CS236662B2 - Způsob výroby peptidů - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby peptidů obecného vzorce I

A—B—C (I) kde

A znamená zbytek ze skupiny L-pyroglutamylu, D-pyroglutamylu a L-homopyroglutamylu,

B znamená zbytek ze skupiny L-histidylu, D-histidylu a L-3‘-methylhistidylu, a

C znamená zbytek ze skupiny glycinu, glycinamidu a jeho alkylamidů s 1 až 6 atomy uhlíku a D-alaninu, s podmínkou, že

C má jiný význam než glycin nebo glycinamid, pokud

A znamená L-pyroglutamyl a

B znamená L-histidyl.

a jejich farmakologicky snášenlivých solí.

Vynález se dále týká způsobu výroby sloučenin obecného vzorce I, meziproduktů používaných při tomto způsobu a použití těchto sloučenin jako prostředků způsobujících ztrátu chuti k jídlu, které se hodí k ošetřování otylosti a dalších patologických stavů, při kterých je radno snížit příjem potravin nebo krmivá u savců, stejně jako použití těchto sloučenin k ošetřování patologických stavů, při kterých dochází k přeby2 tečnému vylučování žaludeční kyseliny a tekutin slinivky břišní, jako při žaludečních a dvanáctníkových vředech nebo akutní pankreatitidě a při ošetřování určitých kritických stavů centrálního nervového systému, jako při poruchách vědomí nebo spavosti způsobené poraněním mozku.

Zkratky použité pro aminokyseliny a jejich zbytky, stejně jako pro ochranné skupiny spočívají na doporučeních komise pro biochemickou nomenklaturu IUPAC-IUB (viz Biochemistry, sv. 11 (1972), str. 1726). Jejich příklady jsou (Pyroj-Glu = 5-oxoprolin neboli kyselina pyriglutamová, homo-(pyro)-Glu = kyselina homopyroglutamová, His = histidin, Nⁱⁿ-3-His = 3‘-methylhistidin, Phe - fenylalanin, p-NHžPhe = p-aminofenylalanin, /?-(pyrazolyl-l jAla (Ž-(pyrazol-l-ylj-alanin, Gly = glycin, Gly-ol = 2-aminoethanol a Thi = β- (2-thienyl) alanin.

Všechny aminokyseliny mají přirozenou nebo L-konfiguraci, pokud není uvedeno jinak. D-His je zbytek D-histidinu, D-(pyro)-Glu je zbytek kyseliny D-pyroglutamové a D-Ala je zbytek D-alaninu. Zkratky Me a Et se používají pro methyl a ethyl. Pro ochranné skupiny je použito například těchto zkratek:

23666 2

Boc = terč. butyloxykarbonyl,

Z == benzyloxykarbohyl,

Tos = tosyl,

Dnp - dinitrofenyl a

N^im = imidazolový dusík histidinu;

Y je vhodná zakotvená na pevném pryskyřičném nosiči připojená skupina použitá při syntéze pevné fáze, především —O—CH2—

Humorální řízení chuti, zvláště hypotalamem, se diskutuje již řadu let, viz například přehledný článek od Schally-e a spol. v Am. J. Med. Sci., sv. 248(1964], str. 79 a v něm jmenovaná literatura. Od této doby je známo, že hypotalamus se podílí na řízení příjmu potravin. Elektrická stimulace laterální části hypotalamu vede k hyperfagii a jeho zničení k nemožnosti polykat. Naproti tomu působí stimulace ventromediálního jádra zmenšení příjmu potravin a jeho zničení hyperfugii a otylost.

Syndrom otylosti, který je vyvoláván podáním zlaté soli thioglukózy je z části důsledkem hyperfagie spojené s poškozením hypotalamu, které se vyvolává tímto prostředkem. Teorie neutrálního řízení hladu, chuti a pocitu nasycenosti je diskutována různými autory. Jsou navrženy různé mechanismy:

1. Termostatická teorie

Podle této teorie chuť řídí speciální dynamický účinek potravy a jeho vliv na tělesnou teplotu.

2. Chemostatická teorie

Tyto teorie předpokládají, že se chuť řídí intracelulární nemo extracelulární koncentrací glukózy (glukostatická teorie), lipidů (lipostatická teorie] a různých metabolitů, jako sérum-aminokyselin.

3. Další skupina teorií předpokládá, že chuť regulují pocity zažívacího ústrojí, které nastávají při jídle a za přítomnosti potravin v žaludku a ve střevě. K těmto faktorům, které se podílejí na vzniku pocitu nasycenosti nebo se projevují odmítnutím přijímat potraviny, přísluší roztažení žaludku příjmem látek, které nejsou výživné. Stahy žaludku se mohou brát v úvahu v souvislosti s chováním se za hladu, avšak tyto stahy jsou u zvířat, která byla umělým poškozením hypotalamu uvedena do afagického nebo hyperfagického stavu, přičemž tyto stahy jsou stejné jako u zvířat, kterým se odpírá žrádlo a voda.

Tyto teorie však nevedou k vysvětlení všech objevů zjištěných *pokusy. K tomu přísluší, že diabetická zvířata mohou pociťovat hlad. Schally a spol, ve výše citované publikaci se domnívají, že otylost objevující se při poškození hypotalamu se spíše přenáší hurnorálním než neurogenním mechanismem, a že hypotalamus možná vyvíjí látku, která se podílí na ústředním řízení chuti. Jsou objasňovány předběžné objevy, které poukazují na to, že v neurohypofysním extraktu je přítomna látka, která ovlivňuje dynamickou fázi vzrůstu hmotnosti u myší ošetřovaných zlatou solí thioglykózy.

Dále byl otištěn novější kratší přehledný článek Schally a spol. o stavu výzkumu, týkajícího se kontroly příjmu potravin hypotalamem a otylosti (viz Recent Progress in Hormone Research, Proceedings of the 1967 Laurentian Hormone Conference, sv. 24 (1968), str. 497, zvláště str. 570 a 571 a tam jmenovaná literatura. K těmto literárním pracím náleží práce Schally a Mitarba v Science, sv. 157 (1967) str. 210, kde je ukázáno, že podání enterogastronu isolovaného z dvanáctníku psa zmenší příjem potravin u myší ponechaných 17 hodin bez žrádla. Tento účinek je největší během prvních 30 minut, avšak kumulativní snížení trvá alespoň 4 hodiny. Jiné peptidy, izolované z dvanáctníku nebo tračníku psa, jako glukagon, sekretin, glukóza a albumin z hovězího séra, se ukazují jako neúčinné. Tito autoři se domnívají, že tyto účinky na přímé odstranění stahů hladových žaludků dlužno tím vysvětlit, nebo že byly vyvolávány centrálním nervovým systémem vlivem uvolňování látky z hypotalamu, třebaže pozitivní důkaz pro hypertalamové neurotekutiny, které jsou odpovědné za přímé nebo nepřímé řízení chuti, nemohl být tehdy ještě proveden.

Zdá se, že tento positivní důkaz podal Trygstad a spol. v Acta Endokrinologica, sv. 89 (1978), str. 196. Tito autoři Izolovali určitý počet peptidů z moči pacientů, kteří trpěli vrozenými všeobecnými poruchami látkové přeměny tuků (hypotalamový syndrom). Tyto peptidy vyvolávaly odpovídající výsledky látkové výměny. Nervózní nechutenství se pojí s poruchami hypotalamu. Při primárním nervózním nechutenství ovlivněném hypotalamem se naruší osa hypotalamus-hypofysa, což vede k nepatrnému uvolnění gonadotropinu, vynechání menstruace, ztrátě denního rytmu ACTH-vylučování, zmenšenému vylučování thyrotropinu a počátečnímu vzestupu a později úbytku ve vylučování somatotropinu.

Sraženiny z močové zkoušky u 25 pacientů s nervózním nechutenstvím se chromatografovaly na sloupci naplněném Sephadexem G-25-gel. Následovalo rozdělení na čtyři rozdílné chromatografické vzorky: Jeden se podobal vzorku normálních kontrolních osob, druhý se podobal schizofrenickým pacientům, u pěti pacientů s hysterickou for2 3 δ 5 δ 2 mou neurózy se ukázal třetí vzor a 10 'dávek s primárním „typem hypotalamiu*“ nervózního nechutenství se ukázal rovněž typický chromatogram. Frakce s vlivem na nechutenství u myší byly nalezeny pouze v poslední skupině. Pomocí většího počtu chromaíografických stupňů se izolují 'dva peptidy ovlivňující chuť k jídlu. Podávají-li se injekce těchto peptidů myším, jeden z nich vyvolává zvýšenou chuť k jídlu, zatímco druhý tuto chuť k jídlu snižuje. Peptidy jsou obaleny proteinovým nosičem peptidu a tak chráněny proti enzymatickému odbourávání, což umožňuje jejich izolaci z moči.

Strukturu peptidu vyvolávajícího nechuť k jídlu objasnil Reichelt a spol. v Neuroscience, sv. 3 (1978), str. 1207 v úzké spolupráci s Trygstadem. Jde o tripeptid H-( pyro )-Glu-His-Gly-OH, což bylo potvrzeno syntézou.

