CS224488B1 - Reagenční proužky k důkazu a stanoveni kyseliny askorbové - Google Patents

Description

Vynález se týká složeni indikačního systému stabilních reagenčních proužků pro stanovení kyseliny askorbové.

Ke stanovení kyseliny askorbové, vitaminu C, v různých biologických, farmaceutických nebo potravinářských materiálech 8 produktech ae užívá řady fyzikálních nebo chemických metod. I když jsou tyto metody pomérhč přesné, vyžadují dokonalé laboratorní a přístrojové vybavení a jsou povStSinou dosti pracné a zdlouhavé. V řadě případů je však potřeba zjistit přítomnost kyseliny askorbové nebo určit její obsah rychlým a jednoduchým způsobem, byl i za cenu .ponékud nižSÍ přesnosti dosažených výsledků. Obzvlášté často je takto potřeba zjistit přítomnost kyseliny askorbové a určit její obsah v tělních kapalinách, jako např. moč nebo krev, v ničhž přítomnost kyseliny askorbové ručí některá diagnosticky významná laboratorní vyěetření, jako je stanovení glukosy v moči nebo séru, hemoglobinu nebo arythrocytů v moči a podobně.

Pro věechny tyto účely je obecně nejvhodnějěí použití tzv. reagenčních proužků, v nichž věechna činidla, potřebná k průběhu barevné chemické reakce, na jejímž principu je stanovení založeno, jsou obsažena v pevném stavu v indikačním systému proužku, tj. jsou nanesena ne vhodném nasákavém nosiči. Pomocí těchto proužků je sice možné získat pouze semikvantitativní výsledky, zato je věak práce's nimi neobyčejně jednoduchá a rychlá: celé stanovení totiž spočívá v namočení proužku do vyšetřované kapaliny a odečtení výsledku dle odstínu a intenzity vzniklého zbarvení indikační'ploěky.

Prvé proužky tohoto druhu byly popsány již před řadou let například v práci F. Feigla, Spot Teste in Organic Analysis, 7. vyd., 1966, na str. 475. Představují proužek filtračního papíru, na který je nanesena amonné sůl kyseliny molybdátofosforečné a dusičnan amonný,

224 488 jehož přítomnost má zvýšit stebilitu proužků. Po namočení do kapaliny obsahující kyselinu eskorbovou se tyto proužky barví modře v důsledku redukce žluté molybdétofosforečné kyseliny na tzv. molybdenovou modř. Přes přídavek dusičnanu amonného jsou však tyto proužky znečnš nestálá, nebol se i při skladování v uzavřeném obalu barví již po několika dnech zelenavš až modře, údajně vlivem redukce kyseliny molybdátofosforečné celulosou papíru.

Nepatrně obměněné složení proužků pro stanovení kyseliny askorbové popisuje i americký patentní spis 3 771 964, který užívá ke stabilizaci dusičnan sodný nebo draselrvý v přítomnosti silné organické kyseliny, jako např. kyseliny malonová. Tyto proužky jsou sice poněkud stabilnější a použitelné i pro detekci a stanovení kyseliny askorbové v moči, nebol dík přítomnosti poměrně silné organické kyseliny není stanovení kyseliny askorbové rušeno přítomností kyseliny močové, která při vyšším pH rovněž redukuje kyselinu molybdátofosforečnou na molybdenovou modř. Nevýhodou těchto proužků je však opět skutečnost, že se nedají použít na tzv. polyfunkčních proužcích, tj. na proužcích obsahujících více indikačních plošek určených k současnému stanovení několika různých součástí, např. moče. Z indikační plošky pro stanovení kyseliny askorbové se totiž časem uvolňují z přítomného alkalického dusičnanu stopy kysličníků dusíku, které ničí ostatní indikační plošky, zejména plošky pro etanovenl glukosy, krve a pH. Vedle toho jsou ale tyto proužky i málo citlivá, nebol dovolují stanovit kyselinu eskorbovou teprve od koncentrace 300 mg/1 a více. Navíc, barevná změně těchto proužků probíhá značně pomalu, takže i s těmito poměrně vysokými koncentracemi kyseliny askorbové nabudou proužky svého konečného modrého zabarvení teprve asi po 1 min, tedy za dobu, kdy již měl být dávno znám výsledek testu na přítomnost a koncentraci kyseliny eekorbová jako složky ruěící jiné barevné testy.

