NO813460L - Fremgangsmaate for fremstilling av nye peptider. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår'en fremgangsmåte for fremstilling av peptider med den generelle' formel A-B-C, hvor A er valgt fra gruppen bestående av L-pyroglutamyl, D-pyroglutamyl og L-homo-pyroglutamyl, B er valgt fra gruppen bestående av L-histidyl, D-his.tidyl, L-3 1-metylhistidyl, L-fenylalanyl,

L-p_-aminof enylalanyl, og L- p- (pyrazolyl-1) alanyl; og C er

valgt fra gruppen bestående av glycin og dets lavere alkylestere, glycinamid og lavere alkylamider herav, D-alanin og'L-3-(2-tienyl)alanin, med det forbehold at C.ikke kan være glycin eller glycinamid når A er L-pyroglutamyl'og B er L-histidyl.

Peptider av denne type oppnås i henhold.til foreliggende oppfinnelse ved kobling av en hensiktsmessig beskyttet a-amino-beskyttet aminosyre med formel C, i nærvær av en katalysator,

til en resinbærer valgt fra 'hydroksyetyl og klormetylerte resiner, slik at den korresponderende forbindelse med formel

(beskyttet C)-O-Cr^-(resinbærer) oppnås, fjerning av den a-amino-beskyttede gruppe fra sistnevnte forbindelse og kobling av den resulterende forbindelse med en hensiktsmessig beskyttet a-amino-beskyttét aminosyre med formel B i nærvær av et passende dialkyl- eller dicykloalkyl-karbodiimid for å oppnå det korresponderende beskyttede peptid knyttet til resinbæreren gjennom forankringsgruppen -O-CI-^-, fjerning av a-amino-beskyttelsesgruppen fra sistnevnte forbindelse og kobling av den resulterende forbindelse med. en hensiktsmessig beskyttet

a-amino-beskyttet aminosyre med formel A i nærvær av e-t egnet dialkyl- eller dicykloalkyl-karbodiimid, for å oppnå det korresponderende beskyttede peptid knyttet til resinbæreren gjennom forankringsgruppen - O- CH^-, fjerning av de beskyttende grupper fra sistnevnte forbindelse, spalting av det resulterende peptid fra resinbæreren og isolering av det korresponderende peptid hvor A, B og C er som angitt ovenfor.

Oppfinnelsen omfatter dessuten fremgangsmåtens benyttede mellomprodukter og anvendelsen av forbindelsene A-B-C som anoreksika, for behandling av fettsyke og andre patologiske tilstander hvor nedsatt nærings- eller for-opptak hos pattedyr er på sin plass, samt anvendelsen av disse forbindelser til behandling av patologiske tilstander som opptrer i forbindelse

. med overproduksjon av mavesyre og pankreasvæske ved mave- og

tolvfingertarms-sår eller akutt pankreatitt og ved behandling av bestemte kritiske tilstander i det sentrale nervesystem som bevissthetsforstyrrelser eller koma på grunn, av hjerneskader.

De forkortelser for aminosyrene og deres rester og beskytt.elsesgrupper som'benyttes her, ér basert på anbefalinger fra IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclature (vgl.Bio-chemistry, Bd. 11 (1972), s. 1726. Eksempler på slike er: (Pyro)-Glu = 5-oksoprolin eller pyroglutaminsyre; homo-(pyro)-Glu = homopyroglutaminsyre; His = histidin; Nim-3-His 3'-metylhistidin;'Phe = fenylalanin; p-NH2Phe = p-aminofenylalanin, (3-(pyrazolyl-1 ) Ala - 3-(pyrazol-1-yl)-alanin ; Gly = glycin;

Gly-ol .= 2-aminoetanol; og Thi =3-(2-tienyl)-alanin.

Samtlige aminosyrer har den naturlige L-konfigurasjon om intet annet er angitt. D-His angir D-histidin-resten, D-(pyro)-Glu er D-pyroglutamihsyre-resten og D-Ala er D-alanin-resten. Forkortelsene Me og Et benyttes for henholdsvis metyl og etyl.

For beskytt.elsesgrupper anvendes for eksempel følgende forkortelser: Boe = tert.-butyloksykarbonyl; Z = benzyloksykarbonyl; Tos = tosyl;'Dnp = dinitrof enyl; Nlm = imidazolnitrogen i histidin; og Y = en egnet' forankrende gruppe bundet til en fast resinbærer som benyttes ved fast-fase-syntese, fortrinnsvis Den humorale appetittkontroll, spesielt via hypothalamus, har vært diskutert i mange år, konf. f.eks. oversikts-artikkelen av Schally et al., Am. J.'Med. Sei., Bd. 248 (1964), s. 79 og de der siterte litteratursteder. Siden den gang har det vært kjent at hypothalamus er delaktig i regulering av næringsopptaket. En elektrisk stimulering av det laterale hypothalamusområdet, fører•til'hyperfagi, og ødeleggelse av området, til afagi. I motsetning til dette, bevirker en stimulering av den ventromediale kjerne til reduksjon av næringsopptaket, og ødeleggelse, til hyperfagi og fettsyke. Fettsyke-syndromet som frembringes gjennom administrering .av gull-tioglukose, er delvis en følge av en hyperfagi knyttet til. hypothalamuslesjoner forårsaket av dette middel.. Teorier omkring den nevrale kontroll av sult, appetitt og metthets-følelse har vært diskutert av forskjellige forfattere. Forskjellige mekanismer er foreslått:

1) Den termostatiske teori

• Etter denne teori reguleres appetitten av en spesiell dynamisk virkning av næringen og innflytelsen av denne på kropps-temperaturen. 2) Kjemostatiske teorier.

Disse teoriene postulerer at appetitten reguleres gjennom, intracellulære eller ekstracellulære konsentrasjoner av glukose (glukostatisk teori), lipider (lipostatisk teori) og forskjellige

metabolitter, som serum-aminosyrer.

3) . En annen teori-gruppe antar at fornemmelser som opptrer i

fordøyelsestrakten under spising og i nærvær av næring i mave og tarm, regulerer appetitten. Til de-faktorer som medvirker

til at metthetsfølelsen oppstår, eller bevirker at næringsopptaket nedsettes, hører mavesckkens utvidelse på grunn av næring eller ikke-nærende substanser. Mavekontraksjoner kan settes i forbindelse med sultforholdet, men disse kontraksjonene

er imidlertid de samme hos dyr, som er hensatt i en hyperfagisk tilstand gjennom kunstige hypothalamuslesjoner, som hos dyr, som hindres i tilgang på for og vann. Disse teorier kan ikke forklare samtlige eksperimentelle funn. For eksempel, forklarer de ikke hvorfor diabetiske dyr kan føle sult. Schally et el., nevnt ovenfor, antar at den fettsyke som opptrer hos. dyr med hypothalamuslesjoner, snarere overføres gjennom en humoral enn en nevrogen mekanisme og at hypothalamus muligens utvikler en substans som deltar i den sentrale appetittkontro.il. Det opp-lyses om foreløpige funn som peker i retning av at det i det nevrohypofysiale ekstrakt finnes en substans, som påvirker den dynamiske fase ved vektøkning hos mus som er behandlet med gull-tioglukose.

