiální bílkoviny kultivováním kmene Methylomonas v přítomností methanolu jakožto jediného zdroje uhlíku a energie, v živném roztoku obsahujícím anorganické soli za aerobních podmínek, vyznačující se tím, že se používá kme ne Methylomonas nov. spec. č. 7—3, uloženého u maďarského Institutu hygieny pod číslem 00196, kultivace se provádí při teplotě mezi 30 a 37 °C a hodnota pH fermentační břečky se udržuje mezi 6 a 8.