CS240247B1 - Způsob selekce a nahromaďování mikroorganismů hydrolyzujících fenoxymethylpenicilin na 8-aminopenicilánovou kyselinu a kmen mikroorganismu Cryptococcus sp. CCY 17-22-1 - Google Patents

Abstract

Řešení se týká způsobu selekce a nahromaďování mikroorganismů hydrolýzujících fenoxymethylpenicilin ňa kyselinu 6-aminopenieilánovou a Je vyznačen tím, že se kultury mikroorganismů naočkují do selektivního média, kde jako jediný zdroj asimilovatelného dusíku, a/nebo jak dusíku, tak uhlíku slouží fenoxyacetamid, 3-fenylpropionamid, 4-hydroxyfenoxyacetamid, fenylakrylamld, a/nebo, kde jako jediné zdroje asimilovatelného uhlíku slouží soli kyseliny 3-fenylprópionové, fenylakrylové, fenoxyoctové a 4-hydroxyfenoxyoctové, popřípadě s amidy těchto kyselin, sloužících jako jediné zdroje asimilovatelného dusíku, nebo s anorganickým zdrojem dusíku, výhodně s amonnými ionty, přičemž vyrostlé kultury mikroorganismů se v těchto půdách pasážují tak dlouho, až se nezvyšuje růstová rychlost, načež se vyrostlá kultura vyočkuje a konzervuje. Vynález se rovněž týká kmene mikroorganismu Cryptococcus sp., CCY 17-22-1 produkujícího vnitrobuněčnou V-penicilin amidázu, která přednostně hydrolyzuje fenoxymethylpenicilin na 6-aminopenicilanovou kyselinu.

Description

Vynález se týká způsobu selekce a nahromadování kmenů mikroorganismů hydrolyzujících fenoxymethylpenicilin na 6-amlnopenicilánovou kyselinu a kmene mikroorganismu Cryptococcus sp. CCY 17-22-1.

Je známo, že kyselina 6-aminopenicilánová (dále jen 6-APK) slouží Jako meziprodukt pro výrobu tzv. polosyntetických penicilinů, např. ampicilinu. 6-APK lze připravit z přírodních penicilinů, tj. z benzylpenicillnu (G-penicilinu) nebo fenoxymethylpenicilinu (V-penicilinu), bud chemicky, nebo enzymovou hydrolýzou. Chemická hydrolýza přírodních penicilinů je ekonomicky nevýhodná. Naproti tomu enzymová hydrolýza má podstatně lepší ekonomické parametry, čehož je využíváno pro výrobu 6-APK řadou zahraničních farmaceutických firem.

Ve většině případů ve světě, a rovněž i v Československu, je 6-APK vyráběna enzymovou hydrolýzou benzylpenicilinu. K tomuto účelu byly získány vysokoprodukční kmeny bakterií syntetizující vysoké množství enzymu G-penicilin amidázy, např. kmeny Escherichia coli podle čs. autorských osvědčení č. 162 274 a 188 631.

Fenoxymethylpenicilin (V-penicilin) je však enzymově hydrolyzován bakteriálními kmeny jen velmi vzácně. Např. bylo popsáno pouze několik kmenů bakterií z rodů Erwinia, Achromobacte, Micrococcus, Streptomyces a Actinoplanes, které jsou schopny syntetizovat specifickou V-penicilin amidázu hydrolyzující V-penicilin za vzniku 6-APK. Popisované produkce tohoto enzymu u zmíněných rodů bakterií jsou však velice nízké, u některých druhů je enzym syntetizován extracelulárně (Streptomyces), takže tyto kmeny bakterií nemají v podstatě pro výrobu 6-APK průmyslový význam (Vandamme, E. J., Economic Microbiology, Microbial Enzymes and Bioconversions, Rose, A. H., ed., Vol. 5, Chapter 9, pp. 467 až 522, Acad. Press, New York, 1980].

Citovaný autor naproti tomu uvádí, že u některých eukaryontních mikroorganismů je výskyt V-penicilin amidázy více rozšířen, zejména u některých kvasinek (např. rodyTorulopsis, Zygosaccharomyces, Debaryomyces, Torula, Rhodotorula), plísní (např. rody Penicillium, Aspergillus, Fusarium) a vyšších hub (např. rody Pleurotus, Bovista). Nejlepšími producenty V-penicilin amidázy jsou některé kmeny vyšších hub, zejména Pleurotus ostreatus a Bovista plumbea.

