CS219189B1 - Sposob konzervácie bazídiomycéty Coprinus sp., schopnej degradácie celuló zovych substrátov - Google Patents

Description

Vynález sa týŘa spósobu konzervácie bazídio-mycéty kmeňov Corpinus sp., a jej mutantov voformě výtrusov a fragmentov hýf prí velmi nízkejvlhkosti.

Kmene bazídiomycét sa najčastejšie uchovávajúvo formě výtrusov alebo pravidelným pasážovanímkultur na vhodných živných agarových médiách.Uchováváme vo formě výtrusov je vhodné predo-všetkým na udržovánié zbierkových kmeňov. Pritomto postupe je potřebné kmene kultivovat’ zatakých podmienok, aby došlo k vytváraniu plodni-čiek, čo je technicky náročné a obyčajne vyžadujéi speciálně kultivačně postupy. Viabilita výtrusovCoprinus sp. je iba niekolko %, pričom výtrusyv tej istej plodničke sa od seba odlišujú ajgeneticky. ,

Uschováme popísaným spósobom je preto ná-ročné a nie velmi spoíahlivé, pričom pri použitítakéhoto uschovávania pracujeme v ďalšom tech-nologickom procese s materiálom geneticky znač-né heterogénnym.

Keďže mnohé mutanty získané šfachtením lenvefmi ťažko tvoria výtrusy, připadne túto schop-nost’ stratili úplné, je nutné takéto kmene uchová-vat’ ich pravidelným pasázovaním cez živné agarovémédiá a ukladať ich po vyrastení pri teplote cca+4 °C. Dochádza tak k značnému riziku, že po-stupným pasážovaním sa vlastnosti vyšfachtenýchkmeňov menia, připadne sa kultúry postupnéobohacujú takým fenotypom, pre ktorý sú použitépodmienky pasážovania optimálně. . Tieto nevýhody sú odstraněné u spósobu uscho-vávania bazídiomycéty Coprinus sp., schopnéjdegradácie celulózových substrátov podlá vynále-zu, ktorého podstatou je, že sa na skleněné guličkypriemeru 3 až 0 mm naleje roztok sladinky o hod-notě pH 6,5 v takom objeme, aby jeho hladinanepřevyšovala povrch guličiek a po sterilizácii sapóda naočkuje bazídiomycétou Coprinus sp.,a kultivuje 5 až 10 dní pri teplote 28 až 35 °C,s výhodou 32 °C. Potom sa povrch vyrastenejkultúry preleje sterilným, 3 až 5 % hmotnostnýmroztokom maltózy v množstve 2,5 ml na 10 cm2povrchu. Dalej sa mycélium mechanicky rozdrvíí a vytvořená suspenzia sa ampulkuje po 2 mli a přikryje vatovou zátkou a vkládá sa do mraziace-5 ho kúpefa na 10 až 30 minút pri teplote —50 až —70 °C a voda z kultúr sa pri tlaku 10"1 Paodsublimuje za 12 až 24 hodin a ampulovanévzorky s vysušenou kultúrou sa okamžité zataviaa uložia pri bežnej laboratómej teplote.

Postup je založený na okamžitom převedenívody, prítomnej v buňkách kultúry, do pevnejformy pri velmi nízkých teplotách tak, aby nedošlok poškodeniu membrány buňky. Potom sa voda zanízkého tlaku odstráni tak, aby nedošlo k jejpřechodu do tekutej fázy. Keďže takýmto spóso-bom sa móžu uchovávat’ aj kmene vo forměfragmentov hýf, oijdií alebo chlamydospór, vyhovu-je tento postup aj pre tie kmene, ktoré netvoriaplodničky alebo ich spolu s výtrusmi tvoria lenvelmi zriedkavo. 219189

Pre tento účel sa vypracoval kultivačný postupůktorý umožnil kultivovat’ kmene tak, aby vytváralimaximum vzdušného mycélia, čo umožňuje kulti-vácia na pevných inertných nosičoch. Ak sa vhod-ným spsobom monokolónia Coprinus sp. kultivujestaticky určitú dobu, vytvoří podhubie a množstvovzdušných hýf, připadne oidií a chlamydospór. Pomechanickom zhomogenizovaní podhubia i vlá-kien možno připravit* pódia velkosti porastenejplochy až 25 kusov konzerv takmer rovnakejkvality. Kmeňový materiál z konzervy možnobezprostredne previesť už po krátkom čase dovegetatívnej formy a kedykoívek použit’ vo výrobě.Štandardizáciou inokulačného materiálu sa naviac ivýznamné stabilizuje celý výrobný proces. Příprava konzerv kmeňov Coprinus takýmtospósobom a použitie zakonzervovaných kmeňov jeuvedené v nasledujúcich príkladoch. Příklad 1

Plodnička bazídiomycéty Coprinus sp. sa prene-sie do malej E-baňky, preleje sa 2—4 ml 5 %roztoku maltózy, ktorýobsahuje 100 mj/ml penici-línu a C a 100 μg/ml streptomycín sulfátu. Plodnič- ,ka sa mechanicky rozruší a uvolněné výtrusy safiltráciou cez tenkú vrstvu vaty zbavia fragmentovplodničiek a suspenzia výtrusov obsahu 2 ml saprenesie do tenkostennej sterilnej ampule o obje-me 20 ml. Ampule so suspenziou výtrusov sa vložiana 20 minút do mraziaceho kúpela o teplote —40až —70 °C apotom sa sublimáciou pri tlaku 10”1 Pazbavia vody. Po vysušení sa ampule okamžitézatavia. Vlhkosť obsahu sa pohybuje cca0,1-0,2%. Příklad 2

