CS235151B1

CS235151B1 - Způsob dělení Dal isomerů analogů oxytocinu

Info

Publication number: CS235151B1
Application number: CS620782A
Authority: CS
Inventors: Michal Lebl; Martin Flegel; Milan Krojidlo
Original assignee: Michal Lebl; Martin Flegel; Milan Krojidlo
Priority date: 1982-08-26
Filing date: 1982-08-26
Publication date: 1985-05-15

Abstract

Předmětem vynálezu je způsob dělení D a L isomerů analogů oxytocinu obsahujících nepřirozenou aminokyselinu v poloze 2. Analogy tohoto typu jsou předmětem několika es. autorských osvědčení OA číslo 216 722, AO číslo 226 923) a mají významný natriuretický účinek, pokud obsahují v poloze 2 aminokyselinu o konfiguraci L, případně jsou účinnými inhibitory uterotonického účinku oxytocinu, pokud je aminokyselina v poloze 2 konfigurace D. Tyto analogy se zatím připravují postupnou výstavbou peptidického řetězce následnou cyklizací, a to buď přes stadium aktivního esteru ω-karboxylu modifikovaného cysteinového zbytku (u karba-analogů), který reaguje s α-aminoskupinou aminokyseliny v poloze 2 za tvorby peptidické vazby, nebo (v případě analogů obsahujících disulfický můstek] oxidací sulfhydrylových skupin vzniklých po odstranění chránících skupin ze síry cysteinu. Dosud byla příprava těchto analogů prováděna s opticky čistou nepřirozenou aminokyselinou, která musela být získána resolucí, např. s využitím enzymů [viz např. Zhuze A. L. a kol.: Collect. Czech. Chem. Comtnun. 29, 2648 (1964), AO číslo 228 431], Tuto nevýhodu odstraňuje způsob podle vynálezu, jehož podstatou je, že se D a L isomery analogů oxytocinu obecného vzorce I

Description

Předmětem vynálezu je způsob dělení D a L isomerů analogů oxytocinu obsahujících nepřirozenou aminokyselinu v poloze 2.

Analogy tohoto typu jsou předmětem několika es. autorských osvědčení OA číslo 216 722, AO číslo 226 923) a mají významný natriuretický účinek, pokud obsahují v poloze 2 aminokyselinu o konfiguraci L, případně jsou účinnými inhibitory uterotonického účinku oxytocinu, pokud je aminokyselina v poloze 2 konfigurace D.

Tyto analogy se zatím připravují postupnou výstavbou peptidického řetězce následnou cyklizací, a to buď přes stadium aktivního esteru ω-karboxylu modifikovaného cysteinového zbytku (u karba-analogů), který reaR* ¹

R-C 1

R

- . 1 + I ? — CH- CO-HH-CH-CO -H& -Gpi - n - NH-CH-CO-Pro - L au-Gly-NH

guje s α-aminoskupinou aminokyseliny v poloze 2 za tvorby peptidické vazby, nebo (v případě analogů obsahujících disulfický můstek] oxidací sulfhydrylových skupin vzniklých po odstranění chránících skupin ze síry cysteinu. Dosud byla příprava těchto analogů prováděna s opticky čistou nepřirozenou aminokyselinou, která musela být získána resolucí, např. s využitím enzymů [viz např. Zhuze A. L. a kol.: Collect. Czech. Chem. Comtnun. 29, 2648 (1964), AO číslo 228 431],

Tuto nevýhodu odstraňuje způsob podle vynálezu, jehož podstatou je, že se D a L isomery analogů oxytocinu obecného vzorce I

CH, (I)

kde

R¹ a R² je H nebo CH3, R³ je H nebo NH2¹, R⁴ je H, OH, alkyl o 1 až 3 uhlících nebo alkoxyl s jedním až dvěma uhlíky, R⁵ je S—S, S—CHz nebo CH2—S a konfigurace aminoskupiny v poloze 2 označené ⁺je D nebo L, dělí pomocí vysokotlaké chromatografie na koloně silikagelu se zakotvenými oktadecylovými řetězci na obrácené fázi v soustavě methanol nebo tetrahydrofuran jako organické rozpouštědlo a 0,1 % obj. kyselina trifluoroctové nebo 0,05 M octan amonný o pH 7 jako vodný pufr.