Zvládnutí kultivace těchto organismů ve velkokapacitných fermentorech je pro vysoké náklady na řízení kultivace, složení živné půdy a sterilitu kultury při její dlouhodobé submersní kultivaci (řádově 150 až 200 hodin) značně náročné.

Doposud bylo charakterizováno v základních parametrech jen velmi málo producentů V-penicilin amidáz. Ve většině případů jsou informace uvedeny u plísní a vyšších hub, ojediněle u bakterií a pouze v jednom případě u kvasinek, Rhodotorula glutinis var.

glutinis (Vandamme, E. J. a Voets, J. P., Zeít. Allg. Microblol. 13, 701—710, 1973). Použitím silně koncentrované suspenze intaktních buněk této kvasinky bylo dosaženo 80 % teoretické konverze l°/o (hmota/objem) vodného roztoku draselné soli V-penicilin.u na 6-APK (28 °C, pH 6,5, reakční doba 30 hodin).

Postup podle vynálezu spočívá v tom, že lze selektovat suspektní kmeny přírodních a sbírkových mikroorganismů s V-penicilin amidázovou aktivitou v tekutých nebo na pevných chemicky definovaných živných půdách, kde jako jediný zdroj asimiíovatelného dusíku a/nebo jak dusíku, tak uhlíku slouží fenoxyacetamid, 3-fenylpropionamid, fenylakrylamid (amid skořicové kyseliny) nebo jejich deriváty, přičemž schopnost růstu enzymově aktivních buněk s požadovanou aktivitou je indikována přírůstkem turbidity nebo tvorbou kolonií, popřípadě růstem kmenů v přítomnosti soli kyseliny 3-fenylpropionové, fenylakrylové (skořicové) a fenoxyoctové nebo jejich derivátů, které slouží jako jediné zdroje asimilovátelného uhlíku v chemicky definované živné půdě. Jednorázovou selekci a pasážování v živných půdách obsahující tyto sloučeniny a jejich deriváty lze kombinovat se sekvenční selekcí v libovolných kombinacích z hlediska utilizace, indukce a substrátové specifity enzymu. Tak. lze např. získat kmeny rychle rostoucí na utilizovatelných induktorech syntézy apod.

Jednorázovou a sekvenční selekcí, kterým předcházel rozsáhlý screening sbírkových a přírodních izolátů, byl uvedeným způsobem získán kmen mikroorganismů Cryptococcus sp. CCY 17-22-1, který je rovněž předmětem vynálezu a jehož vlastnosti, především vysoká specifická aktivita V-penicilin amidázy, intracelulární lokalizace enzymu a nepřítomnost /í-laktamázy, dovolují reálný předpoklad jeho využití k enzymové přípravě 6-APK z V-penicilinu pomocí intaktních buněk oddělených od kultivační kapaliny, imobilizovaných buněk, popřípadě může tento kmen sloužit jako zdroj enzymu pro jeho následnou izolaci a jeho další použití v rozpustné nebo imobilizované formě. Základní morfologické a biochemické vlastností předmětného kmene a vlastnosti ve vztahu k základní charakterizaci enzymu u intaktních buněk jsou uveteny v následujícím souhrnu.

Vlastnosti kmene Cryptococcus sp. CCY 17-22-1 '

Základní vlastnosti kmene

Kvasinka, dqbře rostoucí na sladinovém agaru, tvoří krémové kolonie, polární pučení, světlolomné pouzdro. Při růstu v živných půdách obsahujících rychle asimilovatelné zdroje uhlíku (glukóza) tvoří extra240247 celulární silně viskozní polysacharid. Tvorbu extracelulárního polysacharidu lze eliminovat složením živné půdy a poměry C : : N. Roste dobře na kokuřičném extraktu, směsích aminokyselin a kvasničném hydrolyzátu. Rovněž roste dobře na chemicky definovaných minerálních živných půdách s vhodným zdrojem uhlíku; jako zdroj dusíku využívá amonné ionty.

Růst na níže uvedených sloučeninách jako Vlastnosti kmene ve vztahukV-penicilin

1. lokalizace enzymu;

2. přítomnost /3-laktamázy:

3. indukce syntézy enzymu:

4. substrátová specifita enzymu:

5. katabolická represe syntézy enzymu:

6. Optimum pH aktivity enzymu:

7. Specifická aktivita intaktních buněk*

8. Produkty enzymové přeměny:

jediných zdrojích asimilovatelného uhlíku v tekutých.živných půdách.