En ny kort oversiktsartikkel av Schally et al., angående forskningens status med hensyn til hypothalamuskontrollen av foropptak og fettsyke er også kommet ut, konf. Resent Progress in Hormone Research, Proceedings of the 1967 Laurentian Hormone Conference, Bd.24 (1968), s. 497, spesielt s. 570 til 571 og

de der nevnte referanser. Til disse referanser hører også

arbeidet av Schally et al.,Science, Bd. 157 (1967), s. 210,

hvor det vises at administrering av renset entrogastron fra' hunde-duodenum nedsetter næringsopptaket hos mus som har fastet i 17 timer. Denne virkning er størst i løpet av de første 30 minutter, men den kumulative nedsettelse varer imidlertid i minst ytterligere 4 timer. Andre -peptider samt glukagon, sekretin, glukose- og storfeserum-albumin, isolert fra hunde-duodenum'

eller -colon, har vist seg uvirksomme. Disse forfattere antar at virkningen kan føres tilbake til en direkte opphevelse av sult-mavekontraksjoner eller at den er forårsaket av sentralnervesystemet ved frigjøring av hypothalamus-substanser, selv om et positivt bevis for at hypothalamus-nevrovæsker er.an-svarlige for en indirekte eller direkte kontroll av appetitten,

. dengang ikke kunne fremlegges.

Det ser ut til at dette ■ positive bevis nå er fremlagt av Trygstad et al., Acta Endocrinologica, Bd. 89 (1978), s. 196. Disse forfattere isolerte en rekke peptider fra urin hos pasienter som 'led av kongenital, generell lipodystrofi (hypothalamus-syndrom). Disse peptider fremkalte tilsvarende stoffveksel-virkninger. Nervøs anoreksi er forbundet med hypothalamus-forstyrrelser. Ved primær, nervøs hypothalamus-anoreksi, er hypothalamus-hypofyse-aksen ødelagt, noe som fører til en lav grad av gonadotropin-frigjøring, amenorrhoe,

tap av den^ daglige ACTH-sekresjonsrytme, nedsatt tyrotropin-sekresjon og en først tiltagende og senere avtagende somato-tropin-sekresjon.

Bunnfall "fra urinprøver av 25 pasienter med en nervøs anoreksi, ble kromatografert på Sephadex G-25-gel pakkede søyler. Dette resulterte i en inndeling i 4 forskjellige kromatografiske mønstre: Ett lignet mønsteret av normale kon-trollpersoner, ett viste likhet med det fra schizofreni-pasienter.Hos 5 pasienter med en hysteriform nevrose oppsto et tredje mønster, og i 10 piker med en- primær "hypothalamus"-

type av nervøs anoreksi vistes likeledes typiske kromato-grammer. Fraksjoner med innflytelse på appetitten'hos mus ble bare funnet i den-siste gruppe: Gjennom flere kromatografiske trinn, ble 2 appetittpåvirkende peptider isolert. Når disse peptider ble injisert i mus, forårsaket det ene øket appetitt, mens det andre bevirket appeti.ttsenkning. Peptidene er inn- .hyllet i peptid-bærerproteiner og dermed beskyttet mot en enzymatisk nedbrytning, hvilket gjør isolering fra urin mulig..

Strukturen av det anoreksigene peptid ble oppklart av Reichelt et al.,Neuroscience, Bd. 3 (1978) s. 1207 i nært samarbeide med Trygstad. Det dreier seg om tripeptidet H-(pyro)-Glu-His-Gly-OH,.som ble bekreftet ved syntese.

Ved en daglig injeksjon av 12 nMol av det appetittdempende peptid i mus over 20 dager,'avtok foropptaket i løpet av ca. 6 måneder fra 5,7 til 3,0 g pr. dag. Kroppsvekten falt fra gjennomsnittlig 35 g til et minimum på 24 g.

Tripeptidet har ingen akutt virkning på glukosespeilet

.i blodet eller på insulinspeilet i serum. Det virker åpen-

bart på reseptorer i appetittkontrollerende hypothalamus-sentra.

Det appetittstimulerende peptid,øket det daglige for-opptak med over 10 g, hvorved kroppsvekten i gjennomsnitt steg til 57 g. Strukturen av det appetittstimulerende peptid, er hittil ikke fastlagt.

To lignende faktorer som viser etøket og et nedsatt for-opptaksforhold, ble også isolert fra pasienter med genetisk'betinget.metabolsk fettsyke.

I henhold til oppfinnelsen er det nå fastslått at peptider med den generelle formel I

A-B-C

hvor A, B og C har den ovenfor angitte betydning, er mer aktive og har lenger virkningstid med hensyn til nedsettelse av appetitten og senkning av.næringsopptaket, enn hva som er tilfelle for tripeptidet pyroglutamyl-histidyl-glycin (H-(pyro)-Glu-His-Gly-OH) som ble isolert av Trygstad et al. og Reichelt et al.Peptider med den generelle formel.I og deres farmakologisk akseptable salter, som biologisk er ekvivalente med de nevnte peptider, er derfor verdifulle appetittdempende forbindelser

for behandling av fettsyke og tilhørende patologiske tilstander hvor en senkning av næringsopptaket er nødvendig. Disse stoffer nedsetter også mave- og pankreas-sekresjonen. De egner seg derfor også til behandling av patologiske tilstander hvor det foreligger overproduksjon av mavesyre og/eller pankreasvæske. Dessuten, har de bestemte'virkninger på sentralnervesystemet

slik at de også egner seg for akutt behandling av bevissthets-

forstyrrelser.

Forbindelsene i henhold til oppfinnelsen har den fordel fremfor det naturlige tripeptid at det er mer aktivt og har

mer langvarig virkning. Disse fordeler er av spesiell praktisk betydning: På grunn av den lavere virksomme minimaldose, oppnås en nedsettelse av bivirkningene samt av omkostningene for fremstilling av forbindelsene. På grunn av den lengre virkningstid, er mindre hyppig dosering nødvendig.

Som følge av den kjensgjerning at peptidene med den generelle formel I og deres farmakologisk.akseptable salter er biologisk ekvivalente, er alle henvisninger hittil, og i det følgende, til peptider med den generelle formel I å forstå

som omfattende både peptidet selv .og dets salter.

Oppfinnelsen omfatter også beskyttede mellomprodukter

som er bundet til en fast resinbærer og som benyttes til fremstilling av forbindelser med den generelle formel I.

Som beskyttelsesgrupper ved den trinnvise fastfase-syntesen av mellomproduktene, kan det benyttes slike grupper som kan fjernes ved en eller fler.e k.jemiske behandlinger uten at dette har innvirkning på det ønskede sluttprodukt med formel I.Beskyttelsesgruppene velges fortrinnsvis slik at de kan fjernes i et enkelt trinn sammen med,andre beskyttelsesgrupper, for eksempel samtidig med den ovenfor definerte forankringsgruppe Y.En spesielt egnet beskyttelsesgruppe R 2for den trinnvise fastfase-syntese av de nevnte mellomprodukter, er,tert.-butyloksykarbony1 (Boe) .

Foretrukne beskyttelsesgrupper R 3til beskyttelse av imidazolnitrogenet i histidin, er tosyl (Tos) eller dinitro-

4

fenyl (Dnp). En egnet beskyttelsesgruppe R til beskyttelse av fenylaminogrupper i p-aminofenylalanin er benzyloksy-karbonylgruppen (Z). En egnet forankringsgruppe til forbindelse med resinbæreren er den ovenfor definerte gruppe Y,

for eksempel -^0-CH2. De nevnte beskyttelsesgrupper er stabile overfor reagensene og under reaksjonsbetingelsene som benyttes til fjerning av beskyttelsesgruppen på den terminale ami.no-gruppe og ved de etterfølgende koblingsreaksjoner.

Uttrykket "lavere-alkyl" betyr rettkjedede eller for-grenede alkylrester med ett til tre karbonatomer.