Při injekci 12 nmol peptidu omezujícího chuť k jídlu podávané denně myši po dobu 20 dnů poklesl příjem potravy na dobu asi 6 měsíců z 5,7 na 3,0 g denně. Tělesná hmotnost poklesla z průměrných 35 g na minimum 24 g.

Tripeptid nemá žádný akutní účinek na hladinu glukózy v krvi a na hladinu insulinu v séru a zřejmě působí na receptory v centrech hypotaUmu řídicích chuť k jídlu.

Peptid podporující chuť k jídlu zvyšuje denní příjem potravy nad 10 g, přičemž tělesná hmotnost stoupla v průměru na 57 g. Struktura peptidu podporujícího chuť k jídlu nemohla být identifikována.

Dva podobné faktory, které ukazují chování zvyšující a snižující příjem potravy, se izolovaly také u pacientů s geneticky podmíněnou metabolickou otylostí.

Podle vynálezu nyní bylo objeveno, že peptidy obecného vzorce I

A—B—C (I) kde

A. B a C mají výše uvedený význam, jsou aktivnější a mají déle udržovanou aktivitu s ohledem na snížení chuti k jídlu a příjem potravin, než je tomu u tripeptidu pyroglutamyl-histidyl-glycinu [ H- (pyro) -Glu-His-Gly-OH], který Trygstad a spol. (viz výšej, stejně jako Reichelt a spol. (viz výšej izolovali, jako v tomto případě. Peptidy obecného vzorce I a jejich farmakologicky snášenlivé soli, které jsou biologicky ekvivalentní výše jmenovaným peptidům, jsou tudíž cenné prostředky zabraňující chuti k jídlu, vhodné pro ošetřování otylosti a s tím spojených patologických stavů, při kterých je žádoucí snížit příjem potravin. Tyto účinné látky snižují tak vylučování žaludečních šťáv, a šťáv slinivky břišní. Hodí se proto také k ošetřování patologických stavů, při kterých dochází k přebytečné tvorbě kyseliny žaludeční a/nebo tekutiny slinivky břišní. Kromě toho mají určitý účinek na centrální nervový systém, takže jsou vhodné pro akutní ošetřování poruch vědomí.

Sloučeniny podle vynálezu mají proti přírodnímu tripeptidu přednost v lom, že jsou aktivnější a dále si udržují svůj účinek. Tyto, obě výhody mají zvláštní praktický význam. Na základě nepatrných· minimálních účinných· dávek se dosahuje snížení vedlejších účinků,·stejně jako nákladů pro výrobu těchto sloučenin. Na základě déle trvajícího účinku je potřebné méně časté podávání léku.

Na základě skutečnosti, že peptidy obecného vzorce I a jejich fyziologicky snášenlivé soli jsou biologicky ekvivalentní, v celém předcházejícím i následujícím textu se odkazům na sloučeniny obecného vzorce I má rozumět tak, že mezi peptidy jsou zahrnuty peptidy samotné a také jejich soli.

Předmětem vynálezu jsou také chráněné meziprodukty, které jsou vázány na pevném pryskyřičném nosiči a které se používají k výrobě sloučenin obecného vzorce I.

Jako ochranné skupiny při postupné syntéze meziproduktů v pevné fázi se mohou použít takové skupiny, které se mohou odstranit jedním nebo několikerým chemickým zpracováním, aniž by to bylo na újmu požadovanému konečnému produktu obecného vzorce I. S výhodou se tyto ochranné skupiny volí tak, že se v jediném stupni mohou odstranit dohromady s jinými ochrannými skupinami, například společně se zakotvenou skupinou Y definovanou výše. Zvláště vhodná ochranná skupina R², která se používá při postupné syntéze zmíněných meziproduktů v pevné fázi, je terc.butyloxykarbonylová skupina (BOCJ.

Výhodné ochranné skupiny R³ k ochraně imidazolového dusíku histidinu jsou tosyl (Tosj a dinitrofenyl (Dnp). Vhodná ochranná skupina R¹ k ochraně fenylaminoskupiny v p-aminoíenylalaninu je benzyloxykarbonylová skupina (Zj. Vhodná zakotvená skupina k vytvoření vazby s pryskyřičným nosičem je výše definovaná skupina Y, například —O—CH>—. Zmíněné ochranné skupiny jsou stabilní proti reagenciím a za reakčních podmínek., které se používají k odstranění ochranné skupiny na koncové aminoskupině a při následujících kupulačních reakcích.

Výraz „nižší alkyl“ znamená přímý nebo rozvětvený alkyiový zbytek s 1 až 3 atomy uhlíku.

Peptidy obecného vzorce I se vyrábějí postupnou syntézou na pevné fázi počínaje od koncové karboxylové skupiny. Tento postup se může v krátkosti vyjádřit tímto způsobem:

Způsob podle vynálezu spočívá v tom, že se váže chráněná aminokyselina na bázi zbytků s významy uvedeným pro C, chráněná na α-aminoskupině, v přítomnosti katalyzátoru na pryskyřičný nosič ze skupiny hydroxyethylovaných a chlormethylovaných pryskyřic, za vzniku odpovídající sloučeniny obecného vzorce (chráněný zbytek C) — O — CH2 — (pryskyřičríý nosič.).

z této sloučeniny se odstraní skupina chránící α-aminoskupinu a výsledná sloučenina se váže za chráněnou aminokyselip.u na bázi zbytků s významy uvedenými pro B, chráněnou na α-aminoskupině, v přítomnosti dialkylkarbodiimidu se 2 až 10 atomy uhlíku v alkylových skupinách nebo dicykloalkylkarbodiimidu se 6 až 10 atomy uhlíku v cykloalkylových skupinách, za vzniku odpovídajícího chráněného peptidů připojeného k pryskyřičném nosiči zakotvenou skupinou —-O—CH2—, z této sloučeniny se odstraní skupina chránící α-aminoskupinu a vzniklá sloučenina se váže s chráněnou aaminokyselinou na bází zbytků s významy uvedenými pro A, chráněnou na a-aminoskupině, v přítomnosti dialkylkarbodiimidu se 2 až 10 atomy uhlíku v alkylových skupinách nebo dicykloalkylkarbodiimidu se 6 až 10 atomy uhlíku v cykloalkylových skupinách, za vzniku odpovídajícího chráněného peptidů připojeného k pryskyřičnému nosiči zakotvenou skupinou O—-CH2—, z této sloučeniny se odstraní ochranné skupiny, výsledný peptid uvedeného obecného vzorce I se odštěpí od pryskyřičného nosiče a izoluje odpovídající peptid, který se popřípadě zpracuje s farmaceuticky přijatelnou kyselinou a vzniká odpovídající farmaceuticky přijatelná sůl peptidů se izoluje.

Dále se uvádí podrobnější objasnění způsobu podle vynálezu a to v širších souvislostech.

Aminokyselina speciálně vybraná pro C nebo pro B, kde C znamená skupinu NHR¹ s R¹ ve významu nižšího alkylu, která na α-aminoskupině má vhodnou ochrannou skupinu nebo popřípadě jinou ochrannou skupinu a výše definovanou skupinou Y je vázána s pryskyřičným nosičem, se podrobí zpracování za účelem odstranění ochranné skupiny na α-aminoskupině a dále se váže s určitou aminokyselinou pro B nebo A, když C má výše uvedený význam NHR¹, přičemž jako prostředek umožňující vazbu se volí vhodný dialkylkarbodiimid nebo dicykloalkylkarbodiimld. Uvedený postup se opakuje tak dlouho, až se navzájem naváže požadovaný počet aminokyselin. Potom se odstraní ochranná skupina na koncové aminoskupině, stejně jako popřípadě přítomné jiné ochranné skupiny a zakotvená skupina Y. Po odstranění rozpouštědla se získá požadovaný surový peptid. Surový produkt se čistí chromatograficky, například gelovou filtrací a tím se dostane požadovaný peptid v čistém stavu.

Výchozí látky používané pro výrobu peptidů obecného vzorce I jsou buď komerčně dostupné sloučeniny nebo se dají lehko vyrobit podle způsobů, které jsou jako takové známy. Všechny aminokyseliny používané k syntéze uvedených pepitdů jsou dostupné na trhu s výjimkou kyseliny homo-(pyroj-glvtaminové, jejíž výrobu popsal Gréenstein a Winitz v „Chemistry of the Amino Acids“, J. Wiley, New York, 1961, str. 2407 až '2462 a (3-(2-thienyl)alaninu, jehož výroba je uvedena v jmenovaném literárním odkazu na str. 2707.

Vhodné pevné pryskyřičné nosiče jsou chlormethylované a hydroxymethylované pryskyřice, přičemž chlormethylované pryskyřice jsou výhodné. S ohledem na výrobu hydroxymethylovaných pryskyřic se poukazuje na článek, jehož autory jsou M. Bodansky a J. T. Sheehan, Chem. Ind., London, sv. 38 (1966), str. 1597. Chlormethylované pryskyřice je dostupná na trhu. Při použití chlormethylované pryskyřice se tvoří ester-zakotvená skupina s aminokyselinou C (nebo B, když C znamená shora vymezenou skupinu NHR¹) chráněnou na a-aminoskupině, přičemž popřípadě jsou přítomny další ochranné skupiny.