Glukóza ( + ), sacharóza ( + ), fruktóza ( + ), galaktóza (—), laktóza (+), glycerol (—), DL-laktát ( — ), sukcinát ( + ), citrát ( + ), ethanol ( + ], soli kyseliny fenyloctové (—), fenoxyoctové (—), 4-hydroxyfenoxyoctové (—), 3-fenylpropionové ( + ), fenylakrylové ( + ).

láze u intaktních buněk intracelulární;

negativní;

kyselina 3-fenylpropionová (+++), fenylakrylová ( + + ), 4-hydroxyfenoxyoctová (++), fenoxyoctová ( + ), fenyloctová ( —); V-penicilin (+++), G-penicilin ( —), ampicilin ( —), monoamid kyseliny glutarové (++), fenoxyacetamid (+), 4-hydroxyfenoxyacetamid ( + ), 3-fenylpropionamid. ( —), amid kyseliny fenylakrylové ( + ), fenylacetamid (—);

V přítomnosti glukózy a sacharózy se enzym nesyntetizuje, i když je přítomen kterýkoliv z induktorů jeho syntézy;

8,0;

0,5 až 12,0 ,«mol 6-APK. mg ¹ suché hmoty buněk. Dosažená specifická aktivita závisí na složení živné půdy, kultivačních podmínkách a fyziologickém stavu kultury; Chromatografií na tenké vrstvě celulózy a vysokotlakou kapalinovou chromatografií bylo prokázáno, že při styku intaktních buněk s vodnými roztoky K-soli V-penicilinu, vzniká pouze 6-APK a fenoxyoctová kyselina.

* Jednotka enzymové aktivity V-penicilin amidázy je takové množství enzymu, které katalyzuje hydrolýzu vodného roztoku K-soli V-penicilinu jako substrátu, za vzniku jednoho mikromolú 6-APK v jednom mililitru za jednu hodinu v podmínkách enzymové reakční kinetiky nultého řádu při pH 8,0 a teplotě 37 °C. Rozměr aktivity: gmol 6-APK . ml^-1. h'¹; rozměr specifické aktivity: μίησί 6-APK. mg^-1 suché hmoty buněk. Ke stanovení koncentrace 6-APK byl použit postup uvedený v čs. patentovém spisu č. 116 959.

Podle morfologického, růstového a biochemického chování kultury byl získaný kmen zařazen do rodu Cryptococcus v souhlase s taxonomickými kritérii uvedenými v: The Yeasts, A taxonomie study, second edition, J. Lodder, ed., Nórth-Holland Publishing Company — Amsterdam — London, 1970; J. A. Barnett, R. W. Payne and D. Yarrow, Yeasts, Characterization and Identification, Cambridge, London, New York, New Rochelle, Melbourne, Sydney, 1983. Předmětný . produkční kmen mikroorganismu Cryptococcus sp. le uložen v čs. sbírce kvasinek (Czechoslovak Collection of Yeasts) v Bratislavě pod č. CCY 17-22-1.

Podstata způsobu jednorázové a sekvenční selekce a nahromaďování kmenů mikroorganismů, zvláště kvasinek, hydrolyzujících fenoxymethylpenicilin na 6-amlnopenicilánovou kyselinu podle vynálezu spočívá v tom, že se kultury mikroorganismů naočkují do selektivních chemicky definovaných živných půd, kde jako jediný zdroj asimilovatelného dusíku, a/nebo jak dusíku, tak uhlíku slouží fenoxyacetamid, 4-hydroxyfenoxyacetamid, 3-fenylpropionamid, fenylakrylamid, a/nebo, kde jako jediné zdroje asimilovatelného Uhlíku slouží soli, kyseliny 3-fenvlpropionové, fenylakrylové, fenoxyoctové, hydro syfenoxyoctové, popřípadě s amidy těchto· kyselin sloužících jako jediné zdroje asimilovatelného dusíku, nebo s anorganickým zdrojem dusíku, výhodně s amonnými ionty, přičemž vyrostlé kultury mikroorganismů se v těchto půdách pasážují tak dlouho, až se nezvyšuje růstová rychlost, načež se vyrostlá kultura vyočkuje a konzer-. vuje.

Předmětem vynálezu je dále kmen mikroorganismu Cryptococcus sp. CCY 17-22-1, který byl získán postupem uvedeným v předchozím odstavci, a který produkuje vnitrobuněčnou V-penicilin amidázu, která přednostně hydrolyzuje fenoxymethylpenicilin na , 6 -aminopenicilánovou kyselinu.