Peptidene med den generelle formel I fremstilles ved trinnvis fastfase-syntese ved å begynne med den terminale karboksylgruppe. Fremgangsmåten kan kort. sammenfattes på følgende måte: En bestemt, aminosyre, valgt som C, eventuelt som B, når C betyr NHR med R = lavere alkyl, med en egnet

■beskyttelsesgruppe på a-aminogruppen og. eventuelt med andre beskyttelsesgrupper, som er sammenkoblet med den ovenfor definerte gruppe Y med resinbæreren, underkastes en behandling for å fjerne beskyttelsesgruppen på a-aminogruppen og koble den med den spesielle aminosyren, som er valgt'for B eller, f or A, nar C har betydningen N.HR i, idet et egnet dialkyl- eller dicykloalkyl-karbodiimid velges som koblingsmiddel. Den nevnte fremgangsmåte blir gjentatt inntil det ønskede antall aminosyrer er forbundet med hverandre. Deretter fjernes beskyttelsesgruppen på den terminale aminogruppe så-vel som eventuelle andre beskyttelsesgrupper og forankringsgruppen Y. Etter fjerning av løsningsmidlet, oppnås det ønskede rå peptid. Råproduktet blir renset kromatografisk, for eksempel ved gel-filtrering, hvorved detønskede peptid oppnås i ren tilstand.

Utgangsmaterialene for fremstilling av peptidene, er enten vanlige handelsprodukter eller lar seg lett fremstille etter kjente metoder. Samtlige aminosyrer som benyttes i syntesen, er kommersielt tilgjengelige med unntak av homo-(pyro)-glutaminsyre .som kan.fremstilles etter Greenstein og Winitz i "Chemistry of the Amino Acids", J. Wiley, New York, 1961, s. 2407 til 2462, og 3-(2-tienyl)-alanin som kan fremstilles etter den nevnte referanse side 2707.

Egnede faste resinbærere er klormetylerte og hydroksy-metylerte resiner, hvorav de førstnevnte foretrekkes. Angående, fremstilling av hydroksymetyl-resiner henvises til

M. Bodansky og J. T. Sheehan, Chem. Ind., London, Bd.. 38

(1966), s. 1597. Et klormetylert resin leveres av Bio Rad Laboratories, Richmond, California. Ved bruk av det klormetylerte resin, dannes en ester-forankringsgruppe med den a-aminobeskyttede aminosyre. C (eller B, når C har den oven for angitte NHR 1 betydning), som eventuelt har ytterligere beskyttelsesgrupper.

En. hensiktsmessig fremgangsmåte for omdanning av. det sammen-koblede, beskyttede peptid til C-terminal-(lavere-alkyl)-amid, består i avspalting av det beskyttede peptid fra resinet ved behandling med et lavere-alkylamin, sml. D. H. Coy et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 57 (1974), s. 335, hvorved det tilsvarende beskyttede peptid-(lavere-alkyl)-amid oppnås. Beskyttelsesgruppene fjernes deretter ved.behandling med natrium og flytende ammoniakk eller, fortrinnsvis, ved spalting, med hydrogenk.lorid, hvorved det tilsvarende peptid i henhold til oppfinnelsen oppnås. En annen fremgangsmåte består i å foreta spaltingen ved omestring med en lavere alkohol., fortrinnsvis metanol eller etanol, i nærvær av trietylamin, idet man da oppnår den tilsvarende ester. Esteren kan deretter omdannes til det tilsvarende (lavere-alkyl)-amid. Deretter kan beskyttelsesgruppene .fjernes etter den ovenfor beskrevne metode. Ønskes den fri karbonsyre, foretas spaltingen fortrinnsvis med hydrogenfluorid i anisol. Ønskes syreamidet, foretas spaltingen med ammoniakk. I denne forbindelse henvises til J. M. Stewart og J. D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis",.W. H. Freeman&Co., San Francisco, 1969,

s. 4 0-4 9. •

Etter en teknikk i henhold til oppfinnelsen, kobles

glycin med • beskyttet a-aminogruppe , fortrinnsvis tert.-butyl-oksykarbonylglycin, med et klormetylert resin ved hjelp av en katalysator, fortrinnsvis cesiumhydrogenkarbonat eller trietylamin. Etter koblingen til resinbæreren, fjernes a-amino-beskyttelsesgruppen, for eksempel med trifluoreddiksyre i metylenklorid, trifluoreddiksyre alene eller hydrogenklorid i dioksan. Beskyttelsesgruppen fjernes ved temperaturer fra ca.

0° til romtemperatur. Også andre standard-spaltingsreagenser og -betingelser for fjerning av spesielle a-aminobeskyttelses-grupper kan benyttes, sml. E. Schroder og K.. Lubke, "The Peptides", Bd. T, Academic Press, New York, 19.65, s. 72 til 75.

Etter fjerning av a-aminobeskyttelsesgruppen, blir de øvrige aminosyrer med beskyttede a-aminogrupper tilkoblet trinnvis i den ønskede rekkefølge under dannelse av det ønskede peptid. De beskyttede aminosyrene tilsettes i- 3 gangers overskudd til fast-fase reaktoren. Koblingsreaksjonen utføres i metylenklorid eller i blandinger av dimetylformamid og metylenklorid.

Dersom koblingen forløper ufullstendig, gjentas koblings-trinnet før fjerning av a-aminobeskyttelsen og før tilkobling av den neste aminosyre. Korrekt forløp av koblingsreaksjonen i de enkelte syntesetrinn kontrolleres ved hjelp av ninhydrin-reaksjonen etter E. Kaiser et al., Analyt. Biochem., Bd. 34 (1 970) , s. 595.

Etter syntetisering av den ønskede aminosyresekvens fjernes det beskyttede peptid fra resinbæreren ved behandling med et (lavere-alkyl)-amin under dannelse av det beskyttede peptid-(lavere-alkyl)-amid. Ved bruk av dinitrofenyl eller tosyl som beskyttelsesgruppe for histidylresten, fjernes også disse beskyttelsesgrupper under behandlingen med det (lavere-alkyl )-aminet. Peptidet kan også skilles fra resinet ved omestring med en lavere alkanol, fortrinnsvis metanol•eller etanol, i nærvær av trietylamin, hvorpå den oppnådde ester renses kromatografisk på kiselgel. Den oppnådde fraksjon kan-underkastes behandling med et .(lavere-alkyl)-amin for å om-danne .den lavere-alkylester, fortrinnsvis metyl- eller etyl-esteren, til' karboksy1-terminal-(lavere-alkyl)-amidet. Man må være oppmerksom på at eventuelle dinitrofenyl- eller tosyl-•grupper på histidylresten også spaltes av. De resterende beskyttelsesgrupper for sidekjedene. i det beskyttede a.lkyl-amid fraspaltes deretter etter den ovenfor beskrevne metode, for eksempel ved behandling med natrium i flytende ammoniakk

.eller med hydrogenfluorid. Avspaltingen av det ønskede peptid fra resinbæreren kan også foretas med ammoniakk under dannelse

av det tilsvarende amid eller med hydrogenfluorid og anisol under dannelse av den tilsvarende frie syre. Peptider med den generelle formel I, hvor C betyr 2-aminohydroksyety! (Gly-ol), oppnås ved spalting av et A- B - dipeptid-resin med 2-aminoetanol. Ved denne fremgangsmåte spaltes også eventuelle dinitrofenyl- eller tosyl-grupper på histidylresten fra.

