CS233861B1 - Způsob isolace monensinů ze submersní kultury - Google Patents

Abstract

Vynález se týká způsobu izolace kokcidiostatických antibiotik monensinů ze submersní kultury,zejména mikrobiálního kmene Streptomyces cinnamonensis Kl-1. Pozůstává v tom, že se převedou lipofilní látky včetně monensinů do nepolárního rozpouštědla s dielektrickou konstantnou £. = 2 až 6, s výhodou tetrachlormethanu, trichlorethylenu, methylenchloridu, chloroformu, ethylacetátu, rozpouštědlo se oddestiluje a k destilačnímu zbytku se přidá polární rozpouštědlo, s výhodou aceton ( ~ 21,5), čímž se vysráží lipidní látky, které se odstraní filtrací a po zahuštění filtrátu se vyloučí monensiny v krystalické formě.

Description

Vynález se týká způsobu isolace monensinů ze submersní kultury.

Monensiny jsou polyetherová antibiotika, produkovaná S. cinnamonensis /Haney, Hoehn: Antimicrob. Agents Chemother. 1967, 349/, použivaná k prevenci a léčeni kokcidiosy u drůbeže, králíků a skotu /Shumard, Callender: Antimicrob. Agents CKemother. 1967, 369/; u přežvýkavcú způsobuji lepši využití potravy /Richardson et al.: J. Animal Sci. 43, 657 /1976//.

U obchodních preparátů převládá monensin A /okolo 90 % obsahu polyetherú/, zbytek tvoři monensin B a stopová množství dalších polyetherú. U různých variant S. cinnamonensis se však vzájemný poměr monensinů liší.

Monensiny, pro svou blízkou chemickou strukturu a fyzikál ni vlastnosti, tvoři směsné krystaly. Získáni jednotlivých monensinů z jejich směsi je poměrně pracné a v průmyslovém měřítku nereálné. Dosavadní způsoby získávání monensinového komplexu z kmenů, produkujících vice než 500 ^ug/ml, spočívají v extrakci kultury organickým rozpouštědlem, zahuštění extraktu, zachyceni pigmentů a balastních Lipidnich látek na sloupci aktivního uhlí event. jiného sorbentu a následující krystalizaci /US patent 3,501.568, A.O. 218032 /1982//. Tento způsob je poměrně zdlouhavý a vždy při něm hrozí nebezpečí ztrát aktivních látek na sloupci sorbentu. Proto byl vyvinut isolačni postup, který využívá rozpustnosti monensinů nebo jejich sodných soli v různých polárních i nepolárních rozpouštědlech. Naproti tomu balastni látky, které provázejí monensiny a bráni jejich krystali zaci, tak široké rozmezí rozpustnosti postrádají.

- 2 233 881

Výhodou tohoto postupu je, že se balastní Látky z extraktu odstraní bez použiti sorbentu.

Podstatou způsobu isotace podle vynálezu je, že se ze submersní kultury mikroorganismu převedou lipofilni látky včetně monensinů do nepolárního rozpouštědla s dielektrickou konstantou 6 = 2 až 6, s výhodou tetrachlormethanu, trichlorethylenu, methylenchloridu, chloroformu, ethylacetátu, načež se rozpouštědlo oddestiluje a k deštilačnimu zbytku se přidá polární rozpouštědlo, s výhodou aceton / é » 21,5/, čímž se vysráži lipidni látky, které se odstrani filtraci a po zahuštěni filtrátu se vylouči monensiny v krystalické formě. Zalkalisujeme-li fermentačni kapalinu roztokem uhličitanu sodného na pH 8,5 až 9,0 nebo protřepeme-li extrakt kultury roztokem uhličitanu nebo hydrogenuhli či tanu sodného, ziskáme jako výsledný produkt lépe krystalující sodné soli monensinů. Vzhledem k tomu, že rozpustnost monensinů v organických rozpouštědlech se prakticky neliši od rozpustnosti jejich sodných soli, je isolační postup v obou případech stejný.

Dále jsou uvedeny příklady isolace monensinů podle vynálezu.

Přiklad 1

Streptomyces cinnamonensis K1-1 byl kultivován ve 120 baňkách o objemu 500 ml, plněných 50 ml živné půdy, za známých podmínek /A.O. 218032 /. Kultivace byla zrušena v 96. hodině. Mycelium bylo zachyceno na filtru a extrahováno methanolem /3 x 2000 ml/, zatímco filtrát byl zalkalisován roztokem uhličitanu sodného na pH 8,5 a vytřepán tetrachlormethanem /3 χ 3000 ml/. Methanolický extrakt mycelia byl za vakua oddestilován; destilačni zbytek byl zředěn vodou, za lká lizovanou uhličitanem sodným na pH 9, a vytřepán rovněž tetrachlormethanem /5 x 500 ml/. ^Tetrachlormethanové roztoky byly spojeny, filtrovány přes vrstvu bezvodého síranu sodného a zahuštěny. Olejovitý destilačni zbytek byl rozmíchán v 1500 ml acetonu a uložen 6 h při 4 °C. Vyloučená sraženina byla zachycena na fritě hustoty G3. Filtrát byl zahuštěn asi na 500 ml a uložen 24 h při 4 °C. Vyloučené krys233 Ml

- 3 tály /6,5 g/ byly promyty hexanem a vysušeny. Zahuštěním matečných louhů byly získány další krystalické podíly. Celkový výtěžek byl 7,3 g bezbarvých krystalů, obsahujících podle hodnoceni chromatografi 1 na tenké vrstvě /Vaněk a kol.: A.O. 218032 ΙΊ922ΙΙ asi 60 5í sodné soli monensinu A a 40 % sodné soli monensinu B.

Příkla>2

S. cinnamonensis byl submersně kultivován v poloprovozním měřítku v 300 l fermentačnim tanku na 150 l živné půdy o známém složeni /A.O. 218032/.

Po 96 hodinách kultivace bylo mycelium z fermentačni kapaliny odděleno centrifugaciý supernatant nebyl pro nizký obsah moňensinů dále zpracováván. Mycelium bylo lyofi lisováno /3500 g/ a extrahováno chloroformem /3 x 15 1/. R-ozpouštědlo bylo oddestilováno a dešti Lační zbytek /165 g/ byl rozpuštěn v acetonu /6 1/. Acetonový roztok byl uložen při 4 °C. Po 4 h byla vyloučená sraženina filtrována /hustota frity G3/; filtrát byl zahuštěn přibližně na 1/5 svého objemu a uložen 20 h při teplotě .4 °C. Vyloučené krystaly /95 g/ byly promyty hexanem a vysušeny. Z matečných louhů, uložených v chladu, se vyloučily dalši, již méně čisté krystaly. Po překrystalováni všech podilů z hexanu a aceton-vody byl celkový výtěžek 135 g bezbarvých krystalů, obsahujících podle chromatogra f i e na tenké vrstvě asi 65 %

- \ monensinu A a 35 7» monensinu B.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNALEZU

   233 861

   Způsob isolace monensinů ze submersni kultury, vyznačený tim, že se převedou lipofilni Látky včetně monensinů do nepolárního rozpouštědla s dielektrickou konstantou £. = 2 až 6, s výhodou tetrachlormethanu, trichlorethylenu, methylenchloridu, chloroformu, ethylacetátu, rozpouštědlo se oddestiluje a k dešti Lačni tnu zbytku se při dá polární rozpouštědlo, s výhodou aceton^ čímž se vysráži lipidni látky, které se odstraní filtrací a po zahuštěni filtrátu se vyloučí mo nensiny v krystalické formě.