Vynález je dále doložen v příkladech provedení aniž' by se jimi omezoval.

Příklad 1 sbírkových a 8 z přírody izolovaných kmenů kvasinek, které bylo možno podle citované literatury uvedené v popisu předmětného vynálezu taxonomicky zařadit do rodů Saccharomyces, Debaryomyces, Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Torulopsis a Trichosporon, byly naočkovány kličkou ze šikmého hladinového agaru do baněk obsahujících 50 ml tekuté živné půdy o složení: fenoxyacetamid 0,2 °/o, glukóza 0,5 až 1,0 proč. KH₂PO₄ 0,1 %, K₂HPO₄ 0,2 %, kvasničný extrakt 0,05 °/o, MgSO₄ 0,05 °/o, Na-sůl fenoxyoctové kyseliny0,05 %; pH živné půdy 6,5. Naočkované kultury v baňkách byly umístěny na třepací stroj a submersní kultivace probíhala při 28 °C.

Z testovaných 30 kmenů vyrostlo za uvedených podmínek za různou dobu 19 kultur. Po odstředění suspenze byl analyzován buněčný sediment s cílem průkazu tvorby 6-APK z V-penicilinu postupy uvedenými v popisu předmětného vynálezu. Ani u jedné z vyrostlých kultur však nebyla prokázána aktivita V-penicilin amidázy.

Dále bylo postupováno tak, že 11 nerostoucích kmenů bylo z dalšího výběru vyřazeno a 19 rostoucích kmenů v živné půdě, kde fenoxyacetamid sloužil jako jediný zdroj dusíku, bylo naočkováno do baněk obsahujících 50 ml neselektivní tekuté živné půdy o složení: hydrolyzát kaseinu 0,5 %, pepton 0,5%, kvasničný extrakt 0,1 %, KH₂PO₄ 0,3 %, NH₄H₂PO₄ 0,5 %, MgSO₄ 0,05 %, Na-sůl fenoxyoctové kyseliny 0,05 °/o; pH živné půdy 6,5. Naočkované kultury v baňkách byly umístěny na třepací stroj a submersní kultivace probíhala při 28 °C 24 až 48 hodin. Sedimenty intaktních buněk po odstředění byly opět analyzovány na průkaz tvorby 6-APK z V-penicilinu.

U 19 kultur vyrostlých za uvedených podmínek byla u 5 kmenů analyticky prokázána tvorba 6-APK z V-penicilinu. Jednalo se o kmeny Candida utilis, Rhodotorula sp., Rhodotorula pulcherina, Rhodotorula glutinis a Cryptococcus sp.

Uvedených 5 kmenů bylo v dalším užším výběru hodnoceno kvantitativně na množství produkované V-penicilin amidázy. Kultury byly naočkovány do baněk obsahujících 50 ml tekuté neselektivní živné půdy o složení: kukuřičný extrakt — vysrážený, filtrovaný 2 '% (vlhká hmota), KH₂PO₄ 0,1 °/o, K_aHPO₄ 0,2 °/o, MgSO₄ 0,05 θ/o, Na-sůl fenoxyoctové kyseliny 0,05 %; pH živné půdy 6,9. Submersní kultivace probíhala při 28 stupních Celsia po dobu 30 hodin. Po odstředění kultur byly sedimenty kvantitativně analyzovány na obsah V-penicilin amidázy v buňkách.

U všech kmenů byla prokázána specifická aktivita tohoto enzymu, avšak kvantitativní rozdíly mezi kmeny vyrostlými za uvedených podmínek byly až několikařádové. Nejvyšší specifické aktivity bylo dosaženo u kmene Cryptococcus sp. (0,28 μΐηοΐ 6-APK. .mg^-1 suché hmoty buněk) a Rhodotorula glutinis (0,012 μΐηοΐ 6-APK . mg¹ suché hmoty buněk). Pro další selekci a nahromaďování výše produkčních kmenů byl proto zvolen jako výchozí materiál kmen Cryptococcus sp., neboť jeho specifická aktivita byla více jak řádově vyšší ve srovnání s druhým získaným izolátem.