Som allerede nevnt, kan peptidene med den generelle formel I også oppnås i form av salter med syrer, for eksempel eddiksyre, melkesyre, ravsyre, benzoesyre, salicylsyre, metansulfon-syre og toluensulfonsyre, polymersyrer som for eksempel garvesyre eller karboksymetylcéllulose, og uorganiske syrer som hydrogenhalogenider, for eksempel hydrogenklorid, samt svovel-syre og fosforsyre. Eventuelt kan spesielle syresalter over-føres i salter av andre syrer, for eksempel i ugiftige farmakologisk akseptable salter ved at man behandler dem med et egnet ioneveksler-resin etter R. A. Boissonnas et al., Heiv. Chim. Acta., Bd. 43 (1960), s. 1349. Eksempler på slike ioneveksler-resiner er kationevekslere på cellulosebasis, som karboksymetylcéllulose eller kjemisk modifiserte, k'ryssbundne dextran-kationevekslere, for eksempel av Sephadex-C-type, og sterkt basiske anioneveksler-resiner, for eksempel resiner som er oppført i J. P. • Greenstein og M. Winitz i "Chemistry of the Amino Acids", John Wiley and Sons, Inc.,, New York og London, 1961,, Bd. 2,.s. 1456.

Peptidene med formel I og deres salter har verdifulle og langvarige virkninger, nemlig en appetittdempende virkning,

en hemmende virkning på sekresjonen av mave- og pankreassaft, samt en CNS-aktiverende virkning.

Den appetittsenkende og anoreksigene virkning av peptidene med formel I lar seg bestemme gjennom foringsforsøk på mus,, rotte og hund som beskrevet i' de nevnte referanser til Trygstad et al.., og Reichelt et al. Peptidenes hemmende virkning på mave- og/eller pankreas-sekresjonen bestemmes på uanestetiserte rotter eller fortrinnsvis- på uanestetiserte hunder, med spiserør-, mave- og pankreas-fistuler eller på hunder med Heidenhain-lommer, sml. B.' P. Babkin, "Secretion Mechanism of Digestive Glands", 2. utg., B. P. Hoeber, New York, 1950, i henhold til sitat "Physiology", Utg. E. Selkurt, Little, Brown and Company, Boston, 1 963 , s. 542 til 544 ; L-. Olbe, Gastroenterology, Bd. 32 (1959) s. 460; Antin et al., Journal'of Comparative and Physiological Psychology, Bd. 89 (1975),

s. 784; og Lieblihg et al., ibid., Bd. 89 (1975), s. 955. Peptidenes virkning på sentralnervesystemet, spesielt deres karakteristiske.spektrum av nevrotrope virkninger, lar seg

bestemme gjennom en rekke CNS-tester, sml. f.eks. A. J.

Kastin, R. D. Olson, A. V. Schally og D. H. Coy, Life

Sciences Bd. 25 (1 975), s. 4.01; A. J. Prange, G. R. Breese,

J. M. Cott, B. R. Martin, B. R. Cooper, I. C. Wilson og N. T. Plotnikoff, Life Sciences, Bd. 14 (1974), s. 447 og M. Brown og W. Vale, Endocrinology, Bd. 96 (1975), s. 1333.

Mus, rotte og hund foretrekkes for bestemmelse av den appetittsenkende eller anoreksigene virkning av legemidler og til bestemmelse av den hemmende virkning på mave- og/eller pankreas-sekresjonen, da det i tallrike tilfeller er fastslått utmerket parallellitet mellom dyreforsøk og kliniske under-søkelser på mennesker, eksempelvis under kontrollert peroral eller intragastral ernæring av mennesker med flytende diett, sml. H. A. Jordan, Journal of Comparative and Physiological Psychology,' Bd. 68 (1969), s. 498; G. A. Bray og F. L. Greenway, Clinics in Endecrinology and Metabolism, Bd. 5

(1976), s. 455; og H. D. Janowitz, "Rolé- of gastrointestinal

tract in regulation of food intake", sitert i "Handbook of Physiology", Avsnitt 6, Alimentary Canal., Utgiver C. -.F., Code og W. Heidel',' American Phy siological Society, Washington, T967 .

Virkningen av peptidene-med formel I og deres.farmakologisk akseptable salter som appetitthemmere og anoreksigene midler lar seg vise på rotter. Rotte foretrekkes som forsøksdyr for påvisning av virkning av legemidler som hemmer næringsopptaket. Forskjellige forfåttere'har fastslått parallelliteten mellom resultatene på rotte.og mennesket, sml. f.eks. G. A. Bray, i "The Obese Patient", Bd.. IX av "Major." Problems in Internal Medicine", W. B. Saunders Company, Philadalphia, London, Toronto, 1976. I kapittel 9 med tittel "Drug Therapy for the Obese Patient" er det under avsnittet "Pharmacology - Effects

on the Central Nervous System", på s. 364, tabell 9-4 oppgitt data, som bl.a. viser nedsettelsen av foropptaket hos rotte som følge av en rekke anoreksigene legemidler. I avsnittet "C.linieal use of Anorectic Drugs" blir det på side 369 i tabell 9-7 vist at de samme legemidler som i tabell 9-4, også

■er egnet for klinisk anvendelse.

På grunn av- deres foran nevnte egenskaper er peptidene med den generelle formel I egnet til behandling av pattedyr innen

veterinærmedisinen og også innen humanmedisinen.

På grunn av deres appetitthemmende og anoreksigene egenskaper egner de seg til behandling av fettsyke, innbefattet den preoperative .senkning av kroppsvekten som^ofte 'er - nødvendig før større inngrep i pasienter med fedme. Deres egenskaper gjør dem også verdifulle til. behandling av andre'patologiske tilstander, som krever en senkning a-v næringsopptaket og av-kroppsvekten, for eksempel bestemte former av diabetes og kretsløps-sykdommer.

På grunn av deres hemmende virkning på sekresjonen av mavesyre og pankreasvæske, egner peptider med den generelle formel I seg til behandling av patologiske tilstander med fore-komst av mave- og/eller pankreas-hypersekresjon av mavesyre eller gastrin, pepsin eller histamin, for eksempel ved tolvfingertarms-sår eller akutt pankreatitt.

Virkningen av peptidene på sentralnervesystemet viser en nevrotrop virkningsprofil, som skiller seg signifikant fra profilen av trisykliske antidepresjonsmidler og beslektede medikamenter. På grunn av deres CNS-ak.tiverende virkning er

de verdifulle midler til behandling av bevissthetsforstyrrelser eller koma på.grunn av hjernelesjoner, for eksempel ved cere-brale' traumata eller tumorer, alvorlige forfrysninger eller ved bestemte postoperative tilstander og ved bevissthetsforstyrrelser forårsaket av bestemte karsykdommer eller ved over-dosering med ' legemidler (f . eks . legemiddelintoksikas.joner) .

Ved bruk av peptidene med den generelle formel I, eller deres farmakologisk akseptable salter, som appetittnedsettende eller anoreksigene midler til behandling av fettsyke eller andre patologiske tilstander som fordrer nedsettelse av næringsopptaket, ved anvendelse som middel til å hemme over-flødig mave- 'eller pankreas-sekresjon eller ved anvendelse som CNS-aktiverende middel, kan de virksomme midler gis alene eller sammen med farmakologisk akseptable bærere. Forholdet mellom medikament og bærer bestemmes av forbindelsens løselig-het og kjemiske natur, doseringsmåte og vanlig biologisk praksis. Eksempelvis kan en medikamentmengde som er tilstrekkelig, til å nedsette appetitten og/eller næringsopptaket, gis peroralt i fast form sammen med bærere som stivelse,sukker,

bestemte leirarter og lignende.

På lignende måte kan tilsvarende mengder gis peroralt i. form av løsninger eller suspensjoner. Forbindelsene lar seg også injisere parenteralt. For perjoral eller parenteral administrasjon benyttes sterile løsninger eller suspensjoner

i en farmakologisk akseptabel bærer, som vann, etanol, propylenglycol eller polyetylenglycol som inneholder andre .løste stoffer eller suspenderingsmidler, for eksempel tilstrekkelige mengder koksalt eller glukose til å oppnå isotone løsninger, salter, av gallesyrer, gummi-arabicum, gelatin, sorbitan-monooleat, polysorbat 80 (oleatester av sorbit og copolymerisater av deres anhydrider me.d etylenoksyd) , som Tween 80.