(chráněný C nebo Bj — O—CH2—

Účelný způsob převedení vázaného chráněného peptidů na C-koncový (nižší alkyljamid spočívá v odštěpení chráněného peptidu od pryskyřice, zpracováním s nižším alkylaminem, viz D. H. Coy a spol., Biochem. Biophys. Res. Commun., sv. 57 (1974), str. 335, čímž se získá odpovídající chráněný peptid-(nižší alkyl)-amid. Nakonec se odsiř ani ochranná skupina ze vzniklého peptid-(nižšího alkyl)amidu zpracováním se sodíkem a kapalným amoniakem nebo s výhodou štěpením s chlorovodíkem, přičemž se získá odpovídající peptid podle vynálezu. Další způsob výroby spočívá v tom, že se štěpení provádí přeesterifikací nižším alkanolem, s výhodou methanolem nebo ethanolem, v přítomnosti triethylaminu, čímž se dostane odpovídající ester. Tento ester se může převést na odpovídající (nižší alkyl)amid a konečně se mohou výše předepsaným způsobem odstranit ochranné skupiny. Požaduje-li se, aby vznikla volná karboxylové skupina, provádí se štěpení s výhodou fluorovodíkem v anisolu. Pokud je žádoucí vznik amidu kyseliny, provádí se štěpení amoniakem. S ohledem na to se poukazuje na publikaci od J. M. Stewarta a J. D. Younga, „Solid Phase Peptide Synthesis“, W. H. Freeman CO., San Francisco, 1969, str. 40 až 49.

Podle jedné formy provedení vynálezu se glycin chráněný na α-aminoskupině, s výhodou terc.-butyloxykarbonylglycin, váže na chlormethylovanou pryskyřici pomocí katalyzátoru, s výhodou hydrogenuhličitanu ces236BB2 ného nebo triethylaminu. Po-vzniku* vazby glycinu chráněného na α-aminoskupině na pryskyřičný nosič se odstraní α-amino ochranná skupina, například za použití kyseliny trifluoroctové v methylenchloridu, kyseliny trifluoroctové samotné nebo kyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Odstranění ochranné skupiny se provádí při teplotě asi 0 °C až teplotou místnosti. K odstranění zvláštních α-amino ochranných skupin se mohou použít také jiné standardní reagencie způsobující štěpení a standardní podmínky (viz E. Schroder a K. Lubke, „The Peptides“, sv. 1, Academie Press, New York, 1965, str. 72 až 75). Po odstranění «-amino ochranné skupiny se zbývající aminokyseliny chráněné na α-amlnoskupině postupně v požadovaném pořadí váží za vzniku žádaného peptidu. Požadované aminokyseliny se vždy vnáší v trojnásobném přebytku do reaktoru pro pevnou fázi. Reakce vedoucí ke vzniku vazby se provádí v methylenchloridu nebo ve směsi dimethylformamidu a methylenchloridu. V případě, kdy vázání neproběhne zcela, postup vedoucí ke vzniku vazby se opakuje před odstraněním α-amino ochranné skupiny a před vázáním příští aminokyseliny na pevnou fázi. Úspěšný průběh reakce vedoucí ke vzniku vazby v jednotlivých syntézních stupních se sleduje pomocí ninhydrinové reakce podle E. Kaisera a spol., Analyt. Biochem., sv. (1970), str. 595.

Po provedení syntézy požadované části aminokyseliny se chráněný peptid odstraní z pryskyřičného nosiče zpracováním s nižším alkylaminem za vzniku chráněného peptid-(nižší alkyl)aminu. Při použití dinitrofenylu nebo tos-ylu jako ochranné skupiny pro histidylový zbytek se tyto ochranné skupiny rovněž odstraní během zpracování s nižším alkylaminem. Peptid se může oddělit od pryskyřice také přeesterifikací nižším alkanolem, s výhodou methanolem nebo ethanolem,. v přítomnosti triethylaminu, a potom získaný ester chromatograficky na silikagelu, Požadovaná frakce se může podrobit zpracování s nižším alkylaminem za převedení nižšího alkylesteru, s výhodou methylesteru nebo ethylesíeru, v karboxyl-terminál ií nižší alkylamid. Je zapotřebí dát pozor na to, že dinitrofenylové nebo tosylové skupiny přítomné na histidylovém zbytku se popřípadě odštěpí. Zbývající ochranné skupiny bočních řetězců chráněného, alkylarnidu se tak odštěpí podle shora vysvětleného postupu, například zpracováním se sodíkem v kapalném amoniaku nebo s fluorovodíkem. Oddělení požadovaného peptidu z pryskyřičného nosiče se může provádět také amoniakem za vzniku odpovídajícího amidu nebo s fluorovodíkem a anisolem za vzniku odpovídající volné kyseliny. Peptid obecného vzorce I, ve kterém C znamená 2-aminohydroxyethyl(Gly-ol), se vyrábí štěpením A—B-dipeptid-pryskyřice s 2-aminoethanolem. Je zapotřebí dát pozor na to, že při tomto postupu se popřípadě odštěpí dinitro10 fenylové nebo tosylové skupiny přítomné na histidylovém zbytku.

Jak již bylo uvedeno, mohou se peptidy obecného vzorce I získat také ve formě solí s kyselinami. Jejich příklady jsou soli s organickými kyselinami, jako kyselinou octovou, kyselinou mléčnou, kyselinou jantarovou, kyselinou benzoovou, kyselinou saíicylovou, kyselinou methansulfonovou a kyselinou toluensulfonovou, polymerními kyselinami, jako taninem, karboxymethylcelulózou a anorgonickými kyselinami, jako kyselinami halogenovodíkovými, například kyselinou chlorovodíkovou, stejně jako kyselinou sírovou a kyselinou fosforečnou.

Jednotlivé soli s kyselinami se popřípadě mohou převést na jiné soli s kyselinami, například na ty, které jsou netoxické a farmakologiícky snášenlivé, když se podle R. A. Boissonnas a spol., Helv. Chim. Acta., sv. 43 (1960 J, str. 1 349 provede zpracování s vhodnou iontoměničovou pryskyřicí.

Příkladem vhodných iontoměničových pryskyřic jsou katexy na bázi celulózy, jako karboxymetihylcelulózy nebo chemicky modifikované, zesíťované dextranové kationtoměniče, například typu Sephadex C, stejně jako silně bazické aniontoměničové pryskyřice, které uvádí J. P. Greenstein a M. Winitz v „Chemistry of the Amino· Acids“, John Wiley and Sons. Inc., New York a Londýn, 1961, sv. 2, str. 1 456.

Peptidy obecného vzorce I a jejich soli mají cenné a dlouhotrvající účinky, a to účinek způsobující nechutenství, účinek zabraňující vylučování žaludečních šťáv a šťáv slinivky břišní, stejně jako aktivní účinek na centrální nervový systém.

Účinek omezující chuť k jídlu a anorexigenní účinek peptidů obecného vzorce I se může stanovit při pokusu přijímání potravy na myších, krysách nebo psech pokusem, který popsal ve shora zmíněných publikacích Trygstad a spol. a von Reichela spol. Potlačující účinek peptidů obecného vzorce I na vylučování šťáv v žaludku a slinivce břišní se stanoví na bdících krysách nebo s výhodou na bdících psech s pištěli hltanovou, žaludeční a pro slinivku břišní nebo se také určuje na psech s Heidsnhainovým vakem, viz Β. P. Babkin, „Secretion Mechanism of Digestive Glands'*, 2. vyd., Β. P. Hoeber, New York, 1950, podle citace „Physiology“, Hrsg. E. Selkurt, Little, Brown and Company, Boston, 1963, str. 542 až 544: L. Olbe, Gastroenterology, sv. 32 (1959J, str. 460; Antin a spol., Journal of Comparative and Physiological Psychology, sv. 89 (1975), str. 784 a Liebling a spol., tamtéž, sv. 89 (1975), strana 955.

Účinek peptidů obecného vzorce I na centrální nervový systém, zvláště jejich charakteristické spektrum nervových účinků, se může stanovit řadou testů centrálního nervového systému, viz například A. J. Kastin, R. D. Olson, A. V. Schally a D. H. Coy,

It

Life Scineces, sv. 25 (1975), str. 401; A. J. Prange, G. R. Breesé, J. M. Cott, B. R. Mar in, B. R. Cooper, I. C. Wilson a N. P. Plotniikbff, Life Sciences, sv. 14 (1974), str. 447 a M. Brown a W. Vale, Endocrinology, sv, 96 (1975), str. 1 333.

Myším, krysám a psům se dává přednost jako pokusným zvířatům ke stanovení účinků omezujících chuť k jídlu a anorexigenních účinků léčiv, stejně jako ke stanovení potlačujícího účinku na vylučování šťáv žaludku a/nebo slinivky břišní, protože v mnoha případech jsou vynikající paralely mezi pokusnými zvířaty a klinickými vyšetřeními na lidech, například u lidí s řízenou orální nebo intragastricfcou výživou s kapalnou dietou, viz H. A. Jordán, Journal of Comparative and Physiological Psychology, sv. 68 (1969), str. 498; G. A. Bray a F. L. Greenway, Clinics In Endocrinology and Metabolism, sv. 5 (1976), str. 455 a H. D. Janowltz, „Role of gastrointestinal tract in regulation of food Intake“, citováno v- „Handbook of Physiology“, odstavec 6, Alimentary Canal., Hrsg. C. R. Code a W. Heidel, American Physiological Society, Washington, 1967.