P ř í k 1 a d 2

Při zkoumání specifity indukce V-penicilin amidázy během submersní kultivace kmene Cryptococcus sp. v živných půdách obsahujících sloučeniny chemicky identické nebo chemicky blízké postranním řetězcům přirozených a polosyntetických penicilinů bylo zjištěno, že nejvyšších specifických aktivit enzymu v buňkách je dosahováno v přítomnosti solí 3-fenylpropionové, 4-hydroxyfenoxyoctové, skořicové a fenoxyoctové kyseliny. Tato skutečnost je uvedená v přehledné charakterizaci kmene Cryptococcus sp. v popisu předmětného vynálezu. Některé z uvedených sloučenin jsou využívány jako jediné zdroje asimilovatelného uhlíku, jiné nikoliv. Některé tyto látky tedy fungují jako asimilovatelné induktory, jiné jako „zdaťma“ induktory. Těchto poznaných skutečností bylo využito k volbě selektivní chemicky definované živné půdy s cílem selekce a nahromaďování rychle rostoucích kmenů na uvedených sloučeninách jako jediných zdrojích asimilovatelného uhlíku, zvláště proto, že většina těchto látek je silně toxická a inhibuje růst.

Kmen Cryptococcus sp., který byl získán, jak je uvedeno v příkladu 1, byl očkován ze šikmého sladinového agaru do baněk obsahujících 150 ml tekuté živné půdy o složení: kukuřičný extrakt — vysrážený, filtrovaný 2 % (vlhká hmota), KH₂PO₄ 0,1 K₂HPO₄ 0,2 °/o, kvasničný extrakt 0,05 %, thiamin 0,01 °/o, MgSO₄ 0,05 %, K-sůl 3-fenylproplonové kyseliny 0,1 %, pH živné půdy 7,2. Submersní kultivace probíhala při 28 °C po dobu 24 hodin.

Vyrostlá kultura byla použita jako inokulum (5 obj. % suspenze) k očkování baněk obsahujících 150 ml tekuté živné půdy o složení: K-sůl 3-fenylpropionové kyseliny 0,5 %, KH₂PO₄ 0,2 %, NaCl 0,05 %, kvasničný extrakt 0,03 °/o, (NH₄j₂SO₄ 0,3 °/o, NH₄H₂PO₄ 0,2 %, CaCl₂ 0,002 %, FeSO₄ 0,0005 proč. MgSO₄ 0,01 °/o; pH živné půdy 7,3.

Submersní kultivace probíhala střídavým pasážováním kultur při 28 °C vždy přenosem 5 obj. '% vyrostlé kultury ze súbkultury prvé do druhé, z druhé do třetí apod. První subkultura vyrostla za 120 hodin při dosažení suché hmoty buněk při přibližně 1 mg. ml¹, druhá subkultura za 70 hodin při dosažení téže sušiny, třetí subkultura za 50 hodin, čtvrtá za 70 hodin a pátá subkultura za 45 hodin při dosažení 1,2 mg su240247 siny. ml^-1. V šesté a následujících subkulturách se růstová rychlost a výtěžek sušiny buněk nezvyšoval.

Nahromaděná populace rychleji rostoucích buněk v živné půdě obsahující K-sůl 3-fenylpropionové kyseliny jako jediný zdroj asimilovatelného uhlíku byla z poslední subkultury vyseta na Petriho misky se sladinovým agarem, vyočkovány individuální kolonie a tak získán rychleji rostoucí kmen utilizující 3-fenylpropionovou kyselinu jako jediný zdroj uhlíku. Specifická aktivita V-penlcilin amidázy u tohoto kmene se pohybuje okolo- 4 až 6 ,umol 6-APK. mg¹ suché hmoíy buněk při jeho submersní kultivaci v baňkách v tekuté živné půdě obsahující: kukuřičný extrakt — vysrážený, filtrovaný 0,5 % (vlhká hmota), K-sůl, 3-fenylpropionové kyseliny 0,5 %, KH₂PO₄ 0,1 %, K2HPO4 0,2 %, kvasničný extrakt 0,05 %, thiamin 0,01 °/o, MgSO₄ 0,01 %; pH živné půdy 7,2. Výtěžek suché hmoty buněk se pohybuje okolo 1,5 až 1,8 mg. ml^-.¹ za 46 hodin kultivace při 28 °C.