Doseringen av peptider med den generelle formel I avhenger av administrasjonsmåte og av den spesielt valgte forbindelse. Dessuten avhenger den av pasienten..Som regel startes behandlingen med små doser vesentlig under forbindelsens opti-maldose. Doseringen blir deretter trappet opp i små trinn til optimalvirkningen-under de gitte forhold oppnås. Generelt gis forbindelsen i mengder- som nedsetter appetitten og/eller næringsopptaket, hemmer mave- og/eller pankreas-sekresjonen eller aktiverer'sentralnervesystemet uten at skadelige eller', uheldige bivirkninger opptrer. Slike doser.ligger vanligvis i området fra ca. 1,0^ug til ca. -250^ug pr kg. legemsvekt pr døgn, selv om disse dosene som nevnt, kan varieres. Særlig foretrukket er. doseringer i området fra ca. 5 til ca. 100^,ug/kg pr døgn, fortrinnsvis i form av delte doser.

De enkelte farmakologiske virkninger av peptidene med formel I er, i forhold til. vekten, kraftigere enn en rekke legemidler til samme formål. De fleste klinisk brukbare appetittdempere har dessuten en f enyletylamin-besl.ektet struktur og oppviser derfor de uønskede bivirkninger som er forbundet med denne. Peptidene med formel I har ingen fenyletyl-.amin-struktur og er derfor fri, for disse bivirkninger. Dessuten har de en lavere toksisitet og garanterer dermed en sikker anvendelse.

Ved humanmedisinsk bruk av peptidene med formel I, fortrinnsvis i form av salter med syrer, kan administreringen skje systemisk, enten ved intravenøs, subkutan eller intramuskulær injeksjon, eller ved en sublingual eller nasal administrasjon i forbindelse med farmakologisk akseptable bærere.

Det kan også fremstilles legemiddelpreparater for peroral tilførsel. Herunder blandes de virksomme stoffer med' egnede kjente farmasøytiske fortynningsmidler og opparbeides på kjent måte til preparater, som tabletter, kapsler', suspensjoner, emul-sjoner, løsninger eller dispergerbare pulvere.

Faste blandinger kan fylles i kapsler for peroral administrering. Slike blandinger kan inneholde det faste virksomme stoff i blanding med faste materialer med buffervirkning, eksempelvis i blanding med kolloidal aluminiumhydroksyd eller kalsiumhydro-genfosfat, eller sammen med et inert fast stoff som laktose.

Preparatene i form av tabletter kan overtrekkes på kjent måte eller fremstilles i form av skummende eller ikke skummende preparater. Hertil kan inerte'fortynningsmidler eller bærere, som magnesiumkarbonat eller laktose, sammen med vanlige sprengmidler, som maisstivelse og alginsyre, og smøremidler,

som magnesiumstearat, benyttes.

For nasal tilførsel i form av dråper eller spray, blir. peptidene med formel I tilsatt til en' steril, vandig bærer som også kan inneholde andre løste stoffer som. buffer eller kon-serveringsmiddel eller tilstrekkelige mengder av farmakologisk akseptable■salter eller glukose til fremstilling av isotone løsninger. Dosene.for intranasal tilførsel ligger i området fra "1,0 til 250^ug/kg/døgn, eller fortrinnsvis fra ca. 5 "til ca. 100^ug/kg/døgn.•

Peptidene med den generelle formel I kan også gis som nesepulvere eller innblåsningsmidler. Til disse formål'gis peptidene i finfordelt form sammen med en farmakologisk akseptabel fast bærer, f. eks. finfordelt polyetylenglykol (Carbowax 1 540.), finfordelt laktose eller meget finfordelt silisiumdioksyd

(Cab-O-Sil). Slike midler kan også inneholde andre tilsetnings-stoffer i finfordelt form, som konserveringsmidler, buffere eller overflateaktive midler.

Peptidene kan også gis. [ i form av langtidsvirkende midler med langsom frigjøring av legemidlet eller depot-virkning,. fortrinnsvis, ved intramuskulær injeksjon eller implantering. Slike preparatformer har den egenskap at.de frigjør fra ca. 5 til ca. 100 yug pr kg legemsvekt pr døgn.

Ofte er det ønskelig at peptidene med formel I gis kon-tinuerlig over lengre tidsrom i form av langtidsvirkende preparater med depot-virkning. Slike preparatformer kan enten inneholde et farmakologisk akseptabelt salt av det virksomme stoff som har lav løselighet i kroppsvæskene, for eksempel salter med pamoasyre, garvesyre eller karboksymetylcéllulose eller i form av et vannløselig salt sammen med et beskyttelses-middel som hindrer en rask frigjøring. I sistnevnte tilfelle kan for eksempel peptidet med formel I omdannes til en viskøs væske med ikke-antigen, delvis hydrolysert gelatin eller absorberes til en .farmakologisk akseptabel fast bærer, for eksempel sinkoksyd, eventuelt sammen med protamin. Det virksomme stoff kan også gis i form av en suspensjon i en farmakologisk akseptabel flytende bærer. Dessuten■er det også mulig å fremstille gel eller suspensjoner med■et ikke-antigent beskyttelseshydrokolloid, f.eks. natriumkarboksymetylcellulose, polyvinylpyrrolidon, natriumalginat, gelatinpolygalakturon-syrer, som pektin, eller bestemte mukopolysakkarider, sammen med vandige eller ikke-vandige farmakologisk akseptable flytende bærere, konserveringsmidler eller oyérflateaktive midler. Eksempler på slike preparater .finnes i vanlige farmakologiske håndbøker som Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 19 75. Langtidsvirkende preparater med langsom frigjøring av det virksomme stoff oppnås også ved mikroinnkapsling'i et farmakologisk akseptabelt overtrekks-materiale, som gelatin, polyvinylalkohol eller etylcellulose. Angående ytterligere eksempler på overtrekksrnaterialer og fremgangsmåter for mikroinnkapsling, henvises til J. A. Herbig i "Encyclopedia.of Chemical Technology", Bd. 13, 2. utg., Wiley, New- York, 1967, s. 436 til 456. Slike preparater og suspensjoner av peptidsalter med formel I, som bare er svakt løselige i kroppsvæskene, har den egenskap at de frigir ca. 5^ug til ca. 100 yug av peptidet pr kg legernsvekt pr døgn. De gis fortrinnsvis ved intfamuskulær injeksjon. En annen mulighet består i å tilberede' noen av de ovenfor nevnte faste preparater, for eksempel bestemte,lite vannløselige salter eller dispersjoner eller, adsorbater av saltene med faste bærerstoffer, for eksempel dispers joner, i. et nøytralt' hydrogel av et polymerisat av etylenglykolmetakrylat eller lignende kryssbundne monomerer, .(sml. US-PS 3 551 556), i form av pellets som frigir de ovenfor angitte medikamentmengder. Slike, pellets kan implanteres subkutant eller intramuskulært.

Spesielle peptider med formel I som er lite løselige i vann, kan tilberedes i form av suspensjoner i vann eller i et emulsjons-grunnlag. Vannbaserte suspensjoner fremstilles ved hjelp av fuktemidler, som kondensasjonsprodukter av poly-etylenoksyd og alkylfenoler, fettalkoholer eller fettsyrer og suspenderingsmidler, som hydrofile kolloider,.f.eks. polyvinylpyrrolidon. Emulsjonsbaserte suspensjoner fremstilles ved suspensjon av peptider ved hjelp av et fuktemiddel og suspenderingsmidler, i emulsjonsgrunnlaget under anvendelse av de ovenfor nevnte emulgeringsmidler. Suspensjoner kan i tillegg inneholde buffere og/eller søtningsstoffer, aromastoffer, farvestoffer, konserveringsmidler og.antioksydasjonsmidler.

