CS239293B1 - Kmen mikroorganismu Pseudomonas sp. CCM 3635 - Google Patents

Abstract

Nový kmen mikroorganismu Pseudomonas sp. CCM 3635, produkující vnitrobuněčnou hydrolázu, která katalýzuje deacylaci 7-beta-/4-karboxybutamamido/-cefalosporánO“ vé kyseliny a jejích derivátů za vzniku odpovídájících 7-aminocefemsloučenin, významných surovin pro výrobu polosyntetických cefalosporlnových antibiotik.

Description

Vynález se týká kmene mikroorganismu Pseudomonas sp. CCM 3635, produkujícího vnitrobuněčnou hydrolázu, použitelného pro enzymovou přípravu 7-aminocefemsloučenin, zejména pro přípravu 7-aminocefalosporánové kyseliny /dále jen 7-ACK/, významné výchozí látky pro získávání polosyntetických cefalosporinových antibiotik.

Je známo, že 7-aminocefemsloučeniny obecného vzorce

Η₂Ν-ρΥ >

CH₂X

COOH ve kterém X značí atom vodíku, skupinu -OH, -OCOCH^ nebo nukleofilní skupinu» lz® získávat z jejich 7-acylaminoderivátů obecného vzorce II

R—CO—HN ch₂x

COOH /11/, ve kterém R značí skupinu -/CH₂/₃-COOH, -/CH₂/₃-CO-COOH, /CHj/₃-CHNH₂-COOH nebo -CH₂CgH₃ a X značí totéž co ve vzorci I, působením specifických enzymů, které hydrolyzují amidickou vazbu.

Tyto enzymy jsou produkovány vhodnými mikroorganismy, jak bude uvedeno dále. Pro hydrolýzu lze používat bud izolovaných enzymů, nebo celých buněk určitých kmenů mikroorganismů, vybraných se zřetelem k výchozímu substrátu.

Použití buněk s pecinilinacylázovou aktivitou je například uvedeno pro hydrolýzu N-fenyl-acetamido-desacetoxvoefalosporinu C, tj. sloučeniny obecného vzorce II, ve kterém X značí atom vodíku a R -CH₂CgHg, při přípravě 3-desacetoxy-7-aminocefalosporánové kyseliny /čs. autorské osvědčení č. 218 023/.

Dále je známo, že přímá hydrolýza sloučeniny obecného vzorce ,11, ve kterém X značí skupinu -OCOCH₃ a R skupinu -/CH₂/₃-CHNH₃~COOH, tj·. cefalosporinu C, je obtížná. Byly popsány postupy s použitím buněk mikroorganismů Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Giberella, Glomerella aj. /japonský pat. spis č. 77 143, 289, britský pat. spis č. 1 566 830/ s výtěžky 5 % 7-ACK a za současného vzniku 3-deacetyl-7-amlnocefalosporánové kyseliny.

Dále byl též popsán postup s použitím buněk Pseudomonas sp. s výtěžkem 7-ACK asi 18 % /japonský pat. spis č. 78 94, 093/.

Pro konverzi cefalosporinu C na 7-ACK se zatím jako nejschůdnější jeví dvoustupňová cesta, která zahrnuje přípravu derivátů cefalosporinu c, tj. 7-acylaminosloučenin obecného vzorce II, ve kterém R značí skupinu -/CH₂/₃~COOH nebo --/CH₂/₃-CO-COOH a jejich hydrolýzu bud s použitím kmene Comamonas /japonské pat. spisy č. 75 101, 584, 78 59, 095 a 81 55,

298/ nebo kmenů Bacillus a Arthrobaoter /japonské pat. spisy č. 77 128, 293 a 78 86, 094/.

