CS233604B1 - Kmen Trichoderma reesei CCF 1853 - Google Patents

Abstract

Předmětem vynálezu je příprava a získání nového kmene Trichoderma reesei 139, který je uložen ve Sbírce kultur hub Katedry botaniky nižších rostlin Karlovy university v Praze, ČSSR, registrační číslo CCF-1853 a v Centrální sbírce průmyslových mikroorganismů Všesvazového vědecko-výzkumného institutu genetiky a selekce průmyslových mikroorganismů v Moskvě, SSSR, registrační čislo C»PM F-170. i ; Hlavní výhodou tohoto nového kmene ju- zvýšená produkoe celulolytického systému. Kmen Trichoderma reesei 139 je použitelný zejména v potravinářském průmyslu, například při degradaci různých celulosových materiálů a v krmivářském průmyslu

Description

Vynález patří do oblasti mikrobiologického průmyslu, zejména se týká produkčních kmenů enzymů, jmenovitě kmene Trichoderma reesei (viride), který syntetizuje enzymy celulolytického komplexu. Celulolytické enzymy, vyrábéVíé na basi mikrobiologické syntézy se používají v širokém měřáiku v zemědělství zejména v živočišné výrobě při silážování a zlepšování výživných hodnot hrubých krmiv a slámy. Velmi perspektivní je použití celulas při výrobě etylalkoholu a technické glukosy z levných materiálů a zemědělských odpadů, obsahujících celulosy. V potravinářském průmyslu se celulasové preparáty používají k degradaci celulosových složek zpracovávané suroviny.

Ve známých autorských osvědčeních a patentech se jako producenti celulas používají různé druhy bakterií, hub a aktinomycetů,z plísnových kultur jsou známé Geotrichum candidum, Thielavia terrestris, Myrothecium verrucaria, Trichoderma longibrachiatum, Penicillium iriensis a celé řada kmenů Trichoderma reesei (viride) i VNII genetika B7, 44, QM 9123,

QM 9414, MCU 77 a jiné (autorské osvědčení SSSR č. 368303, 577230, 591502, 745933, USA patenty č. 3734831, 3764475,

3972775, NSR patent č. 2133544, patent Velké Británie č. 1546544, mezinárodní přihláška WO 80/01080.

V autorském osvědčení SSSR č.591502 je popsán produkční kmen celulolytických enzymů Trichoderma viride VNII genetika B7 (podle nového názvosloví Trichoderma reesei). Kmen VNII genetika B7 má tyto charakteristické znaky : za 4 dny růstu na agarových půdách vytváří kompaktní kolonie o průměru 20-35 mm. Tvorba spor velmi dobrá. Konidie jsou žlutobéžové barvy, oválné dvou typů - velké (délka 6,3yu,šířka 4,3yu) ^a drobné (délka 4,54 yu, šířka 3,43/u). Kmen B7 zcela ztekucuje íz

233 B04 želatinu po 15-20 dní růstu, peptonizuje mléko po 7-10 dní růstu. Dusičnany neredukuje ani za 30 dnů inkubace. *

Při kultivaci na půdě se 4 % řepných řízků byla aktivita eelulhs kmene B7 na základě hydrolýzy filtračního papíru, odvoskované bavlny a natriumkarboxymetylcelulosy:

hydrolýza filtračního papíru - 13-15 mg/ml (1,2-1,4 IU/ml), hydrolýza odvoskované bavlny - 200-250 mg/ml (0,8-0,9 IU/ml), hydrolýza Na-KMC - 150-200 mg/ml (27,75-37,0 IU/ml).

Stanovení aktivity prováděli podle Mandels-Webera Cellulases and their Applications”, Adv.Chem. Ser. 95,391,

1969. IU je mezinárodní jednotka aktivity , která se rovná 1 uMol glukosy/min·

Na základě největšího počtu znaků (druh produkčního kme- * ne, složení živné půdy pro biosyntézu enzymů) a dosahovaného účinku lze za prototyp považovat kmen Trichoderma reesei(viride) VNII genetika B7, který je uložen v Centrální sbírce průmyslových mikroorganismů, s registračním č. CMBM F-79.

Nedostatkem kmene - prototypu je relativně nízká aktivita komplexu celulolytických enzymů při hydrolýze Na-KMC, což omezuje efektivnost použití preparátu, připravených fermentací uvedeného kmene pro silážování slámy a hrubých krmiv.