Som forklart ovenfor fremstilles:legemidler for peroral eller parenteral tilførsel av forbindelser med formel I slik at det avgis 5 til 100'^ug/kg/døgn, fortrinnsvis i form av delte doser. Hver enhetsdose .kan inneholde 0,3 til 15 mg virk-somt stoff. For parenteral administrering foretrekkes bruk av et vannløselig peptid eller et vannløselig salt av et mindre løselig peptid, i vandige, sterile løsninger.'Eksempler på konserveringsmidler er p-hydroksybenzoesyremetyl- og -propyl-ester som, sammen med andre løselige bestanddeler tilsettes tilstrekkelige mengder natriumklorid eller.glukose til oppnåelse av isotone løsninger. Lite vannløselige peptider med formel I kan også gis intramuskulært i form av løsninger eller suspensjoner i sterile, flytende, ikke-vandige bærere, for eksempel vegetabilske eller animalske oljer. De nevnte ytterligere løsningskomponenter eller suspenderingsmidler kan eventuelt også foreligge i disse.

I - det følgende skal fremgangsmåten for fremstilling av peptider med den generelle formel I forklares nærmere-.

Den terminale karboksyl-aminosyre som er valgt for C eller B, nå■o r C har den nevnte NHR 1 betydning, beskyttes i a-aminogruppe stillingen, fortrinnsvis med tert.-butoksykarbonyl

2 . (R = Boe). Den beskyttede syre kobles deretter med et hydroksymetyl-resin eller fortrinnsvis et klormetylert resin,

ved hjelp av en katalysator, fortrinnsvis cesiumhydrogen-

karbonat•eller trietylamin. I tilslutning til koblingen,

fjernes beskyttelsesgruppen på a-aminogruppen f. eks. ved bruk av trifluoreddiksyre i metylenklorid eller ved hjelp av en av de andre ovenfor omtalte fremgangsmåter. Fjerningen av beskyttelsesgruppen foretas fortrinnsvis■ved temperaturer fra 0°C til romtemperatur.

Som klormetylert resin (1% kryssbinding) benyttes for^trinnsvis det. kommersielle produkt fra firma BioRad Laboratories, Richmond, California.

Den karboksylterminale aminosyre som er bundet til resinbæreren ved hjelp av den tidligere definerte forankringsgruppe, og som utgjør resten C, eller B nar C betyr NHR , over-føres til reaksjonskammeret av en'automatisk peptidsyntetisator som er programmert til følgende vaskesyklus:' (a) metylenklorid., (b) 33% trifluoreddiksyre i metylenklorid (2 ganger),

(c) metylenklorid,

(d) etanol,

(e) kloroform,

(f) 10% trietylamin i kloroform (2 ganger),

(g) kloroform og

(h) metylenklorid.

Det vaskede resin blir deretter omrørt i metylenklorid med en tilsvarende beskyttet aminosyre som utgjør resten B, eller A

når C betyr NHR 1: Som beskyttelsesgruppe for a-amino-funksjonen foretrekkes tert.-butoksykar.bonyl (Boe). Ved aminosyrer for. resten B, foretrekkes tosylgruppen (Tos) til beskyttelse av imidasolnitrogenet (N<im>) i hdstidin. Som beskyttelsesgruppe for fenylaminogruppen i p-aminofenylalanin foretrekkes benzoyl-karbonyl (Z). 3-metylhistidin, 3-(pyrasolyl-1)-alanin og-3-(2-tienyl)-alanin trenger ingen beskyttelse, bortsett fra for a -aminogruppen. En i det vesentlige- ekvimolar mengde av et koblingsmiddel, som dicykloheksy1-karbodiimid eller fortrinnsvis diisopropyl-karbodiimid, tilsettes. Blandingen omrøres i

to timer ved romtemperatur (22-25°C). Deretter vaskes amino-syreresinet med metylenklorid (3 ganger). Beskyttelsesgruppen for den tilkoblede aminosyre fjernes med 33% trifluoreddik-

syre i metylenklorid. I tilknytning til dette foretas trinn (c) til (h) av den ovenfor nevnte vaskesyklus.

De ovennevnte trinn gjentas med en tilsvarende beskyttet aminosyre som er valgt for resten A når C står for en aminosyre. Det beskyttede peptidresin som derved oppnås, vaskes tre ganger med metylenklorid og deretter tre ganger med metanol- og tørkes under redusert trykk. Herved oppnås praktisk talt teoretisk utbytte . (96% eller mer) .

For fremstilling av et peptid med formel I, hvor C betyr NHR 1 eller et aminosyre-lavere-alkylamid, suspenderes det beskyttede peptidresin ved 0°C i det respektive lavere-alky1-amin og omrøres i flere timer. Overskytende alkylamin avdampes deretter ved romtemperatur. Det avspaltede peptid vaskes ut fra resinet med dimetylformamid. Det beskyttede peptid utfellés deretter ved tilsetning av eddiksyre-etyl-ester og filtreres. Herved oppnås det beskyttede peptid, hvor C betyr NHR 1 eller et aminosyre-• lave're-alkylamid.

For fremstilling.av beskyttede peptider, hvor C betyr et aminosyreamid eller en aminosyre-lavere-alkylester, foretas

.den ovenfor beskrevne fremgangsmåte med ammoniakk eller den tilsvarende alkohol + trietylamin i stedet for lavere-alkylamin. Fjerningen av beskyttelsesgruppene foretas ved behandling av materialet med hydrogenfluorid og anisol ved 0°C i 15 til 60 minutter, fortrinnsvis ca. 30 minutter. Hydrogenfluorid og anisol fjernes henholdsvis under redusert trykk og ved vasking med eter. Til fremstilling av peptider med formel I, hvor C betyr en fri aminosyre, behandles det tilsvarende beskyttede peptidresin på den nevnte måte med hydrogenfluorid og anisol. På denne måte fjernes beskyttelsesgruppene og bind-ingen til resinbæreren samtidig. Herved oppnås det ønskede'peptid med formel I, hvor C står for en fri aminosyre. For fremstilling av peptider med formel I, hvor C betyr 2-amino.hydroksyetyl (Gly-ol) , behandles A-B-dipeptidres.inet med 2-aminoetanol,'hvorved det ønskede peptid med formel I, hvor C betyr Gly-ol oppnås direkte. Eventuelle dinitrofenyl- eller . tosyl-beskyttelsesgrupper på-histidylresten fjernes samtidig.

I det etterfølgende gjengis biologiske undersøkelser av peptidene i henhold til oppfinnelsen.

Peptidenes reduksjon av appetitt og næringsopptak.fast-slås gjennom foringsforsøk på mus og rotte, i det vesentlige etter de omtalte metoder av Trygstad et al., og Reichelt et al. Med jevne mellomrom bestemmes det daglige forforbruk med en nøyaktighet på 0,1 g og kroppsvekten med en nøyaktighet på 1 g. Andre data, som oksygenforbruk, kroppstemperatur, glukose-og/eller- insulin-speil i plasma og kvantitative aminogramme.r registreres til bestemte tidspunkter.