7-acylaminocefemsloučeniny obecného vzorce I lze získat z cefalosporinu bud chemicky /japonské pat. spisy č. 77 77, 078 a 78 114, 891/, nebo enzymaticky působením oxidázy D-aminokyselin nebo aktivovanými buňkami mikrobiálních producentů tohoto enzymu, jako je Trigonopsis variabills, Fusarium sp., Aspergillus flavus, Candida aj. /britský pat. spis č. 1 272 769, japonské pat. spisy č. 77 44, 695, 76 88, 694, 77 128, 295, 77 125, 696 a 80 23, 966/.

Dosud známé způsoby získávání 7-acylaminosloučenin obecného vzorce II využívají kmeny mikroorganismů, které syntetizují zmíněné hydrolázy v přítomnosti induktoru nebo navíc syntetizují nežádoucí degradační enzymy.

Zmíněné nevýhody odstraňuje nový kmen mikroorganismu, identifikovaný jako Pseudomonas sp., který vykazuje konstitutivní syntézu hydrolázy aoylamlnooefalosporánové kyseliny a jejích derivátů, tj. sloučenin obecného vzorce II, ve kterém R značí skupinu ^-COOH nebo -/CH₂/₃-CO-COOH.

Nový kmen, který je předmětem tohoto vynálezu, byl získán izolací z ornice nahromadovací technikou v živné půdě obsahující sodnou sůl 3-methyl-7-beta-/4-karboxybutanamido/-cef-3-em-4-karboxylové kyseliny jako zdroj uhlíku, mutagenezí a výběrem monokoloniového izolátu, který nevyžaduje pro syntézu hydrolázy induktor-glutaronou kyselinu.

Nový kmen byl uložen v Čs. sbírce mikroorganismů /Czechoslovak Collection of Microorganisms/ University J. E. Purkyně, Brno, tř. Obránců míru 1O, pod označením Pseudomonas sp. CCM 3635.

Charakteristiky kmene jsou uvedeny v následujícím přehledu:

A. Morfologie:

1. Velikost //οχλ/ , tvar buněk:

2. Pohyblivost:

3. Gram-barvení:

tyčinky 0,5 až 0,9krát 1,0 až 1,5 jednotlivé, ev. ve shlucích pohyblivé polární bičíky negativní

B. Pozorování kultur:

I. Bujon-agar plotny:

2. Kultura na šikmém bujon-agaru

3. Bujon-agar vpich:

4. Želatina vpich:

5. Tekutý bujón:

kolonie kulaté, vypouklé, s drsným, zvrásněným povrchem, s mírně zvrásněným okrajem, bílé až nažloutlé, slabě opalescentní dobrý růst, drsný a zvrásněný povrch, bílý až slabě zažloutlý, slabě opalescentní, agar bez barevných změn povrchový růst povrchový růst, bez ztekuoení růst v zákalu, vznik sedimentu bez blanky

C. Růstové podmínky:

roste dobře při 25 až 34 °C a pH 6,5 až 8,5 aerobní

D. Fyziologické charakteristiky:

1. Produkce indolu:

2. Produkce sirovodíku:

3. Tvorba acetylmethylkarbinolu:

4. Methylčerveň test:

5. Redukce nitrátů:

6. Denitrifikace

7. Kataláza:

8. Ureáza:

9. Oxidáza:

10. Arginin-dihydroláza:

11. želatina:

12. Škrob:

13. Ox-ferm test:

14. Fermentaoe cukrů:

negativní negativní pozitivní negativní negativní negativní pozitivní negativní pozitivní negativní

15. Utilizace zdrojů uhlíku:

neztekucována nehydrolyzován žádné změny glukóza, fruktóza, mannóza, galaktóza, xylóza, sacharoza, maltoza, laktóza, manit acetát, glútarát, pýruvát utílizován etanol, propionát, citrát a glyoerol neutilizován

16. Beta-laktamáza: negativní

Množství hydrolázy vytvořené v buňkách bylo sledováno na základě rychlosti hydrolýzy solí 7-acylamino-cefem sloučenin spektrofotometrickou metodou /Balasingham a sp., Biochim. Biophys. Acta 276, 250, 1972/ nebo chromatografii na tenké vrstvě.

