CS231242B1 - Method of directional dedifferential transformation of bean plants - Google Patents

Description

231242 2

Vynález sa týká spósobu usmernenej dediferenciačnej transformáeie bĎbovitých rastlín. K indukcii dediferenciačnej transformáeie buniek a pletiv rastlín sú najčastéjšie použí-vané syntetické auxinoidy, ako je kyselina beta-indolyloctová (IAAJ, kyselina alfa-naftyl-octová (NAA), kyselina indolylmaslová (IBA1, kyselina 2,4-dichlórfenoxyoctová (2,4-D);, deri-váty kinínu, gibereliny, retardanry a iné (Kruše, P. F., Petterson, Μ. K.: Tissue culture,Methoda and Aplications, Academie Press New York and London 1973, p. 868; Novák, F. J. /Edit./:Využití kultur rostlinných explantátu ve šlechtění, Sbor. Mezinár. Symp. ČSAV, Praha 1977,p. 650; Butenko, R. G. /Edit./: Kultura kletok rastenij, Kyjev 1978, p. 384), ktoré stimulujúmeristenizáciu diferencovaných buniek a sú nevyhnutné pre udržanie·neorganizovaného rastupletivovej kultúry. Táto ich vlastnost móže byť využitá pri zvyšovaní produkcie biomasypomocou pletivových kultúr (Venketeswaran, S., Gandhi, V.: Biomass, 2, 5-15, 1982). V posledných rokoch však boli dokázané analogické účinky aj niektorých iných syntetickýchauxinoidov indolylového radu. Niektoré z nich, například benazolin (4-chlčr-2-oxo-benzotiazo-lín-3-octová kyselina) alebo benzotiazoliloctová kyselina sú rovnako aktivně v iniciáciia raste kalusov mnohých rastlín ako 2,4-D, alebo ju dokonca prevyšujú (Ingram, D. S., Butcher,D. N.: Z. Pflanzenphysiol., 66.206, 1972).

Podstata spósobu usmernenej dediferenciačnej transformáeie bĎbovitých rastlín spočíváv tom, že na rastlinný organizmus sa pĎsobi derivátmi 2-R-3-R^-substituovaných benzotiazóli-ových solí všeobecného vzorca

kde R je vodík R1 je alyl, metoxykarbonylmetyl) ethoxykarbonylmetyl, propoxykarbonylmetyl, alyl- oxykarbonylmetyl, pentoxykarbonylmetyl, izopropoxykarbonylmetyl, butyl, propargyl,propyl X- je bróm, chlór, jód, -4 -3-3 o koncentrácii 10 až 5.10 mol.dm

Preukazná transformácia rastlinných pletiv a buniek nastáva pri koncentráciách 10 až-3 —3 * 5.10 mol.dm . Dediferenciačnými procesmi dochádza k vytvoreniu kalusu krémovo-žltej farby. V štádiu primokalusu pletivo sa rozpadává na buňky. Po preočkovaní na čerstvé médium analo-gického zloženia, ako bolo médium počas dediferenciácie, kalus zachovává typický neorganizo-vaný rast. Čerstvá hmotnost biomasy v procese dediferenciácie sa zvyšuje o 28-30 %. Pri -7 -9 -3 koncentrácii 10 až 10 mol.dm je zvýšenie 7 až 10 % hmot.

Zlúčeniny aplikované podlá vynálezu spĎsobujú analogické morfogenné procesy a morfologic-ké efekty ako horeuvedené fytohormóny, a·to v podmienkach in vivo aj in vitro.

Stupeň účinnosti předmětných látok závisí od použitéj koncentrácie, od charakteru sub-stituentov viazaných na jádro benzotiazolu a od aniónu.

Uvedené biologické vlastnosti, ale aj ekonomický aspekt, relativné nízké náklady nasyntézu benzotiazolov zvýrazňujú ich význam ako potencionálnych induktorov usmernenej dedi-ferenciačnej transformáeie rastlinného organizmu na účelom biotechnologických manipulácii. Přikladl V prvej sérii pokusov v podmienkach in vivo k indukcii dediferenciácie boli použitéklíčence bóbovitej rastliny (Pisum sativum L., var. Smaragd). Po imbibícii (6 h) v destilova- 3 231242 nej vodě semená klíčili v tme v termostate 72 hodin. Potom boli klíčence po omytí od perlituosušené papierovou vatou, selektované a na áalšie testy boli použité klíčence s koreňomdlhým 25-30 mm - 1 mm. Súbory klíčencov (5 ks) boli vysadené v horizontálněj polohe na navlh-čený filtračný papier do Petriho misiek priemernej velkosti 17 cm. Filtračný papier bolnasýtený účinnou látkou v koncentráciách 5.10 3, 10 3, 10 10 10 10 , 10-3, 10 ® mol. •dm 3. Kontrolná séria klíčencov bola inkubovaná na filtračnom papieri, ktorý bol nasýtenýdestilovanou vodou. Indukcia dediferenciácie sa uskutočnila v termostate v tme pri 25 °C - 1 °Cpočas 72 až 96 hodin. Efekt dediferenciačnej transformácie bol stanovený vizuálně pomocou mikroskopickej lupy. Maximálnu transformačnú účinnost spósobuje 3-Etoxykarbonylmetylbenzoti-- -3-3 zoliumbromid pri koncentrálcii 5.10 mol.dm . Ostatně deriváty boli najúčinnejšie taktiež -3 -3 pri koncentrácii 5.10 mol.dm Přiklad 2 V druhej sérii pokusov v podmienkach in vitro kalogenáza bola indukovaná na apikálnychsegmentoch primárných koreňov bóbovitej rastliny (Vicia·sativa L. var. Solařka) . Selektované··semená (přibližné rovnakej velkosti a farmy osemenia) boli sterilizované roztokom 5% chlor-aminu 1 hodinu a niekolkokrát opláchnuté sterilnou destilovanou vodou. Sterilně semená klíčiliv Petriho miskách na 0,8% agarovom médiu 48 hodin v tme pri 25° - 1 °C. K indukcii kalogenézyboli použité sterilně klíčence 25-30 - 1 mm dlhé. Z nich boli dekapitované apikálne segmentyprimárných koreňov v dlžke 10-15 mm, ktoré boli vysadené do Petriho misiek v horizontálněj polohe na 0,6 % modifikované pevné agarovo médium podlá Murashige-Skooga. V pokusných varian--3 -9 -3 toch médium obsahovalo účinné látky v koncentráciách 5.10 -10 mol.dm . V kontrolnej variante médium obsahovalo vyššie uvedené známe fytohormonálne látky.