Virkningen av peptidene på mave- og/eller pankreas-sekresjonen bestemmes i rotter eller fortrinnsvis hunder, som er forsynt med spiserør-, mave- og pankreas-fistuler i henhold til de nevnte forfåttere.Babkin, Liebling et al., eller Olbe. En skinnforing av hunder førte til en utpreget økning

av syresekresjonen, som utgjorde 82% av hva som maksimalt kan oppnås ved tilførsel av 320^ug/kg/time histamin (13,55 + 1,8 mekv./15 min).' Samtidig inntrådte en signifikant økning av serum-gastrinspeilet fra en grunnverdi på 32 + 5 pg/ml til 73+10 pg/ml.'En skinnforing førte også til en utpreget økning av pankreas-sekresjoneri, som utgjorde 71%' av den maksimalverdi som kan oppnås ved tilførsel av.0,5^ug/kg/time cerulein (650 + 86 mg/15 min). Peptidene med formel I, nedsetter den maksimale syresekresjon med ca. 34%, uten signifikant forandring av serum-gastrin-speilet, og pankreas-protein.se.kresjonen med ca. 38%, ved intravenøs infusjon av doser på 25 -' -50 ^ug/kg/time . 30 minutter før og under skinn-foringen.

Hos- hunder med mavefistuler. og Heidenhain-lommer, førte gastral tilførsel av et leverekstraktfor til en utpreget økning av syresekresjonen. Den utgjorde herunder ca. 90% av den maksimalverdi som kan oppnås gjennom histamintilførsel til hund med mave-fistuler, og ca. 35% av maksimalverdien.for■

hund med Heidenhain-lommer, mens serum-gastrin-speilet steg meget signifikant til 76+12 pg/ml som er mer enn det dobbelte av grunnverdien på 29 + 5 pg/ml. Ved å tilføre peptidene med formel I i løpet av.1 time under forings-

platået gjennom intravenøs infusjon av doser på 50^ug/kg/time, ble den induserte syresekresjon redusert med 35% hos hunder med mave-fistuler og med 41% hos hunder med Heidenhain-. lommer'. uten at det oppsto signifikante forandringer av serum-

gastrin-speilet. Peptider med den generelle formel I, hemmer altså også den foringsbetingede insulin- og gastrin-økning.

Hos hunder med .pankreas-fistuler stimulerte normal

foring det pankreatiske HCO^til 80% av den maksimalverdi som-kan oppnås ved tilførsel av 3 KU/kg/time sekretin, og proteinutskillingen til 92% av den maksimalverdi som kan oppnås med 0,5 ^,ug/kg/time cerulein. Peptidene med formel I, gitt på den ovenfor nevnte måte, nedsatte i løpet av den annen time etter .foring, HCO^ -sekresjonen 35% og protein(enzym)-sekresjonen 46% uten å forårsake brekningsanfall eller andre bivirkninger.

Disse resultater viser klart at peptider med den generelle formel I, hemmer hjerne-, mave- og tarm-fåsene i mave- og pankreas-sekresjonen, antagelig gjennom undertrykkelse av den nevro-hormonale mekanisme som er ansvarlig for disse sekre-sjoner. Ved hjernefasen dreier det seg om den nevrale, psykiske eller appetittfase av mavesekresjonen, hvor- hemmingen viser en undertrykkelse av appetitten og de anoreksigene virkninger av peptidene med formel I Eksempel 1 D- pyroglutamyl- L- histidyl- ( tosyl) - glycyl- O- CRy- resin ,

D- H-( pyro)- Glu- His( Nim- R3)- Gly- Q- CH2- resin, R3 = Tos.

2,70 g (1,00 mmol glycin) av Boe-glycinresinet med formel

Boe - Gly 0 - CH2- resin

anbringes i reaksjonskåret i en automatisk peptidsyntetisator (Beckmann Modell 990) som er programmert for.følgende vaskesyklus :

(a) metylenklorid

(b) 33% trif luoreddiksyre i. metylenklorid (2 ganger,

1 hhv.25 minutter),

(c) metylenklorid,

(d) etanol,

(e) kloroform, (f) 10% trietylamin i kloroform (2 ganger å 2 minutter), (g) kloroform og (h) metylenklorid.

Det vaskede resin omrøres deretter med 3,0 mmol tert.-butyloksykarbonyl-tosyl-histidin i metylenklorid og tilsettes 3,0 mmol diisopropylkarbodiimid. Blandingen omrøres ved romtemperatur i. 1. time.. Peptidresinet underkastes trinn (a) til (h) av den ovennevnte vaskesyklus. Deretter tilkobles 3,0 mmol D-pyroglutaminsyre på. samme måte, hvorved ' tittelforbindelsen oppnås.

Det ferdige tripeptid vaskes 3 ganger med metylenklorid

og deretter 3 ganger med metanol. Etter tørking oppnås 2,89 g materiale.

Glyc.inresinet i dette eksempel ble fremstillet av kommersielt tilgjengelig klormetylert resin (1% kryssbinding, Bio Rad Laboratories, Richmond, California).

Eksempel 2

D- pyroglutamyl- L- histidyl- glyein.

2,89 g av det beskyttede tripeptid som ble oppnådd' i.eksempel 1,. suspenderes i løpet av- 45 minutter ved 0°C' i 40 ml hydrogenfluorid og' 10 ml anisol. Deretter avdampes hydrogenfluoridet med en strøm av tørr nitrogen. Anisolet fjernes ved vasking

med eter.

Det rå peptid renses ved gelfiltrering på en søyle pakket med Sephadex G 15 (kjemisk modifisert, kryssbundet dekstran, "fine") med målene 2,5 x 95.cm. De tilsvarende fraksjoner (320 til 340 ml) lyofiliseres. Herved oppnås 320 mg D-H- (pyro) -Glu-His-Gly-OH i form av et farv<e>løst., fnokket pulver.

Ved tynnskiktkromatografi på kiselgel oppfører produktet • seg homogent i 4 forskjellige.løsningsmidler. Herunder avsettes hver gang 20-30^ug i form av flekker. Fremkallingen skjer med klorgass og påfølgende besprutning med stivelsesreagens. Det oppnås fø.lgende R^-verdier: 1-butanol : eddiksyre : vann (4:1:5, øvre fase), 0,08; eddiksyreetylester : pyridin : eddiksyre : vann (5:5:1:3) 0,28;. 1-butanol : eddiksyre : vann : eddiksyreetylester (1:1:1:1) 0,18; 2-propanol : 1 m eddiksyre (2:1)0,<2>0.

Ved aminosyreanalyse oppnås følgende verdier:

Glu 1,03, Gly 1,00, His 0,99.

Eksempel 3

3 deler D-pyroglutamyl-L-histidyl-glycin løses i 1000 deler

destillert, pyrogenfritt vann. For fremstilling av en isoton løsning tilsettes en tilstrekkelig mengde natriumklorid. Blandingen steriliseres ved autoklavering og fylles over på ' ampuller. Herved oppnås en infusjonsløsning for terapeutiske formål.

Eksempel 4

En blanding av 12 deler D-pyroglutamy1-L-histidyl-glycin og 500 deler hvitt magnesiumkarbonat og 20 deler magnesiumstearat presses i grove stykker. Stykkene granuleres, siktes gjennom en 8 mesh-sikt (2,38 mm) og presses. Tablettene som oppnås på denne.måte, egner seg for peroral administrering.

Eksempel. 5

En blanding av 12 deler D-pyroglutamyl-L-histidyl-glycin og 500 deler hvitt magnesiumkarbonat. granuleres i en tilstrekkelig mengde metanol under innblanding av en løsning.av 2 deler natrium-dioktyl-sulfosuksihat. Granulatet siktes gjennom en 12 mesh-sikt (1,68 mm) og tørkes ved 50 til 55°C. Granulatet

sendes deretter nok en gang gjennom en 12" mesh-sikt. Etter tilsetning av 8 deler magnesiumstearat, presses blandingen til

tabletter for peroral administrering.