Za použití buněk Pseudomonas sp. CCM 3635 byla ověřena hydrolýza 3-acetoxymethyl-7beta-/4-karboxybutanamido/cef-3-em-4-karboxylové kyseliny /dále jen glutaryl-7-ACK/, 3-acetoxymethyl-7beta-/5-karboxy-5-oxopentamido/-cef-3-em-4-karboxylové kyseliny, 3-methyl-7beta-/karboxybutanaraido/-cef-3-em-4-karboxylové kyseliny /dále jen glutaryl-7-ADCK/,

N- [7beta-/4-karboxybutanamido/-cef-3-em-3-yl-methyl ] -pyridinium-4-karboxylové kyseliny.

Specifická aktivita buněk byla určována na základě rychlosti hydrolýzy glutaryl-7-ADCK /pri koncentraci 5 mg/ml 0,1 m fosfátového pufru pH 7,0 a teplotě 37 °C/. Pro chromatografii 7-ACK použita tenká vrstva celulózy a systém n-propanol-voda /7 : 3/ s ninhydrinovou detekcí /R_f 0,5/. Totožnost 7-ACK byla ověřena vysokotlakovou kapalinovou chromatograf ií.

Kmen Pseudomonas sp. CCM 3635 podle vynálezu lze s výhodou použít pro přípravu 7-aminocefemsloučenin. Vzhledem ke konstitutivní syntéze hydrolázy není nutno do půdy přidávat induktor syntézy enzymu.

Další výhodou tohoto kmene je, že nevykazuje nežádoucí aktivitu beta-laktamázy. Při inkubaci buněk v koncentraci 15 mg suché hmoty/ml v 1% roztoku glutaryl-7-ACK /za 4 h při pH 7,0 a teplotě 37 °C/ nedošlo k otevření beta-laktamového kruhu, měřeno absorbcí v UV-světle při 255 nm a srovnáním s kontrolním měřením substrátu inkubovaného za stejných podmínek bez buněk. '

Možnosti použití kmene Pseudomonas sp. CCM 3635 pro přípravu 7-ACK jsou dokumentovány v příkladech provedení.

Glutaryl-7-ACK byl připravován z cefalosporinu C účinkem enzymu oxidázy D-aminokyselin kmene Trigonopsis varlabills CBS 4095 nebo CBS 1040 v přítomnosti azidu sodného pro inhibici katalázy, za vzdušnění.

Lze používat buňky Trigonopsis variabilis s aktivitou oxidázy D-aminokyselin, připravené dvoustupňovou aerobní fermentaoí v komplexních nebo syntetických kultivačních půdách s přísadou 0,3 % D,L methioninu jako induktorem, permeabilizované vhodnými permeabilizačními činidly /například toluenem nebo smáčedleni/.

Kmen Pseudomonas sp, CCM 3635 je použitelný pro hydrolýzu glutaryl-7-ACK připravené chemicky nebo izolované z reakční směsi po deaminacl oefalosporinu C buňkami Trigonopsis variabilis.

Oddělení buněk odstředěním, okyselení kyselinou chlorovodíkovou, extrakcí ethylacetátem a odpařením vysušeného extraktu ve vakuu.

Kmen podle vynálezu je rovněž použitelný pro hydrolýzu glutaryl-7-ACK, vzniklé účinkem oxidázy D-aminokyselin buněk Trigonopsis variabilis z cefalosporinu C v přítomnosti azidu sodného, a to přímo v reakční směsi po oddělení buněk, bez izolace.

Konečně je použitelný pro hydrolýzg glutaryl-7-ACK, vzniklé deaminací cefalosporinu C v surových eluátech z purifikace buňkami Trigonopsis variabilis.

Bližší podrobnosti o novém kmeni podle vynálezu a o jeho použitelnosti jsou uvedeny v následujících příkladech provedení, které vynález pouze ilustrují, ale nijak neomezují.