Nyní však bylo zjištěno, že tyto nedostatky lze odstranit pomocí předloženého vynálezu, jehož předmětem jsou reagsnční proužky k důkazu a stanovení kyseliny askorbové v různých kapalinách a materiálech, jejichž indikační systém obsahuje kyselinu molybdátofosforečnou nebo její alkalickou s&l, kysele reagující látku a stabilizátor, vyznačená tím, že obsahují jako stabilizátor síran ceričitý nebo síran ciričito-amonný a/nebo jako kysele reagující látku kyselinu malelnovou. Je výhodná, obsahují-li proužky podle vynálezu smáčedlo, například laurylsulfát sodný, cetyltrimethylamoniumbromid nebo polyethylenglykol, a/nebo přirozenou nebo syntetickou polymerní látku, například polyvinylpyrrolidon nebo alginát sodný a/nebo indiferentní barvivo například tartrazin.

Kyselinou molybdátofosforečnou, použitou v indikačním systému proužků dle tohoto vynálezu je myšlena běžná heteropolykyselina o složení definovaném v odborná literatuře jako kyselina fosforečnano-dodekamolybdenová, HjPO^.12 MoO^.aq, nebo kyselina difosforečnano-18-molybdenové, 2 Η^ΡΟ^.,β MoO^.aq; se stejným výsledkem je však možná pro tento účel použít molybdétofosforečné kyseliny i jiného složení, které jsou popsány např. v monografii Qmelin's Handbuch der anorganiachen Chemie, 8. vyd., sv. 93 na str, 347 až 36, a která se navzájem liší - podle podmínek přípravy - různým poměrem fosforu a molybdenu a proměnlivým obsahem krystalová vody. Pro přípravu proužků dle vynálezu je pak možná použít buS jednotlivé kyseliny nebo i jejich směsi a navíc, je možná je použít s výhodou i ve formě vhodných solí, jako jsou nepříklad soli amonná, draselná, sodná nebo lithná, nebol tyto soli reaguji s kyselinou eskorbovou stejně jako volná kyseliny a vedle tohoto se dík přítomnosti kysele reagující látky v Indikačním systému proužků nebo již v impregnačním roztoku ustaví vždy taková rovnováha mezi volnou kyselinou molybdátofosforečnou a její soli, která odpovídá aktuálním podmínkám pH.

Síran ceričitý nebo ceričito-amonný obsažený v indikačním ayatému proužků chrání kyselinu molybdátofosforečnou před postupnou samovolnou redukcí na molybdenovou modř a tím dokonale stabilizuje připravená proužky po dobu mnoha mšsíců, aniž by ovšem měl výše uvedené nevýhody dosud uživených alkalických dusičnanů. Při tom lze tento stabilizátor použít v indikačním systému proužků v poměrně malých množstvích: k dosažení dokonalé stabilizace postačuje jeho přítomnost v množství 0,05 až 15 mg, s výhodou 0,5 až 5,0 mg, vztaženo na 100 mg současně přítomné molybdétofosforečné kyseliny nebo její soli.

Jak již bylo výše neznačeno je možné tento stabilizátor se stejným výsledkem použít v kombinaci s jakoukoliv molybdátofosforeínou kyselinou nebo jakoukoliv její solí; obdobně je možné tento stabilizátor· použít i za přítomnosti jakékoliv kysele reagující látky, jejímž úkolem v indikačním systému je vytvoření hodnoty pH nižší než 5,0 s výhodou pH v rozmezí 1,5 až 3,5. Ve smyslu tohoto požadavku, je tudíž v indikačním systému proužků možné použít pevnou, netěkavou a dostatečně stálou minerální nebo organickou kyselinu nebo kysele reagující sůl, jako je například již výše zmíněné kyselina malonová, nebo i kyselina jablečná, vinná, citrónové, šlavelová, kyselý síran draselný nebo kalium dihydro gencitrát nebo směs dvou nebo více těchto sloučenin, tedy látky užívané pro obdobný účel i v jiných r-eagenčních proužcích. Kyrií však bylo zjištěno, a je dalším předmětem tohoto vynálezu, že nejlepších výsledků se dosáhne, jestliže indikační systém proužků obsahuje jako kysele reagující látku kyselinu maleinovou.