Eksempel 6

En blanding av 24 deler D-pyroglutamyl-L-histidyl-glycin,.475 deler laktose, 94 deler maisstivelse og.3 deler magnesiumstearat presses sammen til grove stykker. Stykkene knuses til et granulat som sendes gjennom en 8 mesh-sikt (2,38 mm). Granulatet overtrekkes deretter med en tilstrekkelig mengde'av en løsning av en 50 deler skjell-lakk og 3 deler ricinusolje i 800 deler etanol. Heretter' tilsettes 3 deler magnesiumstearat. Granulatet presses til tabletter for peroral administrering.

Eksempel 7

24 deler D-pyroglutamyl-L-histidyl-glycin blandes med 576 deler

laktose i en kulemølle. Blandingen fylles.over i gelatinkapsler. Et preparat for peroral administrering oppnås.

Claims (11)

1.. Fremgangsmåte for fremstilling av peptider med den generelle formel formel A-B-C, hvor A er valgt fra gruppen bestående av L-pyroglutamyl, D-pyroglutamyl og L-homo-pyroglutamyl, B er valgt fra gruppen bestående av L-histidyl, D-histidyl, L-3 <1-> metylhistidyl, L-fenylalanyl, L-£ -aminofenyl-alanyl, og L-3-(pyrazolyl-1)ålanyl; og C er valgt fra gruppen bestående av glycin og dets lavere alkylestere, glycinamid og lavere alkylamider herav, D-alanin og L-3 -(2-tienyl)alanin, med det forbehold at C ikke kan være glycin eller glycinamid når A er L-pyroglutamyl og B er L-histidyl, karakterisert ved kobling av en hensiktsmessig beskyttet a-amino-beskyttet aminosyre med formel C, i nærvær- av en katalysator, til en resinbærer valgt fra hydroksyetyl og klormetylerte resiner, slik at den korresponderende forbindelse med formel (beskyttet C)-0-CH2 -(resinbærer) oppnås, fjerning av den a-amino-beskyttede gruppe fra sistnevnte forbindelse og kobling av den resulterende forbindelse med en hensiktsmessig beskyttet a-amino-beskyttet aminosyre med formel B i nærvær av et passende dialkyl- eller dicykloalkyl-karbodiimid for å oppnå det korresponderende beskyttede peptid knyttet til resinbæreren gjennom forankringsgruppen -O-CH -, fjerning av a-amino-beskyttelsesgruppen fra sistnevnte forbindelse og kobling av den resulterende forbindelse med en hensiktsmessig beskyttet a-amino-beskyttet aminosyre med formel A i nærvær av et egnet dialkyl- eller dicykloalkyl-karbodiimid, for å'oppnå det korresponderende beskyttede peptid knyttet til resinbæreren gjennom f orankringsgruppen -O-CH,,-, fjerning av de beskyttende grupper fra sistnevnte forbindelse., spalting av det resulterende peptid fra resinbæreren og isolering av det korresponderende peptid hvor A, B og C er som .angitt ovenfor.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at katalysatoren er cesiumbikarbonat eller trietylamin.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at peptidet med formel A-B-C behandles med en farmasøytisk akseptabel syre og det korresponderende farmasøytisk akseptable salt av peptidet isoleres.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav ^ karakterisert vedat peptidet spaltes fra resinbæreren med hydrogenfluorid i anisol og peptidet isoleres som den fri-karboksylsyre.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at peptidet spaltes fra resinbæreren med ammoniakk og peptidet isoleres som syreamidet.

6 . Fremgangsmåte, som angitt i krav 1, karakterisert ved at peptidet spaltes fra resinbæreren med en lavere, alkylamin og peptidet isoleres som C^terminal-(lavere-alkyl ) -amid

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved behandling av Boc-Gly-O-CPI^ -(resinbæreren) med trifluoreddiksyre fulgt av trietylamin, kobling av den resulterende forbindelse med t-butyloksykarbonyl-tosyl-histidin i nærvær av diisopropylkarbodiimid og behandling av den resulterende forbindelse med trifluoreddiksyre fulgt av trietylamin,- kobl ing av den resulterende forbindelse med D-pyroglutaminsyre i nærvær av diisopropylkarbodiimid, og isolasjon av D-pyroglutamyl-L-histidyl (tosyl) -glysyl-O-CI-^- (resinbærer), som så behandles med hydrogenfluorid i anisol, hvorpå D-pyroglutamyl-L-histidyl-glycin isoleres.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av et peptid med formel A-B-C, hvor A er valgt fra gruppen, besående av L-pyroglutamyl, D-pyroglutamyl og L-homopyroglutamyl, B er valgt fra gruppen bestående av L-histidyl, D-histidyl, L-3'-metylhistidyl, L-f enylalanyl, L-p_-aminof enylalanyl og L-3-(pyrazolyl-1)alanyl, og C er NHR 1 hvor R <1> er lavere alkyl, karakterisert v e cT^ kobling~av en passende "beskyttet' a-amino-beskyttet aminosyre med formel B i nærvær av en katalysator til en resinbærer valgt fra hydrok syrne tyl og klormetylerte resiner for å . oppnå den korresponderende forbindelse med formel (beskyttet B)-0-CH2 -(resinbærer), fjerning av a-amino-beskyttelsesgruppen fra sistnevnte forbindelse og kobling av den resulterende forbindelse med en passende beskyttet a-amino-beskyttet aminosyre med formel A i nærvær av et egnet'dialkyl- eller dicykloalkyl-karbodiimid, for å oppnå det korresponderende beskyttede peptid bunder til resinbæreren ved hjelp av forankringsgruppen -0-CH2 -, fjerning av de beskyttende grupper, spalting av det resulterende peptid fra resinbæreren ved behandling med et lavere alkylamin med formel P^NR 1 , hvor R er lavere alkyl, og isolering av det korresponderende peptid med formel A-B-C hvor A og B. er som angitt ovenfor og C er en NHR , hvor 1 R er lavere alkyl.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av et peptid med formel A-B-C hvor A er valgt fra gruppen bestående av L-pyroglutamyl, D-pyroglutamyl og L-homopyroglutamyl, B er valgt fra gruppen bestående, av L-histidyl, D-histidyl. L-3'-metylhistidyl, L-fenylalanyl, L-p_-aminofenylalanyl og L- 3 - (pyrazolyl-1 ) alanyl og C er 2-amino-1-hydroksyetyl, karakterisert ved kobling av en passende beskTy+rtet a-amino-beskyttet aminosyre med formel B .i nærvær av en katalysator, til en resinbærer valgt fra hydroksymetyl og klormetylerte resiner for å oppnå den korresponderende forbindelse med formel (beskyttet B)-0-CH2 -(resinbærer), fjerning av a-amiho-beskyttelsesgruppen fra sistnevnte.forbindelse og kobling av den resulterende forbindelse med en passende beskyttet a-amino-beskyttet aminosyre med formel A i nærvær av et egnet dialkyl eller dicyklo-alkylkarbodiimid for å.oppnå det korresponderende beskyttede peptid bundet til resinbæreren gjennom forankringsgruppen -O-CI^-, fjerning av de beskyttende grupper, spalting av det resulterende peptid fra resinbæreren ved behandling med 2-aminoetanol og isolering av det korresponderende peptid med formel A-B-C hvor A og B er som angitt .ovenfor og C er 2-amino-1-hydroksyety1.

10. Fremgangsmåte som angitt i kravene 8- eller 9, karakterisert ved at katalysatoren er cesium bikarbonat eller' trietylamin.

11. Fremgangsmåte som angitt i kravene 8 eller 9, ■ karakterisert ved at peptidet med formel A-B-C behandles med en farmasøytisk akseptabel syre og det korresponderende farmasøytisk akseptable salt av peptidet isoleres.