Přikladl

Kmen mikroorganismu Pseudomonas sp. CCM 3635 byl získán z ornioe tímto postupem:

g ornioe bylo suspendováno ve fyziologickém roztoku a filtrátem byla naočkována živná půda tohoto složení /v % hmot./: 0,2 % dihydrogenfosforečnan draselný, 0,05 % síran hořečnatý kryst., 0,02 % chlorid manganatý kryst., 0,003 % síran železnatý kryst., 0,05 % kvasničný extrakt a 1,5 % glutaryl-7-ADCK /pH 7,2, sterilizace filtrací/.

Vyrostlá kultura byla dále pasážována na půdě stejného složení a poté vyseta na pevnou půdu s masopeptonovým agarem. Získané monokoloniové izoláty byly ověřovány na deacylační aktivitu po kultivaci v přítomnosti induktoru, tj. glutarové kyseliny, v půdě tohoto složení: 5 % kyselého bílkovinného hydrolyzátu /komerční výrobek/, 0,1 % kukuřičného extraktu,

0,5 % kvasničného extraktu, 0,1 % glutarové kyseliny /pH 7,2/.

Vybraný izůlát, který vykazoval po kultivaci v živné půdě stejného složení, za podmínek _2 uvedených v příkladu 2, specifickou aktivitu 1,2-10 /mol 7-ADCK/min/mg suché hmoty buněk, byl dále podroben mutagenezi.

Buňky po nárůstu na komplexní živné půdě byly separovány, promyty 0,1 M fosfátovým 7 pufrem /pH 7,0/ a suspenze, obsahující asi 10 buněk a 150 pg N-methyl-N -nitro-N-nitrosoguanidinu/ml pufru, byla míchána 60 min. při teplotě místnosti.

• Poté byla suspenze vyseta na pevnou půdu s masopeptonovým agarem a proveden výběr monokoloniovéhó Izolátu, který vykazoval konstltuční syntézu hydrolázy při růstu ve výše uvedené živné půdě s kyselým bílkovinným hydrolyzátem bez glutarové kyseliny.

Vybraný monokolonlový Izolát vykazoval za kultivačních podmínek, uvedených v příkladu 2, aktivitu hydrolázy 2,.5 /mol 7-ADCK/min/mg suché hmoty buněk, tj. asi 100% zvýšení aktivity, á to bez potřeby induktoru.

Příklad 2

Do 500 ml Erlenmayerových baněk bylo dáno po 50 ml živné půdy tohoto složení: 1 % pepton, 0,4 % hovězí extrakt, 0,2 % kvasničný extrakt, 0,5 % chlorid sodný. Po sterilizaci a zaočkování kmenem Pseudomonas sp. CCM 3635, získaným podle příkladu 1, bylo inkubováno na rotačním třepacím stroji při 28 až 29 °C po dobu 48 h.

Poté bylo 5 ml narostlé kultury použito pro inkubaci 100 ml živné půdy v 500ml varných baňkách. Tato živná půda obsahovala 5 % kyselého bílkovinného hydrolyzátu, 0,1 % kukuřičného extraktu a 0,5 % kvasničného extraktu /pH 7,2, sterilizace při 120 °C 20 min/.

Po Inkubaci po dobu 45 h na rotačním třepacím stroji při teplotě 28 až 29 °C, byly narostlé buňky shromážděny odstředěním /10 000 ot./min, 10 min/, promyty stejným objemem 0,1 M fosfátového pufru s hodnotou pH 7,0 a po opětném odstředění byly suspendovány v témže pufru, a to v koncentraci 20 mg suché hmoty/ml.

ml připravené suspenze buněk bylo smíseno s 50 ml 0,1 M fosfátového pufru, obsahujícího 1,2 g glutaryl-7-ACK /obsah účinné látky v substrátu činil 88 %/, jehož pH bylo upraveno 1% roztokem hydroxidu sodného na 7,0.