Použití této kyseliny v indikačním systému reagenSnlch proužků dosud nebylo popsáno. .Důvodem j® zřejmě okolnost,, že obecně jako kyselina nevykazuje tato látka ve srovnání s jinými používanými kyselinami žádné přednosti. Překvapující však bylo zjištění, že v indikačním systému proužků chová sa současně sama kyselina askorbová jako stabilizátor a tím ještě zvyšuje stabilizační účinky jiných stabilizátorů, jako jsou například dosud užívané dusičnany nobo v tomto vynálezu popisovaný sířen ceričitý případně ceričito-aaonný. V indikačním systému proužků dle vynálezu má tudíž kyselina maleinové dvojí funkci: jako poměrně silná, kyselina vytváří v indikačním systému pH potřebné pro optimální průběh redukc kyseliny molybdátofosforečné kyselinou askorbovou a současně i pro potlačení interferencí jiných náhodných redukujících součástí vyšetřovaného materiálu, jako je například kyselina Etočová v některých tělních kapalinách,.

Tato první a základní funkce kyseliny meleinové také určuje její potřebné množství v indikačním systému piOužků, tj, množství schopné po namočení proužku do vyšetřované kapaliny vytvořit a udržet v systému pH nižší než 5,0 s výhodou v rozmezí pH 1,0 až 3,0.

Z tohoto hlediska je účelné použít kyselinu maleinovou v množství i až 30 g, s výhodou 5 až 15 g na 100 ml impregnačního roztoku, pomocí něhož je indikační systém nanášen na nasákavý nosič proužku, což představuje 1 až 20, s výhodou 2 až Bnésobak množství současně přítomné kyseliny molybdátofosforečné. Toto množství kyseliny maleinové je současně vyhovující i z hlediska její druhé funkce v indikačním systému proužků dle vynálezu, tj. funkce stabilizátoru. Jako kysele reagující látku lze věak kyselinu maleinovou použít nejen samotnou, ale i ve směsi s jinými kyselinami nebo kysala reagujícími látkami, jejichž příklady jsou uvedeny výěe. V tomto případě se pak v indikačním systému použije množství všech kysele reagujících látek v rozmezí uvedeném výše» Z hlediska stabilizační funkce kyseliny maleinové je však nutné, aby její váhové množství činilo v tomto případě nejméně 50 % hmotnostních množství současně přítomné kysaliny molybdátofosforečné.

•Je výhodné, jestliže proužky podle tohoto vynálezu obsahují v indikačním systému vedle uvedených tří základních součástí, tj. kyseliny molybdátofosforočaá, kysele reagující látky a stabilizátoru ještě také některá dalží pomocné látky, jejichž použiti v indikačním 'systému proužků pro etanoveni kyseliny askorbová sice dosud nebylo popsáno, které se věak používají obecně ke zlepšení funkčních vlastností jiných reagenčních proužků.

Jsou to zejména různá smáčedla anionaktivní, kationaktivní nebo i neionogcnní povahy, jako například laurylaulfát sodný, cetyltrinethylaminlumbromid nebo polyethylenglykol. Tyto látky zvyžují smáčivost indikační zóny proužků, usnadňuji proniknutí vyšetřované kapaliny k činidlům a tím zrychlují průběh barevné reakce.

Vedle toho však přispívají i ke zvýšení čistoty a brilance zabarvení, vzniklého při pozitivní reakci. Indikační systém může dále obsahovat β výhodou i tzv. zahužlovedla, t,j. přirozené nebo syntetické polymerní látky, jako například polyvinylpyrrolidon, alginát sodný nebo želatinu. Tato zahuělovadla celý indikační systém mírně stabilizují a vedla toho mají pozitivní vliv na egalizaci vybarvení proužků při pozitivní reakci. Dále je výhodné, jestliže indikační systém proužků dle vynálezu obsahuje ještě také vhodné Indi224488 ferentní barvivo, které koriguje barevný odstín proužků při pozitivní reakci. I když principielně lze pro tento účel použít neji-ůznější barviva, nejlépe se osvědčile žlutá barvivé jako například tartrazin, kyselina pikrová nebo fluoresceln.

Keagenční proužky k důkazu a stanovení kyseliny askorbové podle tohoto vynálezu, tj. proužky jejichž indikační syetém obsahuje kyselinu molybdátofosforečnou a síran ceričito-amonný a/nebo kyselinu maleinovou vykazují proti dosud známým proužkům nejen dokonalou stabilitu po dobu mnoha měsíců, ale i vysokou citlivost vůči kyselině askorbové a uspokojivou reakční rychlost: pomocí těchto proužků lze spolehlivě zachytit i množství okolo 30 až 50 mg/1 kyseliny askorbové například v močí, přičemž odečtení výsledku je možné provést již 15 až 20 sekund po namočení do vyšetřované kapaliny.