V mezinárodní přihlášce W0-80/01080 se navrhuje nový kmen Trichoderma reesei MCU 77, který při kultivaci na půdě obsahující 1 % celulosy, pepton a močovinu, mé celulolytickou aktivitu : hydrolýza filtračního papíru - 1,75 IU/ml, hydrolýza Na-KMC- 35,0 IU/ml.

Na základě dosahovaného efektu a současné vysoké aktivity dvou typů lze kmen MCU 77 považovat za základní vzor.Nedostatkem tohoto kmene je relativně nízká aktivita při hydrolýze Na-KMC.

Dále je znám kmen Trichoderma viride 44 (autorské osvéd3

233 804 čení SSSR č.745933), u kterého je produkce celulas hydrolyžujících filtrační papír 22,0-25,0 mg/ml glukosy (2,03-2,30 lU/ml) V popisu však nejsou uvedeny podmínky, ve kterých je dosahováno uvedených aktivit, dále není uvedena aktivita celulas hydrolyzujících Na-KMC. Vzhledem k tomu není možné srovnávat tento kmen s naším kmenem.

Cílem navrhovaného je získání nového vysokoprodukčního kmene Trichoderma reesei, který má vyšší aktivitu enzymů celulolytického komplexu, především celulas hydrolyzujících Na-KMC.

Vytčeného cíle bylo dosaženo vytvořením nového kmene Trichoderma reesei který je mutantou, získanou mnohostupňovou selekcí s použitím mutagenních faktorů (urychlenýh elektronů) z kmene VNII genetika B7·

Předkládaný kmen Trichoderma reesei 139 se podstatně liší od kmene - prototypu B7 jak aktivitou, tak i řadou kultivačně morfologických znaků.

Na rozdíl od prototypů,kmen 139 roste pomaleji na agarových půdách, růst kolonií a vytváření konidií u kmene 139 se ukončuje po 7ůenní inkubaci a u kmene B7 po 4denní inkubaci. Vzdušné mycelium je vláknité. Tvorba spor je skrovná. Konidie jsou kulovité nebo lehce oválné, rozměrem jednoho typu a značně menší než u kmene B7 (délka-3,7 Ái, šířka - 3,3 _v/u). Na rozdíl od kmene B7, kmen 139 nekoaguluje mléko a slabě asimiluje dusičnany ·

Při celkové vysoké aktivitě celulas všech typů se)kmen Trichoderma reesei liší cílenou syntézou celulas aktivně hydrolyzujících Na-KMC. Při kultivaci na živné půdě s řepnými řízky je aktivita celulas produkovanýchěkmenem : hydrolýza filtračního papíru - 14-16 mg/ml(1,3-1,48 lU/ml)

233 804 hydrolýza odvoskované bavlny - 200-250 mg/ml (0,8-0,9 IU/ml) hydrolýza Na-KMC :

podle metodiky SSSR -200-250 mg/ml (37,0-46,3 IU/ml) podle metodiky ČSSR - 140-160 mg/ml.

Při kultivaci na modelové půdě s mikrokrystalickou bukovou eelulosou ma\kaen následující celulolytickou aktivitu: hydrolýza filtračního papíru - 10-12 mg/ml (0,93-1,1 IU/ml) hydrolýza odvoskované bavlny - 50-60 mg/ml (0,19-0,23 IU/ml) hydrolýza Na-KGM :

podle metodiky SSSR - 240-250 mg/ml (44,4-46,3 IU/ml) podle metodiky ČSSR - 120-150 mg/ml.

V analogických podmínkách je aktivita kmene - prototypu B7 (kontrola na mikrokrystalické bukové celulose) : hydrolýza filtračního papíru - 10-12 mg/ml (0,93-1,1 IU/ml) hydrolýza odvoskované bavlny - 45-50 mg/ml (0,17-0,21 IU/ml) hydrolýza Na-KMC :

podle metodiky SSSR - 220-250 mg/ml (40,7-46,3 IU/ml) podle metodiky ČSSR - 100-130 mg/ml.

Takovým způsobem předložený kmen Trichoderma reesei při kultivaci na fermentačních půdách různého složení zabezpečuje ve srovnání s výchozím kmenem B7 zvýšení aktivity komplexu celulolytiekých enzymů při hydrolýze natriumkarboxymetylcelulosy v průměru o 20-30 % a při hydrolýze nerozpustných substrátů o 10-20%. cep 44^3

Použití kmene Trichoderma reesei při průmyslovém získání celulolytických preparátů umožňuje intensifikovat výrobní proces a zvyšuje efektivnost použití uvedených preparátů v krmivářském a potravinářském průnyslu při degradaci celulolytických složek' celé řady produktů.