Reakce probíhala 4 h při teplotě 37 °c. Po odstranění buněk odstředěním byla prokázána 7-ACK v koncentraci odpovídající 90% konverzi. 7-ACK byla izolována po desetinásobném zahuštění srážením 2 N kyselinou chlorovodíkovou na pH 3,2 a oddělením sraženiny po stání přes noc při 5 °C.

Výtěžek 647 mg 7-ACK s obsahem účinné látky 83 %, celkový výtěžek čisté látky 72,2 i.

Příklad 3

Do 500ml baněk bylo umístěno po 100 ml živné půdy tohoto složení: 2 % glukóza,

0,4 % dihydrogenfosforečnan draselný, 0,1 i síran hořečnatý kryst., 0,05 % chlorid vápenatý, 0,01 % kyselina boritá, 0,004 % molybdenan amonný kryst;, 0,04 % síran manganatý kryst.,

0,004 % síran zinečnatý kryst., 0,045 i síran mědnatý kryst;, 0,025 % síran železnatý kryst,, 2 . 10~⁵ % blotin, 1 . 10^-3 % thiamin, 0,3 % D,L-methionin /glukóza a vitaminy sterilizovány filtrací, pH půdy 6,0/.

Po zaočkování kmenem Trigonopsis variabilis CBS 4095 bylo kultivováno na rotačním třepacím stroji /240 ot./min/ 72 h při 29 °c. Poté byly 2 ml vyrostlé kultury použity pro inokulaci 100 ml živné půdy výše uvedeného složení a ta inkubována za stejných podmínek 72 h.

Buňky byly odstředěny, permeabilizovány a dvakrát promyty pětinásobným objemem pufru. Permeabillzace probíhalá 90 min při 29 °C v suspenzi, obsahující asi 30 mg suché hmoty buněk/ml 0,1 M fosfátového pufru o pH 8,1 a 10 % toluenu.

g draselné sole cefalosporinu C bylo rozpuštěno v 0,1 M fosfátovém pufru o pH 8,1 do objemu 100 ml, přidáno 0,025 % azidu sodného a buňky Trigonopsis variabilis, připravené výše uvedeným způsobem, v koncentraci 2 mg suché hmoty/ml.

Reakční směs byla aerována 2 h při 33 °C. Stupeň konverze cefalosporinu C na glutaryl-7-ACK byl 77 až 90 %.

K získanému roztoku glutaryl-7-ACK byly přidány buňky Pseudomonas sp. CCM 3635, získané podle příkladu 2, v koncentraci 10 mg suché hmoty/ml a směs byla Inkubována za míchání 4 h při 37 °C.

Poté byly buňky odstraněny odstředěním /10 000 ot./min, 10 min/ a v supernatantu stanovena 7-ACK v koncentraci odpovídající 80% konverzi glutaryl-7-ACK.

Příklad 4

Buňky Pseudomonas sp. CCM 3635 byly připraveny způsobem popsaným v příkladu 2 a smíseny s roztokem obsahujícím glutaryl-7-ACK /6 mg účinné látky/ml/, získaným působením buněk Trigonopsis variabilis v přítomnosti 0,1 % azidu sodného na cefalosporin c v bohatých eluátech z jeho purifikaoe. Konverze na 7-ACK proběhla z 80 %.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Kmen mikroorganismu Pseudomonas sp. CCM 3635, produkující vnitrobuněčnou hydrolázu, která katalyzuje deacylaci 7-beta-/4-karboxybutanamido/-cefalosporánové kyseliny a jejích derivátů obecného vzorce II

   R-CO-HNςχ

   CH,X /11/,

   COOH ve kterém R značí skupinu -/C»_o/_o-C00H nebo -/CH,/ -CO-COOH, a X značí atom vodíku,

   £. i a J skupinu -OH, -OCOCH^ nebo nukleofilní skupinu, obsažených ve vodných roztocích, za vzniku odpovídajících 7-aminocefensloučenin obecného vzorce I

   COOH ve kterém X značí totéž co ve vzorci II.