Účinek peptidů obecného vzorce I a jejich farmakologicky snášenlivých solí jako prostředků omezujících chuť k jídlu a anorexigenních prostředků se může ukázat za použití krys. Krysám jako pokusným zvířatům se dává přednost k důkazu účinku léčiv, která omezují příjem potravy.

Různí autoři stanovili souběžnost mezi výsledky na krysách a na lidech, viz například G. A. Bray v „The Obese Patient“, sv. IX z „Major Problems in Internal Medicine“, W. B. Saunders Company, Philadelphia, London, Toronto, 1976.

V kapitole 9 v názvu „Drug Therapy for the Obese Patient“ jsou v odstavci „Pharmacology — Effects on the Central Nervous System“, na str. 364, tabulka 9—4 uvedeny údaje, které ukazují omezení příjmu potravy u krys vyvolané řadou anorexigenních léčiv. V odstavci „Clinical Use of Anorectic Drugs“ je na str. 369, tabulka 9—7 uvedeno, že stejná léčiva jako v tabulce 9—4 se hodí také pro klinické použití.

Na základě uvedených vlastností jsou peptidy obecného vzorce I vhodné k podávání savcům ve veterinárním a také humánním lékařství.

Peptidy na základě vlastností omezujících chuť k jídlu a anorexigenních vlastností se hodí fc ošetřování otylosti včetně předoperačního snížení tělesné hmotnosti, které je často vhodné u otylých pacientů před většími zásahy. Peptidy jsou cenné na základě jejich vlastností také k ošetřování jiných patologických stavů, které vyžadují snížení příjmu potravy a tělesné hmotnosti, například při určitých formách cukrovky nebo chorobách oběhového systému.

Peptidy obecného vzorce I jsou vhodné na základě jejich účinku omezujícího vylučování žaludeční kyseliny a tekutin slinivky *

břišní k ošetřování patologických stavů, které přicházejí s žaludeční a/nebo pankreatickou hypersekrecí žaludeční kyseliny nebo gastrinu, pepsinu nebo histaminu, například při žaludečních vředech nebo akutní pankretitidě.

Účinek peptidů obecného vzorce I na centrální nervový systém ukazuje neurotropní profil účinku, který se významně liší od profilu tricyklických antidepresních prostředků a obvyklých léčiv. Na základě aktivního účinku na centrální nervový systém jsou peptidy obecného vzorce I cenné účinné látky k ošetřování poruch vědomí nebo dlouho trvajícího, uměle nepřerušitelného hlubokého bezvědomí na základě poranění mozku, například v případě cerebrálního traumatu nebo zhoubného nádoru, v těžkých případech omrznutí nebo při určitých pooperačníoh sitavech, stejně jako při poruše vědomí způsobené u určitých onemocnění cév nebo nadměrným použitím léku (například při intoxikaci léčivem).

Při použití peptidů obecného vzorce I nebo jejich farmakologicky snášenlivých solí u savců jako prostředku omezujícího chuť k jídlu nebo anorexigenního prostředku k ošetřování otylosti nebo jiných patologických stavů, které vyžadují zmenšení příjmu potravin, při jejich použití jako prostředku k zamezení přebytečného vylučování šťáv žaludku nebo slinivky břišní nebo při jejich použití jako aktivních prostředků pro centrální nervový systém, například na myších, krysách nebo psech, se mohou tyto účinné látky používat samotné nebo společně s farmakologicky snášenlivými nosiči.

Poměr léčiva a nosiče se stanoví podle rozpustnosti a chemické povahy sloučeniny, cesty podání a obvyklé biologické praxe. Množství účinné látky, které postačuje ke snížení chuti k jídlu a/nebo příjmu potravin, se může například podávat orálně v pevné formě společně s nosiči, jako škroby, cukrem, stanovenými druhy hlinek a podobně.

Podobným způsobem se může odpovídající množství podat orálně ve formě roztoku nebo suspenze. Sloučeniny se mohou podávat také parenterálními injekcemi. Pro orální nebo parenterální podání se používá sterilních roztoků nebo suspenzí ve farmakologicky snášenlivých kapalných nosičích, jako vodě, ethanolu, propylenglykolu nebo polyethylenglykolu, které obsahují tekuté látky nébo suspendační prostředky, například k výrobě isotonických roztoků postačující množství kuchyňské soli nebo glukózy, soli žlučových kyselin, arabskou gumu, želatinu, sorbitanoleát, polysorbát 80 (oleát sorbitu a jeho anhydridu kopolymerovaného s ethylenoxidem), jako Tween 80.

Dávkování peptidů obecného vzorce I závisí na cestě podání a na speciálně zvolené sloučenině a kromě toho závisí na jednotlivé osobě určené k ošetření. Obecně se ošetřování začíná s malými dávkami, které v _ 2366 podstatě jsou pod optimální dávkou sloučeniny. Potom se dávkování zvyšuje po malých úsecích, až se docílí optimálního účinku za daných podmínek.

Obecně se ošetřuje sloučeninou v množství, které vyvolává snížení chuti k jídlu a/nebo příjmu potravy, zabraňuje vylučování šťáv žaludku a/nebo slinivky břišnní nebo aktivaci centrálního nervového systému, aniž by docházelo k škodlivým nebo nevýhodným vedlejším účinkům. Takovéto dávky obecně jsou v rozmezí asi 1,0 až 250 ,ug na kilogram tělesné hmotnosti za den, i když jak již bylo uvedeno, tyto dávky se mohou měnit. Zvláště výhodné je dávkování v rozmezí asi 5 až asi 100 μξ na kilogram za den, s výhodou v dělených dávkách.

Jednotlivé farmakologické účinky peptidů obecného vzorce I jsou větší, vztaženo na hmotnost, než u řady léčiv, které se používají ke stejnému účelu. Kromě toho klinicky nejčastěji použivatelné prostředky omezující chuť k jídlu mají strukturu příbuznou fenathylanrnu a mají tudíž nežádoucí vedlejší účinky spojené s touto strukturou. Peptidy obecného vzorce I nemají strukturu fenethylaminu, a proto nemají jeiho vedlejší účinky. Kromě toho jsou nepatrně toxické a zaručují tak jisté použití.

Při použití peptidů obecného vzorce I, výhodně ve formě solí s kyselinami, v humánním lékařství se může provádět systemické podávánín, buď intravenózními, subkutánními nebo intramuskulárními injekcemi. nebo se může provádět subliguální nebo nasální podání, společně s farmakologicky snášenlivými nosiči.

Pro orální podání se mohou vyrábět také léčebné preparáty. K tomuto účelu se účinná látka míchá s vhodným známým farmaceutickým ředidlem a zpracovává o sobě známým způsobem na preparáty, jako tablety, kapsle, suspenze, emulze, roztoky nebo dispergovatelné prášky.

Pevné prostředky se mohou plnit do kapsli pro orální podání. Takovéto prostředky pro naplnění do kapslí mohou obsahovat pevnou látku ve směsi s pevnými materiály, které mají účinek pufru, například ve směsi s koloidním hydroxidem hlinitým nebo hydrogenfosforečnanem vápenatým nebo mohou být společně s Inertní pevnou látkou, jako laktózou.

Preparáty ve formě tablet se mohou také obvyklým způsobeni potahovat nebo se mohou připravovat ve formě pěnivých nebo nepěnivých preparátů. Přitom se mohou používat inertní ředidla a/nebo nosiče, jako uhličitan hořečnatý nebo laktóza, společně s obvyklými prostředky usnadňujícími rozpadávání, jako kukuřičným škrobem a kyselinou alginovou a pojivý, jako stearátem hořečnatým.

Pro podání nasální cestou ve formě kapek nebo postřiků se používají peptidy obecného vzorce I, s výhodou ve sterilním vodném nosiči, který může obsahovat také jiné roz-

pustné látky, jako pufry nebo konzervační prostředky, stejně jako k výrobě isotonických roztoků dostačující množství fyziologicky snášenlivých selí nebo glukózy. Dávky pro intranasální ošetření jsou v rozmezí asi 1,0 až 250 ,ug/kg/d 'nebo s výhodou asi 5 až as 100 (Ug/kg/d.

Peptidy obecného vzorce I se mohou podávat také ve formě nasálních prášků nebo prostředků pro vdechování. K tomuto účelu se podávají peptidy v jemně rozmělněné formě společně s farmakologicky snášenlivými pevnými nosiči, například rozmělněným polyethylenglykolem (Carbowax 1540), jemně rozmělněnou laktózou nebo velmi jemným oxidem křemičitým (Cab—O—Silj. Takovýto prostředek může také obsahovat jiné přísady ve formě jemných částic, jako konzervační prostředky, pufry nebo povrchově aktivní látky.