Přiklad 1

Impregnační roztok

A. Voda destilovaná Hydroxid sodný, vodný roztok c(NaOH) a 1,0 mel Kyselina molybdátofosforečná	40,0 ml
10,0 3,0	ml g
B, Voda destilovaná	50,0	ml
Kyselina taalonová	7,0	g
DioktylsulfojantBran sodný,
0,4% vodný roztok	10,0	ml

Roztoky A a B se připraví postupným rozpouštěním svých složek v uvedeném pořadí a navzájem se smíchají. Poté se přidá ještě:

Tartrazin, !% vodný roztok 1,5 ml

Síran ceričito-amonný,

2% vodný roztok 3,0 ml β vSe se znovu dobře promíchá.

O

Tento roztok se nanese na pruh filtračního papíru o plošné hmotnosti 180 g/m' a dokonale vysuší proudem horkého vzduchu. Vysušený papír se poté rozřeže na čtverečky 6 x 6 mm a nalepí - například pomocí oboustranné samolepicí pásky - na podložku z bílé plastické hmoty.

V moči bez kyseliny askorbové je indikační ploška těchto proužků čistě žlutá, v močích s obsahem 50, 100 200, 400 a 600 mg/1 kyseliny askorbové vykazují barevnou změnu ze zelenožluté přes žlutozelenou a čistě zelenou do temně šedomodré v závislosti na koncentraci kyseliny askorbové.

Proužky nemění tyto své vlastnosti po dobu mnoha měsíců, jsou-li uchovávány v dobře uzavřených obalech nad silikagelem nebo molekulovým sítem.

Příklad 2

Impregnační roztok se připraví stejným způsobem jako v příkladu 1, avšak v roztoku A se použije 6,0 g kyseliny molybdétofosforečné a v roztoku B se místo 7,0 g kyseliny raalonové rozpuštěné v 50 ml destilované vody použije směs 10 ml citrétového tlumiče o pH = 3,0 a 40 ml vody.

Tímto roztokem se naimpregnuje filtrační papír a zpracuje dále ne hotové proužky stejně jako v příkladu !. Připravené proůžky vykazují při dokonalé stabilitě stejné funkční vlastnosti, jako proužky připravené podle příkladu 1.

Příklad 3

Připraví se dva impregnační i*oztoky způsobem popsaným v příkladu 1 , avSak bez přídavku roztoku síranu ceričito-amonného; ve druhém impregnačním roztoku se mimoto jeStě nahradí kyselina malonová 8,0 g kyseliny maleinové, S poúžitím těchto roztoků se pak připraví proužky jako v předchozích příkladech. Bezprostředně po přípravě jsuu oba 'druhy proužků vzhledově naprosto stejné a jaou prakticky rovnocenné i z hlediska svých funkčních vlastností. Proužky s kyselinou tuleňovou, připravené s poúžitím prvého impregnačního roztoku se však již po několika dnech uchovávání začínají barvit žlutozeleně a v močích poskytují falešně vyšší výsledky; naproti tomu proužky s kyselinou maleinovou, skladované stejným způsobem, sl svou původní čistě žlutou barvu i funkční vlastnosti zachovávají nezměněny po dobu enona měsíců.

Příklad 4

Připraví se reagenční proužky dle příkladu 1, avSak .s použitím impregnačního roztoku, v němž byla kyselina malonová nanrezena B,u g kyseliny meleinové. Současně se připraví proužky přesni podle postupu uvedeného v příkladu 1 a sleduji se vlastnosti a stabilita obou druhů proužků. Bezprostředné po přípravě jsou oba druhy jak vzhledově, tak i z hlediska funkčních vlastností neproste rovnocenné, Proužky obsahující kyselinu aaloaovou při skladování po cca 12 měsících počínají mírně zelenat β jejích reakce jaou mírně falešně zvýdeny, zatímco proužky s kyselinou maleinovou po stejné době skladování vykazují naprosto nezměněné vlastnosti.

Claims (2)

1. Beagenční proužky k důkazu a stanovení kyseliny askorbové v kapalinách s mete·»· riálech, jejichž indikační systém obsahuje kyselinu molybdátofosforečnou nebo její alkalickou sůl, kysele reagující látku a stabilizátor, vyznačené tím', že obsahuji jako stabilizátor síran ceričitý nebo síran ceričito-amonqý a/nebo jako kysele reagující látku kyselinu maleinovou,

2. ReagenČní proužky podle bodu 1, vyznačené tím, že obsahují smáčedlo, například laurylsulfát, sodný, cetyltrimethylamoniumbromid nebo polyethylenglykol, a/nebo přirozenou nebo syntetickou polymerní látku například polyvinylpyrrolidon nebo alginát sodný a/nebo indiferentní barvivo, například tartrazin.