Způsob dělení diastereoizomerů je dále objasněn v následujících příkladech provedení. Složení mobilní fáze je vyjádřeno v objemových procentech.

Příklad 1 (2-D- a L-fenylalanin jdeamino-6-karba-oxytocin o-Nitrobenzensulfenyl-D, L-fenylalanyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S- (ω-karboxyethyl) homocysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid (200 mg) byl převeden na aktivní ester a cyklizován obvyklým způsobem (AO č. 226 923). Část směsi diastereoizomerních peptidů (100 mg) byla rozpuštěna ve 4 ml methanolu a 7 ml vody, roztok byl přefiltrován a nanesen na kolonu silikagelu se zakotvenými oktadecylovými řetězci (Partisilu ODS-2) o rozměrech 50 X X 0,9 cm a eluce byla provedena směsí 56 % methanolu a 44 % 0,1% kyseliny trifluoroctové. Byly získány dvě frakce obsahující peptidický materiál, tyto byly zahuštěny ve vakuu a lyofilizovány. Bylo získáno 12,3 mg látky o k‘ ^=l 4,9, která byla totožná se standardem analogu obsahujícím L-fenylalanin (OA č. 216 722) a 13 mg látky o k‘ = 6,5, která byla totožná se standardem látky obsahující D-fenylalanin (AO č. 226 923).

Příklad 2 (2-D- a L-O-ethyltyrosin )deamino-6-karbaoxytocin o-Nitrobenzylsulfenyl-D, L-O-ethyltyrosyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S- (,/3-karboxyethyl) homocysteinyl-pr olyl-leucyl-glycinamid (100 mg) byl cyklizován stejně jako v příkladu 1 a dělení diastereoizomérů bylo provedeno na stejné koloně s použitím mobilní fáze obsahující 55 % methanolu a 45 % 0,1% kyseliny trifluoroctové. Po zahuštění a lyofilizaci bylo získáno 10,7 miligramu látky obsahující L-O-ethyltyrosin (k‘ =' 8,0) a 11,6 mg látky obsahující D-O-ethyltyrosin (k‘ =' 10,1). Oba analogy byly shodné se standardy.

Příklad 3 (2-D- a L-p-methylfenylaniliin)deamino-6-karba-oxytocin o-Nitrobenzylsulfenyl-D, L-p-methylfenylalanyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S- (,/3-karboxyethyl) homocysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid (200 mg) byl cyklizován stejně jako v příkladu 1 a dělení části produktu bylo provedeno na stejné koloně s použitím mobilní fáze obsahující 60 % methanolu a 40 % vody. Po zahuštění a lyofilizaci bylo získáno 12,6 mg látky obsahující L-p-methylfenylalanin (k‘ 5,7) a 13,7 miligramu analogu obsahujícího D-p-methylfenylalanin (k‘ =' 7,6). Obě látky byly totožné se standardy.

P ř i k 1 a d 4 (2-D- a L-p-ethylfenylalanin )deamino-6-karba-oxytocin o-Nitrobenzensulfenyl-D, L-p-ethylfenylalanyl-isoleucyl-glutaminylasparaginyl-S- (ι/3-karboxyethyl) homocysteinyl-prolyl-leucylglycinamid (200 mg) byl cyklizován stejně jako v příkladu 1 a dělení části diastereoizomerů (100 mg) bylo provedeno na stejné koloně s použitím mobilní fáze obsahující 70 % methanolu a 30 % 0,1% kyseliny trifluoroctové. Po zahuštění a lyofilizaci bylo získáno 18,3 mg látky obsahující L-p-ethylfenylalanin (k‘ =' 6,18) a 17,6 mg látky obsahující D-p-ethylfenylalanin (k‘ = 8,48). Oba analogy byly totožné se standardy.