Peptidy obecného vzorce I se také mohou podávat ve formě dlouhodobě působících prostředků s pomalým uvolňováním účinné látky nebo depotním účinkem, jak je dále vysvětleno, s výhodou intramuskulární injekcí nebo implantací. Takovéto formy podání se provádějí tak, aby se uvolňovalo asi 5 až asi 100 ,«g účinnné látky na kilogram tělesné hmotnosti za den.

Často se požaduje podávat peptidy obecného vzorce I nepřetržitě nebo po delší časové období ve formě dlouhodobě působících preparátů s pomalým uvolňováním účinné látky nebo depotním účinkem. Takovéto formy preparátu mohou obsahovat buď farmakologicky snášenlivou sůl účinné sloučeniny s nepatrnou rozpustností v tělesných tekutinách, například soli s kyselinou pamoovou, taninem nebo karboxymethylcelulózu, nebo peptid obecného vzorce I ve formě soli rozpustných ve vodě, společně s ochranným prostředkem zabraňujícím velikému uvolňování.

V posledně uvedeném případě se může například peptid obecného vzorce I převést s neantlgenní částečně hydrolyzovanou želatinou do formy viskózní kapaliny nebo se peptid obecného vzorce I může absorbovat na farmakologicky snášenlivém pevném nosiči, například hydroxidu zinečnatém společně s iprotaminem.

Účinná látka může být také ve formě suspenze s farmakologicky snášenlivým kapalným nosičem. Dále je také možná výroba gelů nebo suspenzí s neantigenním ochranným hydrokoloidem, například natrlumkarboxymethylcelulózou, polyvinylpyrrolidonem, alginátem sodným, želatinou, kyselinami poiygalakturonovými, jako pektinem nebo určitými mukopolysacharidy, společně s vodnými nebo nevodnými, farmakologicky snášenlivými kapalnými nosiči, konzervačními prostředky nebo povrchově aktivními látkami. Příklady takových preparátů jsou uvedeny v obvyklých farmakologických příručkách, jako je Remingtonů Pharmaceuti236662 cal Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1975.

Dlouhodobě působící preparáty s pomalejším uvolňováním účinné látky, se také získají mikroenkapsulací ve fármakologicky snášenlivém potahovém materiálu, jako želatině, polyvinylaUkoholu nebo ethylcelulóze. Další příklady potahových materiálů a způsob mikroenkapsulace uvedl J. A. Herbig v „Encyclopedia of Chemical Technology“, sv. 13, 2. vyid., Wiley, New York, 1967, strana 436 až 456.

Takovéto preparáty, stejně jako suspenze solí peptidů obecného vzorce I, které jsou jen málo rozpustné v tělesných tekutinách, se pořídí tak, že se uvolňuje asi 5 až asi 100 (Ug peptidu na kilogram tělesné hmotnosti za den. K jejich podávání se s výhodou používá intramuskulárních injekcí. Jiná možnost spočívá v tom, že se vyrábějí některé nové preparáty, například uvedené málo ve vodě rozpustné soli nebo disperze nebo adsorbáty solí s pevnými nosiči, například disperze v neutrálním hydrogelu polymeru ethylenglykolmethakrylátu nebo podobných zesíťovaných monomerů (viz US patentový spis č. 3 55,1 556), ve formě pelet, které uvolňují výše uvedené množství účinné látky. Tyto pelety se mohou implantovat suhkutánně nebo intramuskulárně.

Určité peptidy obecného vzorce I, které jsou málo rozpustné ve vodě, se mohou připravovat jako suspenze ve vodě nebo v emulzním základu. Suspenze na vodné bázi se vyrábějí pomocí smáčidel, jako kondenzačních produktů polyethylenoxidu a alkylfenolů, alifatických alkoholů nebo mastných kyselin nebo suspendačních prostředků, jako hydrofilních koloidů, například polyvinylpyrrolidonu.

Suspenze na emulzní bázi se vyrábějí suspendováním peptidu pomocí smáčedla a suspendačního prostředku v emulzním základu, přičemž se použije výše uvedených emulgačních prostředků. Suspenze mohou dodatkově obsahovat pufr a/nebo sladidla, aromatické látky, barviva, konzervační prostředky a antioxidační prostředky.

Jak bylo objasněno výše, léčivé preparáty k orálnímu nebo parenterálnímu podání se vyrábějí ze sloučenin obecného vzorce I nebo z jejich farmakologicky snášenlivých solí tak, aby se mohlo použít 5 až 100 ,ug na kilogram/d, s výhodou v dělených dávkách. V dávkové jednotce může být obsaženo 0,3 až 15 μ% účinné látky. Pro parenterální podání se s výhodou používají vodorozpustné peptidy obecného vzorce I nebo vodorozpustné soli peptidu obecného vzorce I málo rozpustné ve vodě, ve vodném sterilním roztoku.

Příklady konzervačního prostředku jsou methylester a propylester kyseliny p-hydroxybenzoové, které společně s jinými rozpustnými podíly jako k výrobě isotonických roztoků, se přidávají v postačujícím množství, vztaženo na chlorid sodný nebo glukó16 zu. Peptidy obecného vzorce I„ které jsou málo rozpustné ve vodě, se mohou také podávat intramuskulárně ve formě roztoků nebo suspenzí ve sterilních, kapalných nevodných nosičích, například v rostlinných nebo živočišných olejích. Přitom imohou popřípadě obsahovat výše uvedené dodatkové složky roztoku nebo suspendační prostředky.

Dále je blíže objasněn způsob výroby peptidů obecného vzorce I.

Aminokyselina s koncovou karboxyskupinou, která je zvolena pro C nebo B, když C znamená výše vymezenou skupinu NHR¹, se chrání na α-aminoskupině, s výhodou terc.butoxýkarbonylem (R² = BOCJ. Chráněná kyselina je pak vázaná s hydroxymethylovanou pryskyřicí nebo s výhodou s chlormethylovanou pryskyřicí pomocí katalyzátoru, s výhodou hydrogenuhličitanu česného nebo triethylaminu. Potom se na vazbě odstraní chránící skupina na α-aminoskupině, například za použití kyseliny trifluoroctové v methylenchloridu, jak je objasněno výše, nebo pomocí jiného výše uvedeného postupu. Odstranění chránicí skupiny se provádí s výhodou za teploty 0 °C až teploty místnosti.

Jako chlormefhylované pryskyřice (1 % zesíťování) se s výhodou používají komerčně dostupné produkty.

Aminokyselina s koncovou karboxyskupinou, vázanou na pryskyřičný nosič pomocí výše vymezené zakotvené skupiny, která znamená zbytek C nebo B, pokud C představuje skupinu NHR¹, se vloží do reakční nádoby v zařízení k automatické syntéze peptidů, která je naprogramována na tento prací cyklus:

(a) methylenchlorid, (b) 33% kyselina trifluoroctová v methylenchloridu (2krát), (c) methylenchlorid, (d) ethanol, (e) chloroform, (f) 10% triethylamin v chloroformu (2k,rát), (gj chloroform a (h) methylenchlorid.

Propraná pryskyřice se potom míchá v methylenchloridu s aminokyselinou chráněnou odpovídajícím způsobem, kterou představuje zbytek B nebo A, pokud C znamená skupinu NHR¹. Jako ochranná skupina pro α-aminofunkci je výhodný terc.butylkarbonyl (BOCJ. U aminokyselin pro zbytek B je pro imidazolový dusík (N™) histidinu výhodná tosylová skupina (Tos) jako ochranná skupina.

Jako ochranná skupina pro fenylaminoSkupinu v p-aminofenylalaninu je výhodný benzyloxykarbonyl (Z); 3-Methylhistidln, (S-fpyrazolyl-ljalanin a β-( 2-t>hienyl) alanin nepotřebují s výjimkou α-aminoskupiny žádnou ochranu. V podstatě se přidá ekvivalentní množství prostředku umožňujícího vázá236602 ní, jako dicyklohexylkarbodiimidu nebo s výhodou diisopropylkarbodiimidu a směs se míchá 2 hodiny za teploty místnosti (22 až 25 °C). Potom se pryskyřice s vázanou aminoskupinou 3X promyje methylenchloridem. Ochranná skupina se z vázané aminokyseliny odstraní dvojnásobným působením 33% kyseliny trifluoroctové v methylenchloridu. Potom se provedou stupně (cj až (h) pracího cyklu objasněného výše.

Shora jmenované stupně se opakují s odpovídající chráněnou aminokyselinou, která se zvolí pro zbytek A, pokud C znamená aminokyselinu. Připravená peptidová pryskyřice chráněná tímto způsobem se třikrát promyje methylenchloridem a potom třikrát methanolem a potom se suší za sníženého tlaku. Produkt se získá prakticky v teoretickém výtěžku (96 % nebo více).

K výrobě peptidu obecného vzorce I, ve kterém C znamená NHR¹, nebo peptidu obecného vzorce I, kde C znamená nižší alkylamid aminokyseliny, se suspenduje chráněná peptidová pryskyřice za teploty 0 °C v odpovídajícím nižším alkylamínu a několik hodin se míchá. Přebytek alkylamínu se potom odpaří za teploty místnosti. Odštěpený peptid se vymyje dimethylformamidem z pryskyřice. Chráněný peptid se potom vysráží přídavkem ethylesteru kyseliny octové a poté odfiltruje. Získá se chráněný peptid, ve kterém C znamená skupinu NHR¹ nebo nižší alkylamid aminokyseliny.