233 804

Ceř Ή583

Charakteristika kmene Trichoderma reesei , kulti* vačněmorfologické vlastnosti.

Syntetická půda Czapek-Dox se saharosouí za 7 dnů růstu je průměr kolonie 40-45 mm, kolonie má nerovný okraj. Kolonie plochá. Vzdušné mycelium vláknité, matně béla vé.Tvorba spor chudší. Půda není zbarvena.

Syntetická půda podle Pontecorva : za 7 dnů růstu průměr kolonie 30-35 mm. Kolonie rovná. Vzdušné mycelium dlouze vláknité až vláknité, citrónově žlutavé barvy. Konidie světle žlutavé až béžové barvy, tvoří se ve středu kolonie. Půda zbarvená jasně žlutě.

Syntetická půda se škrobem : kolonie s rovným povr, chem. Vzdušné mycelium vláknité. Konidie světlebéžové barvy, tvořící se v centru kolonie. Půda zbarvena žlutě.

- Sladinový agar : za 7 dnů růstu je průměr kolonie

50-55 mm. Kolonie vyvýšená, střed kolonie lehce vpadlý. Vzdušné mycelium vláknité až vatovité. Konidie světlebéžové oříškové barvy, šířící se po povrchu kolonie, obvykle i po jejím okra ji. Půda je zbarvena světle žlutavě.

Živný agar Raulin-Toma s přídavkem 1% kukuřičného extraktu : za 7 dnů růstu je průměr kolonie 25-30 mm. Povrch kolonie hladký. Vzdušné mycelium krátce vláknité. V centru kolonie se vytváří spory světlebéžové barvy. Půda není zbarvena.

Rozměr a forma konidií : při kultivaci na agarových pů dách konidie jsou kulovitý až oválného tvaru. Jednoho typu o * -velikosti - délka 3,6-3-8,aŠíře 3,2-3,4 A .

Fyziologicko-biochemické znaky : želatinu ztekucuje za tři týdny růstu. Mléko nekoaguluje. Škrob hydrolysuje. Slabě asimiluje dusičnany. Dobře asimiluje glukosu,sacharosu,maltosu laktosu, celobiosu, mannosu, xylosu, arabinosu, fruktosu,gly233 804 c-erin. Slaběji galaktosu, ramnosu.

V podmínkách submersní fermentace syntetisuje komplex celulolytických enzymů vyznačujících se vysokou aktivitou při hydrolyse natriumkarboxymetylcelulosy. ccp

Příklady použití kmene Trichoderma reesei pro přípravu celulolytických enzymů.

Pro provedení a získání očkovací látky se kultivuje kmen 139 na šikmém sladinovém agaru po dobu 7 dnů při teplotě 28-30°C,

Přiklad I.

Pro provedení submersní fermentace se používá tekutá živná půda následujícího složení (hmot.v %) :

řepné řízky (sušené) - 4,0 (NH₄)₂S0₄ - 0,14

-kh₂po₄ - 0,10

MgSO₄ - 0,03

CaCl₂ -0,03 močovina - 0,03 mikroelementy : (mg/ml půdy)

PeS0₄. 7H₂O -'1,0

ZnCl₂ - 0,8

MnS0₄. H₂0 - 0,5

CoCl₂. 6H₂0 - 0,5 (NH₄)₆. 4H₂0 . Mo₇0₂₄ - 10,0 destilovaná voda pH - 4,2-4,7

Submersní fermentace se provádí v kultivačních baňkách o objemu 750 ml, náplň 100 ml živné půdy, v aerobních podmínkách. Optimální teplota inkubace 28-30°C.

Očkování fermentační půdy provádí se vodní suspensi spor v množství 6-8x10^ konidií na 100 ml půdy.

233 604 , Celulolytické aktivita kultivační půdy :

hydrolýza filtračního papíru - 14-16 mg/ml (1,3-1,48 IU/ml) hydrolýza odvoskované bavlny - 200-250 mg/ml (0,8-0,9 IU/ml) hydrolýza Na-KMC :

podle metodiky SSSR - 200-250 mg/ml (37,0-46,3 IU/ml) podle ne todiky ČSSR - 140-160 mg/ml Příklad II.