Příklad 5 (2-D- a L-p-methylfenylalanin )deamino-I-karba-oxytocin o-Nitrobenzensulfenyl-D, L-tyrosyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S- (χ-karboxypropyl) cysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid (100 mg) byl cyklizován stejně jako v příkladu 1 a dělení diastereoizomérů bylo provedeno na stejné koloně s použitím mobilní fáze obsahující 12 % tetrahydrofuranu a 88 % 0,5 M octanu amonného o pH 7. Po zahuštění a lyofilizaci bylo získáno 12,1 mg látky obsahující L-tyrosin (k‘ = 17,2) a 11 miligramů látky obsahující D-tyrosin, Obě látky byly totožné se standardy [Jošt K.: Collect. Czech. Chem. Commun. 38, 218 (1971) a Lehl M.: nepublikované výsledky).

Příklad 6 (2-D- a L-p-ethylfenylalanin )deamino-oxytocin

Z S-benzylmerkaptopropionyl-D, L-p-ethylfenylalanyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamidu (100 mg) byly chránící skupiny odštěpeny sodíkem v kapalném amoniaku a oxidační cyklizace byla provedena obvyklým způsobem (AO ě. 226 923). Diastereoizoméry byly děleny na stejné koloně jako v příkladu 1 s použitím mobilní fáze obsahující 65 % methanolu a 35 % 0,1% kyseliny trifluoroctové. Po zahuštění a lyofilizaci bylo získáno 16,2 mg látky obsahující L-p-ethylfenylalanin (k‘ = 10,2) a 15,3 mg látky obsahující D-p-ethylfenylalanin (k‘ =' =¹ 15,9). Obě látky byly totožné s analogy připravenými s použitím opticky čisté aminokyseliny.

Příklad 7 (2-D- a L-p-ethylfenylalanin joxytocin

Na-benzyloxykarbonyl-S-benzylcysteinyl-D, L-p-ethylfenylalanyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid (100 mg) byl cyklizován stejně jako v příkladu 6 a dělení diastereoizomérů bylo provedeno na stejné koloně s použitím mobilní fáze obsahující 60 1% metha6 nolu a 40 % 0,05 M octanu amonného o pH 7. Po zahuštění a lyofilizaci bylo získáno 8,2 mg látky obsahující D-p-ethylfenylalanin (k‘ =’ 11,6) a 7,9 mg látky obsahující D-p-ethylfenylalanin (k‘ = 23,3 j. Obě látky byly totožné se standardy. [Zhuze A. L. a kol.: Collect. Czech. Chem. Commun. 29, (1964)].

Příklad 8 (1-Penicilamin-, 2-D a L-p-ethylfenylalanin joxytocin

N-Benzyloxykarbonyl-S-benzylpenicilaminyl-D, L-p-ethylfenylalaninůsolcucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-benzylcysteinyl-prolyl-leucyl-glycinamid (200 mg) byl cyklizován stejně jako v příkladu 6 a část (100 mg) diastereoizomerů byla dělena na stejné koloně s použitím mobilní fáze obsahující 65 procent methanolu a 35 % 0,05 M octanu amonného pH 7. Po zahuštění a lyofilizaci bylo získáno 7,2 mg látky obsahující L-p-ethylfenylalanin (k‘ = 8,05 J a 7,4 mg látky obsahující D-p-ethylfenylalanin (k‘ =' 13,8). Obě látky byly totožné s analogy připravenými s použitím opticky čistých aminokyselin.

Claims

PŘEDMĚT VYNALEZU

Způsob dělení D a L isomerů analogů oxytocinu obecného vzorce I

R<
2, * ť ^R~~ C--— --_____ _CH
3 * + | *

R ·— CH- CO-NH- CH-CO-lis,-Gto-Asn- NH-CH-CO-PrO-L&u-Glv-NH

R¹* (I) kde

R¹ a R² je H nebo CH3, R³ je H nebo NH2, R⁴ je H, OH, alkyl o 1 až 3 uhlících nebo alkoxyl s jedním až dvěma uhlíky, R⁵ je S—S, S—CH2 nebo CH2—S a konfigurace aminoskupiny v poloze 2 je označené + je D nebo L, vyznačený tím, že směs analogů obecného vzorce I majících v poloze 2 racemickou aminokyselinu, se dělí pomocí vysokotlaké chromatografie na koloně silikagelu se zakotvenými oktadecylovými řetězci na obrácené fázi v soustavě methanol nebo tetrahydrofuran jako organické rozpouštědlo a 0,1 % obj. kyselina trifluoroctové nebo 0,05 M octan amonný o pH 7 jako vodný pufr.