K výrobě chráněných peptidů, ve kterých C znamená amid aminokyseliny nebo nižší alkylester aminokyseliny, se provádí výše objasněný postup za použití amoniaku nebo odpovídajícího alkoholu a triethylaminu místo nižšího alkylamínu.

Odstranění ochranné skupiny z peptidu vyrobeného uvedeným postupem se provádí patnácti- až šedesátiminutovým, s výhodou asi třicetiminutovým zpracováním materiálu s fluorovodíkem v amisolu za teploty 0 °C. Fluorovodík se odstraní za sníženého tlaku a anisol se vypere etherem. Pro výrobu peptidů obecného vzorce I, ve kterém C znamená volnou aminokyselinu, se odpovídající chráněný peptid vázaný na pryskyřici zpracuje způsobem popsaným výše s fluorovodíkem a anisolem. Přitom se současně odstraní ochranné skupiny a vazba na pryskyřičný nosič. Tak se získá požadovaný peptid obecného vzorce I, ve kterém C znamená volnou aminokyselinu.

K výrobě peptidů obecného vzorce I, ve kterém C znamená 2-aminOhydroxyethyl (Gly-ol), se na A-B-dipeptid vázaný na pryskyřici působí 2-aminoethanolem, čímž se přímo získá požadovaný peptid obecného vzorce I, ve kterém C znamená Gly-ol. Dinitrofenylové nebo tosylové ochranné skupiny, které jsou popřípadě přítomné na histidylovém zbytku, se současně odstraní.

Následující biologické pokusy jsou opět uvedeny na peptidech podle vynálezu.

Účinek peptidu obecného vzorce I na zmenšení chuti k jídlu a příjmu potravy, popřípadě účinek zvyšující nechutenství se stanoví pokusy s krmením na myších a krysách v podstatě podle postupů, které popsali Trygstád a spol. a Reichelt a spol. a které jsou zmíněné výše. V pravidelných intervalech se stanovuje denní příjem potravy s přesností na 0,1 g a tělesná hmotnost s přesností na 1 g. Jiné měřicí údaje, jako spotřeba kyslíku, tělesná teplota, hladina glukózy a/nebo inzulínu v plasmě a aminogram se vyšetřují k určitému časovému okamžiku.

Účinek peptidů obecného vzorce I na vylučování šťáv žaludkem a/nebo slinivkou břišní se stanovuje na krysách (nebo s výhodou na psech j, které mají fistuli hltanovou, žaludeční nebo slinivku břišní podle Babkina (viz výše uvedená publikace], Lieblinga a spol. (viz výše uvedená publikace] nebo Olbeho (viz výše uvedená publikace). Dojem krmení u psů vede k výraznému vzrůstu tvorby kyselosti, který činí 82 % maximální hodnoty tvorby kyselosti, která se dá dosáhnout podáním 320 ^g/kg/h histaminu (13,55 + 1,8 mekv./15 min). Současně se ukazuje významný vzestup sérové hladiny gastrinu ze základní hodnoty 32 + + 5 pg/ml na 73 + 10 pg/ml. Dojem krmení vede také k výraznému vzestupu vylučování proteinu slinivkou břišní, které činí 71 % z maximální hodnoty a které je dosažitelné podáním 0,5 jug/kg/h caeruleinu (650 + + 86 mg/15 min).

Peptidy obecného vzorce I snižují při intravenózní infúzi v dávce 25 až 50 ,ug/kg/h 30 minut před dojmem krmení a během něho maximální tvorbu kyselosti asi o 34 % bez významné změny sérové hladiny gastrinu a vylučování proteinu slinivkou břišní asi o 38 %.

U psů s žaludeční fistulí a Heidenhainovým vakem vede gastrické podání krmivá z játrového výtažku k výraznému vzrůstu tvorby kyselosti, který činí asi 90 % maximální hodnoty, která se dá dosáhnout podáním histaminu psům s žaludeční fistulí a asi 35 % maximální hodnoty u psů s Heidenhainovým vakem, zatímco sérová hladina gastrinu velmi významně vzroste na více než dvojnásobek základní hodnoty, a to z 29 + 5 pg/ml na 76 + 12 pg/ml.

Při podávání peptidů obecného vzorce I jednohodinovou intravenózni infúzní během podání potravy v dávce 50 jug/kg/h se sníží vylučování kyseliny indukované potravou s játrovým extraktem u psů s žaludeční fistulí o 35 o/_o a u psů s Heidenhainovým vakem o 41 %, aniž by došlo k významné změně sérové hladiny gastrinu. Peptidy obecného vzorce I zabraňují také vzrůstu hladiny inzulínu a gastrinu způsobenému potravou.

U psů s pankretickou fistulí stimuluje normální potrava pankreatickou tvorbu HCO3— na 80 % maximální hodnoty, která je dosažitelná podáním 3KU/kg/h sekretinu a vylučování proteinu na 92 % maximální hod2 3 6 G 6 2 .# noty, které lze dosáhnout podáním 0,5 ug na kilogram/h caeruleinu. Peptidy obecného ... vzorce I podávané výše uvedeným způsobem omezují během druhé hodiny po nakrmení tvorbu HCO^-3 o 35 % a tvorbu proteinu (enzymu] o 46 %, aniž by vyvolávaly zvracení nebo jiné vedlejší účinky.

Ze shora uvedených údajů je zřejmé, že peptidy obecného vzorce I zabraňují mozkové, žaludeční a střevní fázi vylučování šťáv žaludku a slinivky břišní bezpochyby potlačením neurohormonálních mechanismů, které jsou odpovědné za tuto sekreci. U mozkové fáze jde o neutrální, psychické nebo chuťové fáze sekrece žaludku, jejíž potlačení ukazuje na potlačení chuti k jídlu a anorexigenní účinek peptidů obecného vzorce I.

Příklady objasňují vynález.

Příklad 1

Způsob výroby D-pyroglutamyl-L-histidyl- (tosyl j -glycyl-O-CHz-pryskyřice [ D-H- (pyr o) -Glu-His (N^im-R³) -Gly-O-CHt-pryskyřice, R³ = Tos]

2,70 g (1,00 mmol glycinuj Boc-glycin-pryskyřice obecného vzorce

Boc—Gly—O—CHž-pryskyřice se vnese do reakční nádoby tvořící automatické zařízení k syntéze peptidů, které je naprogramováno na tento prací cyklus:

(a) methylenchlorid, (b) 33% kyselina trifluoroctové v methylenchloridu (2krát, 1 nebo 25 minut), (c) methylenchlorid, (d) éthanol, (e) chloroform, (f) 10% triethylamin v chloroformu (2krát vždy 2 minuty), (g) chloroform a (hj methylenchlorid.

Propraná pryskyřice se potom míchá s 3,0 mmol terc.butyloxykarbonyltosylhistidinu v methylenchloridu a přidají se 3,0 mmol diisopropylkarbodiimidu. Směs se míchá 1 hodinu za teploty místnosti. Peptid vázaný na pryskyřici se podrobí pracímu cyklu uvedenému výše na stupních (a) až (hj. Potom se stejným způsobem váží 3,0 mmol kyseliny D-pyroglutamové. Tím se získá titulní sloučenina.

Hotový tripeptid vázaný na pryskyřici se promyje třikrát methylenchloridem a potom třikrát methanolem. Po vysušení se dostane

2,89 g materiálu.

Glycin vázaný na pryskyřici z tohoto příkladu je vyroben z komerčně dostupné chlormethylované pryskyřice (1 % zesíťování j.

• 20

Příklad 2

Způsob výroby D-py,roglutamyl-L-histidylglycinu

2,89 g tripeptidu vázaného na pryskyřici, získaného podle příkladu 1, se suspenduje 45 minut za teploty 0 °C ve 40 ml fluorovodíku a 10 ml anisolu. Potom se fluorovodík odpaří pomocí proudu suchého dusíku.. Anisol se odstraní promytím etherem.

Surový peptid se čistí gelovou filtrací na koloně o rozměru 2,5 X 95 cm naplnění Sephadexem G 15 (jemný chemicky modifikovaný, zesíťovaný dextranj. Odpovídající frakce (320 až 340 ml) se lyofilizuje a získá se 320 mg D-H-(pyro)-Glu-His-Gly-OH ve formě bezbarvého vločkovitého prášku.

Produkt se chová jako homogenní při chromatografii na tenké vrstvě ve 4 rozdílných rozpouštědlech na silikagelových deskách. Přitom je vždy v 20 až 30 ug ve formě skvrn.

Vyvíjení se provádí plynným chlorem a potom postříkáním škrobovou reagencií. Dosáhnou se tyto hodnoty R_f -r- 1-butanol : : kyselina octová : voda (4:1:5, horní fáze) 0,08; ethylester kyseliny octové : pyridin : kyselina octová : voda (5:5:1:3) 0,28; 1-butanol : kyselina octová : voda : ethylester kyseliny octové (1:1:1:1) 0,18; 2-p,ropylalkohol : 1 m kyselina octová (2: : 1) 0,20.