Pro provedení submersní fermentace se používá tekutá půda o složení (hmot.v %) :

mikrokrystalická buková celulosa .2,0 extrakt pšeničných otrub 1,0 (NH₄)₂S0₄ 0,3

NaON₃ 0,3 kh₂po₄ 1,0

MgS0₄ 0,05 destilované voda .pH živné půdy 6,2

Pro očkování živné půdy používá se buň vodní suspense spor (10? konidií na 100 ml půdy), nebo vegetativní mycelium vyrostlé submersně v průběhu 24 hodin při teplotě 28-30°C na půdě následujícího složení (hmot. v %) :

sacharosa	2,0
kh2po4	0,2
(nh4)2so4	0,2
MgS04	0,03
CaCl2	0,03 '
mikroelementy v množství,	uvedeném v příkladě I.
destilovaná voda
pH 4,5 - 4,9
Submersní fermentace	se provádí v kultivačních

kách o objemu 500 ml, náplň 100 ml živné půdy, na cirkulační i

233 604 třépačce (240 obr/min) při teplotě 28 ax 50°C. Množství vegetativního inokula - 10 ml na 100 ml půdy·

Za šest až sedm dnů submerzní kultivace je celulolytická aktivita v kultivační půdě :

hydrolýza filtračního papíru 10-12 mg/ml (0,95-1,1 HJ/ml) hydrolýza odvoskované bavlny 50-60 mg/ml (0,19-0^,25 IU/ml) hydrolýza Na KMC podle metodiky SSSR 240-250 mg/ml (44,4-46,5 IU/ml) podle metodiky ČSSR 120-150 mg/ml

Pracovní postup, kterým byl nový kmen Trichoderma reesei 159 připraven, se skládá z několika operací:

a) Příprava základní sterilní sporové suspenze Trichoderma reesei.

Dobře narostlá kultura uvedeného mikroorganismu na sladinovém agaru se převrství 10 ml sterilního roztoku Tweenu 80, promíchá na homogenizátoru a za sterilních podmínek se odfiltruje přes vatový filtr. Odfiltrovaná spórová suspenze se pak dále ředí sterilním roztokem Tweenu 80 a to tak, aby počet spor činil v 1 ml cca 1,2 - 1,6 x 1C^«

b) Ozáření sporové suspenze Trichoderma reesei.

Takto upravená základní spórová suspenze uvedeného mikroorganismu se napipetuje sterilně do malých sterilních Petriho misek v množství 2,5 - 5,0 ml a vsune do ozařovacího prostoru.

K ozařování se používá vysokofrekvenční lineární urychlovač typu Tesla VUVET. Ozařovací dávka je 50 Krad. Spórová suspenze v Petriho miskách se ihned po ozáření vyjme z ozařovacího prostoru.

c) Izolace jednotlivých mutant uvedeného mikroorganismu.

Po ozáření dále se ředí základní spórová suspenze sterilním O 7 / roztokem Tweenu 80 na cca 10-10 spor na 1 ml. Takto naředěnou spórovou suspenzí uvedeného mikroorganismu se očkuje sladinový agar v Petriho miskách po 0,1-0,2 ml u vzoiku a po 0,1 ml u konr

233 604 troly rozetřením po povrchu Petriho misek. Zaočkované Petriho misky se potom uloží do termostatu při 29 ex 50°C po dobu 60 ol 72 hodin. Po.této době se odizolují jednotlivé monokolonie a přeočkují na šikmý agar sladinový. Po sedmidenní kultivaci se u jednotlivých odizolovaných mutant stanoví celulasová aktivita a morfologické vlastnosti.

Kmen Trichoderma reesei 139 připravený postupně pětinásobným ozářením urychlenými elektrony je uložen ve Sbírce kultur hub Katedry botaniky Karlovy university v Praze, ČSSR, registrační číslo CCF 1855 a v Centrální·sbírce průmyslových mikroorganismů Všesvazového vědecko-výzkumného institutu genetiky a selekce průmyslových 'mikroorganismů, Moskva, SSSR, registrační číslo CMPMF 170.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYN/ LEZU

   Kmen mikroorganismu Trichoderma reesei, CCF 1853^ producent celulolytičkých enzymů·

   Vytiskly Moravské tiskařské závody,