Po stanovení čerstvej hmotnosti apikálnych segmentov primárných koreňov kalogenézabola indukovaná pri teplote 25 °C v tme počas 14 dní. Příprava modelového materiálu, akoaj kultivácia, boli robené v aseptických podmienkach. Nárast čestvej hmotnosti počas kalogenézybol stanovený gravimetricky. Maximálna dediferenciačná účinnost bola zistená u 3-Etoxykarbonyl- metylbenzotiazóliumbromidu pri koncentrácii 10 3 mol.dm 3. Ostatně deriváty boli najúčinnej--3 -3 šie taktiež pri koncentrácii 10 mol.dm Příklad 3 V třetej sérii pokusov v podmienkach in vitro kalogenéza bola indukovaná na intaktnýchklíčencoch a klíčencoch s amputovanou stonkou a koreňom bóbovitej rastlinyi(Viacia sativaL., var. Solarka). Podmienky sterilizácie semien boli zachované ako v testoch uvedených v příklade 2. Sterilně semená boli vysadené do skúmaviek v A. variante na 0,6% modifikovanépevné agarovo médium podlá Murashige-Skooga s obsahom účinných látok ako v pokusoch uvede-ných v příklade 2. V B. variante sterilně semená klíčili v Petriho miskách na 0,8% agarovom médiu. Povyklíčení zo semien boli extirpované stonky a kořene. Semeno bolo znova vysadené na médiumanalogického zloženia ako v A. variante. Kalogenéza bola sledovaná počas 7-14 dní v tme pri teplote 25 °C-^ 1 °C v termostate. Maximálna účinnost kalogenézy bola zistená u 3-Etoxy--3 -3 karbonylmetylbenzotiazoliumbromidu v A. variante v koncentrácii 5.10 mol.dm a v B. vari-—3 -3 ante v koncentrácii 10 mol.dm . Ostatně deriváty v A. a B. variante testov boli najúčin- nejšie pri analogických koncentráciách.

Zlúčeniny aplikované podlá vynálezu: • 1. 3-Alylbenzotiazóliumbromid 2. 3-Metoxykarbonylmetylbenzotiazóliumbromid 3. 3-Etoxykarbonylmetylbenzotiazóliumbromid 4. 3-Propoxykarbonylmetylbenzotiazóliumbromid 5. 3-Alyloxykarbonylmetylbenzotiazóliumbromid

Claims (2)

1. 231242 4 6. 3-Pentoxykarbonylmetylbenzotiazóliumbromid 7. 3-Izopropoxykarbonylmetylbenzotiazóliumbromid 8. 3-Butylbenzotiazóliumbromid 9. 3-Propargylbenzotiazóliumbromid 10. 3-Propoxykarbonylmetylbenzotiazóliumchlorid 11. 3-Metoxykarbonylmetylbenzotiazóliumchlorid 12. 3-Butylbenzotiazóliumjodid 13. 3-Propylbenzotiazóliumjodid PREDMET VYNÁLEZU SpŮsob usmernenej dediferenciačnej transformácie bóbovitých rastlín vyznačujúci satým, že na rastlinný organizmus sa působí derivátmi
2. 2-R-3-R^-substituovaných benzotiazólio-vých solí vžeobecného vzorca

   μ+) li kde R je vodík r! je alyl, metoxykarbonylmetyl, etoxykarbonylmetyl, propoxykarbonylmetyl; alyloxy karbonylmetyl, pentoxykarbonylmetyl, izopropoxykarbonylmetyl, butyl, propargyl,propyl X je bróm, chlór, jód, -4 -3 -3 o koncentrácii 10 až 5.10 mol.dm i Severografia, n. p., MOST Cena 2,40 Kčs j ’ y y ' « l i« , \ 'i< , s. i ' X^ ' - > 1 . , '.) ‘ i . · ·?,(,?» -v · · .· ’ .'TV