Při analýze aminokyseliny se dosáhnou tyto hodnoty:

Glu 1,03, Gly 1,00, His 0,99.

Příklad 3 díly D-pyroglutamyl-L-histidyl-glycinu se rozpustí v 1 000 dílech destilované, pyrogenů prosté vody. K výrobě isotonického roztoku se přidá dostačující množství chloridu sodného. Směs se steriluje v autoklávu a plní do ampulí. Získá se infúzní roztok pro terapeutické účely.

Přikládá

Směs tvořená 12 díly D-pyroglutamyl-L-histidyl-glyeinu, 500 díly bílého uhličitanu hořečnatého a 20 díly hořečnaté soli kyseliny stearové se slisuje na hrubé kousky. Kousky se granulují, protlačí sítem o velikosti ok 2,38 mm (8 meshj a slisují. Tablet/ získané tímto způsobem se hodí k orálnímu podání.

Příklad 5

Směs tvořená 12 díly D-pyroglutamyl-L-histidyl-glycinu a 500 díly bílého uhličitanu hořečnatého se granuluje promísením s roztokem 2 dílů natriumdioktylsulfosukcinátu v dostatečném množství methanolu. Granu2 3.8 S 6 2 lát se protlačí sítem, s velikostí ok 1,68 mm (12 mesh] a suší za teploty až 55 °C. Potom se granulát ještě jednou protlačí sítem s velikostí ok 1,68 mm (12 meshj. Po přidání 8 dílů horečnaté soli kyseliny stearové se směs slisuje do tablet pro orální podání.

Příklad 6

Směs tvořená 24 díly D-pyroglutamyl-L-histidyl-glycinu, 475 díly laktózy, 94 díly kukuřičného škrobu a 3 díly horečnaté soli kyseliny stearové se slisuje na hrubé kousky. Kousky se rozmělní na granulát, který se protlačí sítem s velikostí ok 2,38 mm (8 meshj. Granule se potom potáhne dostatečným množstvím roztoku sestávajícího z 15 dílů šelaku a 3 dílů ricinového oleje v 800 dílech ethanolu. Poté se přidají 3 díly hořečnaté' soli kyseliny stearové. Granulát se slisuje do tablet pro orální podání.

P ř í k 1 a d 7 dílů D-pyroglutamyl-L-histidyl-glycinu se smíchá v kulovém mlýně s 576 díly laktózy. Směs se plní do želatinových kapslí. Získá se preparát pro orální podání.

Příklade

Způsob výroby L-pyroglutamyl-L-3‘-methylhistidyl-glycyl-O-CHz-pryskyřice

Stejným způsobem jako je popsán v příkladě 1 s tím rozdílem, že se použije 3,0 mmol terc.butyloxykarbonyl-3‘-methylhistidinu místo terc.butyloxykarbonyltosylhistidinu a dále se použijí 3,0 mmol kyseliny L-pyroglutamové místo kyseliny D-pyroglutamové. Získá se 2,90 g sloučeniny uvedené v nadpisu.

Příklad 9

Způsob výroby L-pyroglutamyl-L-3‘-methylhistidyl-glycinu

Stejným způsobem jako je popsán v příkladě 2, za použití 2,90 g produktu vyrobeného jak je popsáno v příkladě 8 a při zachycení frakcí eluovaných od 280 do, 320 ml se dostane 251 mg titulní sloučeniny, která se získá ve formě bezbarvého vločkovitého prášku.

Tento produkt je homogenní podle chromatografie na tenké vrstvě, když se použije navážky 20 až 30 ^g, ve 4 rozpouštědlových systémech na silikagelových deskách, stanoveno jako skvrny. Vyvíjení se provádí plynným chlorem a potom postřikem škrobovou reagencií.

Dosáhnou se tyto hodnoty R_£: 1-butanol : : kyselina octová : voda (4:1:5, horní fáze] 0,04, ethylester kyseliny octové : pyridin : kyselina octová : voda (5 : 5 : 1 : 3) 0,15, 1-butanol : kyselina octová : voda : ethylester kyseliny octové (1:1:1:1] 0,10, 2-butanol : 1 M kyselina octová (2:1) 0,04.

Při analýze aminokyseliny se dosáhnou tyto hodnoty: Glu 1,05, Gly 1,00, 3-MeHis, 0,96.

Přikladlo

Způsob výroby L-pyroglutamyl-L-histidyl(tosyl) -D-alanyl-O-CH2-pryskyřice

Stejným způsobem jako je popsán v příkladě 1 s tím rozdílem, že se použije 2,78 g Boc-D-Ala-O-CHž-pryskyřice (1 . mmol D-alaninu) vyrobené z komerčně dostupné chlormethylované pryskyřice (1% zesíťováníj místo Boc-Gly-O-CH2-pryskyřice, 3 mmol terc.butyloxykarbonyltosylhistidinu a 3,0 mmol kyseliny L-pyraglutamové místo kyseliny D-pyroglutamové, získá se 3,37 g sloučeniny uvedené v nadpisu.

Přikladli

Způsob výroby L-pyroglutamyl-L-histidyl-D-alaninu

Stejným způsobem jako je popsán v příkladě 2 s tím rozdílem, že sé použije 3,37 g produktu získaného jak je popsáno v příkladě 10 a zachytí frakce eluované od 260 do 320 ml, získá se L-H-(pyro)Glu-L-His-D-Ala-OH, který se dále čistí chromatograficky na sloupci silikagelu (1,5 X 145 cm], při vyvíjení směsí 1-butanolu, kyseliny octové, vody a ethylesteru kyseliny octové v poměru 1:1:1:1. Jímají se frakce eluované od 380 do 560 ml, které se lyofilizují. Získá se 390 ml titulní sloučeniny ve formě bezbarvého prášku.

Tento produkt je homogenní podle chromatografie na tenké vrstvě, když se použije navážky 20 až 30 ,ug, ve 4 rozpouštědlových systémech na silikagelových deskách, stanoveno jako skvrny. Vyvíjení se provádí plynným chlorem a potom postřikem škrobovou reagencií. Dosáhnou se tyto hodnoty R_f: 1-butanol : kyselina octová : voda (4:1: : 5, horní fáze) 0,10, ethylester kyseliny octové : pyridin : kyselina octová : voda (5:5:1:3) 0,30, 1-butanol : kyselina octová : voda : ethylester kyseliny octové (1:1: : 1:1) 0,21, 2-butanol : 1 M kyselina octová (2 :1) 0,25.

Při analýze aminokyseliny se dosáhnou tyto hodnoty: Glu 1,04, Ala 1,00, His 0,95.

Příklad 12

Způsob výroby D-pyroglutainyl-L-3‘-methylhistidyl-D-alanyl-O-CH2-pryskyřice

Stejným způsobem jako je popsán v příkladě 1 s tím rozdílem, že se použije 1,39 g

Boc-D-Ala-O-CH2-pryskyřice (0,5 mmol D-alaninu) vyrobené jako je popsáno v pří236862 „ kládě 10 a za použití 1,5 mmol terc.butyloxykarbonyl-3‘-methylhistidinu a potom 1,5 mmol kyseliny D-pyroglutanové, získá se 1,64 g produktu· uvedeného v nadpise.

Příklad 13

Způsob výroby D-pyroglutamyl-L-3‘-methylhistidyl-D-alaninu “'••τί-’-ΜΒ!·:

Stejným způsobem jako je popsán v příkladě 2 s tím rozdílem, že se použije 1,64 g produktu vyrobeného jak je popsáno v příkladě 12, s 20 ml fluorovodíku a 5 ml anizolu, získá se 300 mg sloučeniny uvedené v nadpise, ve formě bezbarvého vločkovitého prášku.

Tento produkt je homogenní podle chromatografie na tenké vrstvě prováděné stejným postupem jako je popsán v příkladě 2. Dosáhnou se tyto hodnoty R_f: 1-butanol :

: kyselina octová : voda (4:1:5, horní fáze) 0,05, ethylester kyseliny octové : pyridin : kyselina octová : voda (5:5:1:3) 0,15, 1-butanol : kyselina octová : voda : ethylester kyseliny octové (1:1:1:1) 0,10, 2-butanol : 1M kyselina octová (2:1) 0,05.

Při analýze aminokyseliny se dosáhnou tyto hodnoty: Glu 1,07, Ala 1,00, 3-MeHis 1,01.

Příklad 14

Způsob výroby L-pyroglutamyl-L-histldyl(tosyl) -O-CHz-pryskyřice

Stejným způsobem jako je popsán v příkladě 1 s tím rozdílem, že se zpracování podrobí 3,00 g Boc-His(N^im-Tos)-O-CH2-pryskyřice (1,00 mmol histidlnu) vyrobené z komerčně dostupné chlormethylované pryskyřice (1% zesítování) místo Boc-Gly-O-CHz-pryskyřice, při použití pracího cyklu ze stupňů (a) až (h) a při další reakci pr omytého produktu se 3,0 mmol kyseliny L-pyroglutamové v přítomnosti 3,0 mmol diisopropylkarbodlimidu, s následujícím trojnásobným promytím dipeptidové pryskyřice methylenchloridem a trojnásobným promytím methanolem a sušením, získá se 3,10 g produktu uvedeného v nadpise.