P ř í k 1 a d 3

Při sledování substrátové specifity V penicilin amidázy u intaktních buněk Cryptococcus sp., k sloučeninám obsahujícím v molekule amidickou CO—NH vazbu, zvláště amidům kyselin chemicky blízkých postranním řetězcům přírodních a polosyntetických penicilinů bylo zjištěno, že některé z nich jsou rovněž substráty, i když reakční rychlost enzymové hydrolýzy je řádově až několikařádově posunuta ve prospěch hydrolýzy V-penicllinu jako substrátu. Tedy jde vesměs o velmi špatné substráty ve srovnání s V-penicilinem. Tato skutečnost je uvedena v přehledné charakterizaci kmene Cryptococcus sp. v popisu předmětného vynálezu. Nicméně těchto poznaných skutečností byto využito k volbě selektivní chemicky definované živné půdy s cílem nahromadění výše produkčních kmenů použitím amidů zmíněných látek jako jediných zdrojů asimilovatelného dusíku.

Kmen Cryptococcus sp. získaný jak je uvedeno· v příkladu 2, byl očkován ze šikmého sladinového agaru do baněk obsahujících 150 ml tekuté živné půdy o složení, které je uvedeno- rovněž v příkladu 2 v posledním odstavci. Po 46hodinové submersní kultivaci při 28 °C bylo této kultury použito jako inokula (5 obj. °/o) pro očkování selektivní tekuté živné půdy v baňkách plněných 150 ml půdy o složení: 4-hydroxyfenoxyacetamid 0,2 °/o, K-sůl 3-fenylpronlo-nové kyseliny 0,5 °/o, KH₂PO₄ 0,1 %, K₂HPO₄ 0,2 proč. kvasničný extrakt 0,03 °/o, ťhiamln 0,01 proč. MgSO₄ 0,01 %, pH živné půdy 7,2.

Submersní kultivace probíhá střídavým pasážováním kultur při 28 ^CC vždy přenosem 5 obj. % vyrostlé kultury ze subkultury prvé do druhé a následujících tak dlouho, až se růstová rychlost neměnila.

Heterogenní populace buněk získaná sekvenční selekcí v živné půdě, kde jako jediný zdroj asimilovatelného dusíku sloužil 4-hydro-xyfenoxyacetamid a jako jediný zdroj asimilovatelného uhlíku K-sůl 3-fenylpro-. pionové kyseliny byla vyseta na Petriho misky se sladinovým agarem, vyočkovány individuální kolonie a tak získán kmen se zvýšeným obsahem V-penicilin amidázy vbuňkách.

Specifická aktivita enzymu u tohoto kmene se pohybuje mezi 6 až 12 ,μπιοΙ 6-APK . . mg^-1 suchá hmoty buněk při jeho submersní kultivaci v baňkách v tekuté živné půdě obsahující: K-sůl kyseliny 3-fenylpropionové 0,5 %, KH₂PO₄ 0,2 %, NH₄H₂PO₄ 0,2 %, (NH₄j₉SO₄ 0,3 %, kvasničný extrakt 0,05 %, thiamin 0,01 °/o, MgSO₄ 0,01 %, CaCl₂ 0,002 proč., FeSO₄ 0,0005 %; pH živné půdy 7,2. Výtěžek suché hmoty buněk se pohybuje okolo 1,3 mg. ml'¹ za 48 hodin při 28 °C.

Claims (2)

1. PREDMET

   1. Způsob selekce a nahromaďování mikroorganismů hydrolyzujících fenox-ymethylpenlcilin na 6-aminopenicilánovou kyseliny, vyznačený tím, že se kultury mikroorganismů naočkují do selektivních chemicky definovaných živných půd, kde jako jediný zdroj asimilovatelného dusíku, a/nebo- jak dusíku, tak uhlíku slouží fenoxyacetamid, 4-hydro-xyfenoxyacetamid, 3-fenylpropionaraid, fenylakrylamid, a/nebo kde jako· jediné zdroje asimilovatelného uhlíku slouží soli kyseliny 3-fenylpropionové, fenylakrylové, fenoxyoctové, 4-hydroxyfenoxyoctové, popřípadě s amidy těchto kyselin sloužících

   VYNÁLEZU jako jediné zdroje asimilovatelného dusíku, nebo s anorganickým zdrojem dusíku, výhodně s amonnými ionty, přičemž vyrostlé kultury mikroorganismů se v těchto půdách pasážují íak dlouho, až se nezvyšuje růstová rychlost, načež se vyrostlá kultura vyočkuje a konzervuje.
2. 2. Kmen mikroorganismu Cryptococcus sp. CCY 17-22-1, produkující vnitrobuněčnou V-penicilin amidázu, která přednostně hydrolyzyje fenoxymethyípenicilin na 6-aminopenicilánovou kyselinu, získaný způsobem podle bodu 1.