Příklad 15

Způsob výroby L-pyroglutamyl-L-histidylethylamidu

3,10 g produktu získaného jak je popsáno v příkladě 14 se suspenduje ve 20 ml dimethylformamidu za teploty 0 °C, přidají se 3 ml ethylaminu a směs se za teploty 0 °C míchá 18 hodin. Rozpouštědlo a přebytek ethylaminu se odpaří za sníženého tlaku a odparek se extrahuje 2 M kyselinou octovou a filtruje, aby se odstranila pryskyřice. Filtrát obsahující peptid se čistí geloivou filtrací na sloupci (2,5 X 95 cm) jemného, che24 micky modifikovaného zesíťovaného dextranu (Sephadexu G 15) a příslušné frakce se lyofilizují k získání 100 mg titulní sloučeniny ve formě bezbarvého vločkovitého prášku.

Tento produkt je homogenní podle chromatografie na tenké vrstvě, stanoveno stejným postupem, jako je popsán v příkladě 2, za použití systému čtyř rozpouštědel. Dosáhnou se tyto hodnoty R_f: 1-butanol : kyselina octová : voda (4:1:5, horní fáze) 0,18, ethylester kyseliny octové : pyridin :

: kyselina octová : voda (5:5:1:3) 0,56, 1-butanol : kyselina octová : voda : ethylester kyseliny octové (1:1:1:1) 0,55, 2-butanol : 1M kyselina octová (2:1) 0,29.

Při analýze aminokyseliny se dosáhnou tyto hodnoty: Glu 1,05, His 1,00, EtNHz 1,03. Příklad 16

Způsob výroby L-pyroglutamyl-L-histidyl(tosyl) -glycyl-O-CHz-pryskyřice

Stejným způsobem jako je popsán v příkladě 1 s tím .rozdílem, že se kyselina D-pyroglutamová nahradí 3,0 mmol kyseliny L-pyroglutamové se získá 2,90 g produktu uvedeného v nadpise.

Příklad 17

Způsob výroby L-pyroglutamyl-D-histidyl(tosyl) -glycyl-O-CHz-pryskyřice

Stejným způsobem jako je popsán v příkladě 1 s tím rozdílem, že se nahradí terc.butyloxykarbonyltosylhistidin 3,0 mmol terc.butyloxykarbonyltosyl-D-histldinu a kyselina D-pyroglutamová 3,0 mmol kyseliny L-pyroglutamové se získá 2,91 g produktu uvedeného v nadpise.

Příklad 18

Způsob výroby L-pyroglutamyl-D-histidyl-glycinu

Stejným způsobem jako je popsán v příkladě 2 s tím rozdílem, že se použije 2,91 g produktu získaného jak je popsáno v příkladě 17, s 20 ml fluorovodíku a 5 ml anizolu, získá se 125 mg titulní sloučeniny ve formě bezbarvého vločkovitého prášku.

Tento produkt je homogenní podle chromatografie na tenké vrstvě, stanoveno stejným postupem, jako je popsán v příkladě 2. Dosáhnou se tyto hodnoty R_f: 1-butanol : kyselina octová : voda (4:1:5, horní fáze) 0,14, ethylester kyseliny octové : pyridin : : kyselina octová : voda (5:5:1:3) 0,56, 1-butanol : kyselina octová : voda : ethylester kyseliny octové (1:1:1:1) 0,51, 2-butanol : 1M kyselina octová (2:1) 0,25.

Při analýze aminokyseliny se dosáhnou tyto hodnoty: Glu 1,01, Gly 1,00, His 0,97.

23G5S2

Příklad 19

Způsob výroby L-pyrogrutamyl-L-histidyl-glycinethylamidu

2,90 g produktu získaného jak je popsáno v příkladě 18 se suspenduje ve 20 ml dimethylformamidu za teploty 0 °C, přidají se 3 ml ethylaminu a směs se míchá při 0 °C po dobu 18 hodin. Rozpouštědlo a přebytek ethylaminu se odpaří za sníženého tlaku a odparek se extrahuje 2 M kyselinou octovou a filtruje, aby se odstranila pryskyřice. Filtrát obsahující peptid se čistí jak je popsáno v příkladě 2. Získá se 138 mg titulní sloučeniny ve formě bezbarvého vločkovitého prášku.

Tento produkt je homogenní podle chromatografie na tenké vrstvě, stanoveno stejným postupem, jako je popsán v příkladě 2, za použití systému čtyř rozpouštědel. Dosáhnou se tyto hodnoty R_f: 1-butanol : kyselina octová : voda (4:1:5, horní fáze] 0,15, ethylester kyseliny octové : pyridin : : kyselina octová : voda (5:5:1:3) 0,54, 1-butanol : kyselina octová : voda : ethylester kyseliny octové (1:1:1:1] 0,53, 2-butanol : 1M kyselina octová (2:1) 0,26.

Při analýze aminokyseliny se dosáhnou tyto hodnoty: Glu 1,02, Gly 1,00, His 0,97, EtNHz 0,98.

Claims (6)

1. Způsob výroby peptidů obecného vzorce I,

A—B—C (I), kde

A znamená zbytek ze skupiny L-pyroglutamylu, D-pyroglutamylu a L-homopyroglutamylu,

B znamená zbytek ze skupiny L-histidylu, D-histidylu a L-3‘-methylhistidylu, a

C znamená zbytek ze skupiny glycinu, glycinamidu a jeho alkylamidů s 1 až 6 atomy uhlíku a D-alaninu, s podmínkou, že

C má jiný význam než glycin nebo glycinamid, pokud

A znamená L-pyroglutamyl a

B znamená L-histidyl, jakož i jejich farmaceuticky přijatelných solí, vyznačující se tím, že se váže chráněná aminokyselina na bázi zbytků s významy u•vedeným pro C, chráněná na «-aminoskupině, v přítomnosti katalyzátoru na pryskyřičný nosič ze skupiny hydroxyethylovaných a chlormethylovaných pryskyřic, za vzniku odpovídající sloučeniny obecného vzorce (chráněný zbytek C)—O—CH2—(pryskyřičný nosič], z této sloučeniny se odstraní skupina chránící «-aminoskupinu a výsledná sloučenina se váže za obráněnou aminokyselinu na bázi zbytků s významy uvedenými pro B, chráněnou na α-aminoskupině, v přítomnosti dialkylkarbodiimidu se 2 až 10 atomy uhlíku v alkylových skupinách nebo dicykloalkylkarbodiimidu se 6 až 10 atomy uhlíku v cykloalkylových skupinách, za vzniku odpovídajícího chráněného peptidů připojeného k pryskyřičnému nosiči zakotvenou skupinou —O—CHz—, z této sloučeniny se odstraní skupina Chrániči «-aminoskupinu a vzniklá sloučenina se váže s chráněnou «-aminokyselinou na bázi zbytků s významy uvedenými pro A, chráněnou na «-aminoskupině, v přítomnosti dialkylkarbodiimidu se 2 až 10 atomy uhlíku v alkylových skupinách nebo dicykloalkylkarbodiimidu se 6 až 10 atomy uhlíku v cykloalkylových skupinách za vzniku odpovídajícího chráněného peptidů připojeného k pryskyřičnému nosiči zakotvenou skupinou —O—CH2—, z této sloučeniny se odstraní ochranné skupiny, výsledný peptid uvedeného obecného vzorce I se odštěpí od pryskyřičného nosiče a izoluje odpovídající peptid, který se popřípadě zpracuje s farmaceuticky přijatelnou kyselinou a vzniklá odpovídající farmaceuticky přijatelná sůl peptidů se izoluje.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako katalyzátoru použije hydrogenuhličitanu česného a triethylaminu.

3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se peptid odštěpí od pryskyřičného nosiče působením fluorovodíku v anisolu a peptid se izoluje ve formě volné karboxylové kyseliny.

4. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se peptid odštěpuje od pryskyřičného nosiče působením amoniaku a peptid se izoluje ve formě amidu kyseliny.

5. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se peptid odštěpuje od pryskyřičného nosiče působením alkylaminu s 1 až 6 atomy uhlíku a peptid se izoluje ve formě C-terminálního alkylamidů s 1 až 6 atomy uhlíku.

6. Způsob podle bodu 1 pro výrobu D-pyroglutamyl-L-histidyl-glycinu, vyznačující se tím, že se sloučenina obecného vzorce

2 3 S 8 8 2

Boc—Gly—O—CH2— (pryskyřičný nosič) zpracuje s kyselinou fluorovodíkovou a potom s triethylaminem, výsledná sloučenina se váže s terc.butyloxykarbonyltosylhistidinem v přítomnosti diisopropylikarhodiimidu a vzniklá sloučenina se zpracuje s kyseli28 nou fluorovodíkovou a potom s triethylami nem, získaná sloučenina se váže s kyselí nou D-pyroglutamoivou v přítomnosti diiso propylkarbodiimidu, a izoluje se D-pyroglu tamyl-L-histidyl (tosyl) -glycyl-O-CH2-( pryskyřičný nosič), který se zpracuje s fluoro vodíkem v anisolu a izoluje.