Kultivačná póda, ktoroutje 3% sladinkovýagar o pH 6,5 sa naočkuje hyfami bazídiomycétyCoprinus sp. a ponechá sa kultivovat 5 až 10 dní priteplote 28 °C. Povrch vyrastenej kultúry sa prelejesterilným 5 % roztokom maltózy o obsahu 3 ml na12 cm2 povrchu agaru a pomocou dróteného očkaalebo sklenej tyčinky sa zoškrabú vzdušné vláknfavyrastené na povrchu agaru. Připravená suspenziahýf a ich fragmentov, sa sterilným spósotíoinrozplní po 2 ml do 20 ml tenkostenných ampúl,používaných pre přípravu injekčných roztokov.Ampule sa prekryjú vatovou zátkou a vložia domraziaceho kúpefa na 10 až 20 minút pri teplote—50 až —70 °C a po zmrazení sa voda v priebehu10—20 hodin odsublimuje pri tlaku 10“1 Pa. Povysušení sa ampule okamžité zatavia a uložia prilaboratómej teplote. Příklad 3

Do 250 ml E-baňky, ktorej dno je pokrytéskleněnými guličkami priemeru 3—6 mm sa přidá ;10 ml 3 % sterilnej sladinky a po sterilizácii sa napovrchu guličiek položí agarový bloček približnejvelkosti 1 cm2 vyrastenej kultúry Coprinus sp.Kultivuje sa 5 až 7 dní pri teplote 28 až 32 °C. Kukultúre, vyrastenej po celom povrchu, sa přidá

Claims (3)

4 219189 10 ml 5 % roztoku maltózy, kultúra sa mechanickydokladné zhomogenizuje a rozplní sa po 2 ml do20 ml tenkostenných ampúl překrytých vatovouzátkou. Po bezprostrednom zmrazení počas 15 až30 min., pri —50 až —70 °C sa pri tlaku 10“1 Pakultúra zbaví vody a ampule sa za běžného tlakuzatavia. Příklad 4 Do Rouxovej ffaše o objeme 1000 ml sa vsypůskleněné guličky v takom množstve, aby pokrývalicelú plochu 200 cm2. Po přidaní 50 až 60 ml 3%roztoku sladinky o hodnotě pH 6,5 sa pódavysterilizúje a po ochladení sa naočkuje vbdnoususpenziou vlákien, připadne ich fragmentov, bazí-diomycéty Coprinuš sp. Po 7 až 10-dňovej kultivá-cii pri teplote 28—32 °C sa celý povrch tvořenýguličkami pokryje súvislou vrstvoumycélie. Přidása 40 až 60 ml 5% sterilného roztoku maltózya mechanickým pohybom sa připraví suspenzia hýfa ich fragmentov kultúry Coprinuš sp., ktorá sa po 2 ml rozplní do 20 ml tenkostenných ampúl. Popřekrytí vatovou zátkou sa obsah ampúl okamžitézmrazí počas 15 až 30 minút, pri —50 až —70 °Ca pri tlaku 10“1 Pa sa sublimáciou zbaví vody.Ampule sa zatavia pri normálnom atmosferickomtlaku. Celkom sa z jednej Rouxovej flaše připraví20 až 25 konzerv, ktoré obsahujú kultúru Coprinušsp. rovnakej kvality. Příklad 5 V Rouxových fTašiach o objeme 1000 ml sapřipraví kultúra Coprinuš sp. postupom popísanýmv příklade 4. Po ukončenéj kultivácii sa připravísuspenzia hýf a ich fragmentov, ktoré sa užuvedeným spósobom prevedú do formy lyofilizo-vaných konzerv. Zbytok hýf a ich fragmentovpřibližné 10 ml objemu, ktoré ostali zachytenémedzi nosným materiálom, sa znovu preleje steril-ným roztokom 3 % sladinky o hodnotě pH 6,5,dokladné sa obsah Rouxovej ffaše premieša a po-nechá sa opáť kultivovat’, ale kratší čas, a to 4 až PREDMET

1. Spósob konzervácie bazídiomycéty Coprinušsp., schopnéj degradácie celulózových substrátovvyznačený tým, že na skleněné guličky priemeru 3 až 6 mm sa naleje roztok sladinky o hodnotě p|í6,5 v takom objeme, aby jeho hladina nepřevyšo-vala povrch guličiek a po sterilizácii sa pócíanaočkuje bazídiomycétou Coprinuš sp. a kultivujesa 5 až 10 dní pri teplote 28 až 35 °C, s výhodou32 °C, dalej, sa povrch vyrastenej kultúry prelejesterilným 3 až 5 % hmotnostným roztokom maltó- 5 dní pri 28—32 °C. Po přidaní sterilného roztoku5%-ného roztoku maltózy sa suspenzia fragmen-tov a celých hýf kultúry Coprinuš sp. použije napřípravu lyofilizovaných konzerv alebo sa priamovyužije na přípravu vegetatívneho inokula II.stupňa. Příklad 6 Ampula, obsahujúca 2 ml lyofilizovanej kultúryCoprinuš sp., sa sterilným spósobom otvorí, přidása 2 ml kultivačného média a v priebehu 2—3 min.sa připraví suspenzia kultúry, ktorá sa sterilněpreleje do 500 ml banky, obsahujúcej 100 mlmédia nasledujúceho zloženia: glukóza 3 g, močo-vina 0,07 g, kukuřičný výluh s obsahom 50 %sušiny 1,0 g, KH2PO4 0,1 g, KC1 0,05 g MgSO40,001 g, doplní sa vpdou do 100 ml a pH sa upravína 6,5. Kultivuje sa pri 28 °C na rotačnej trepačke220 ot. min.-1 po dobu 72 až 96 hodin. Taktopřipravené inokulum sa použije na očkovaniepódy rovnakého zloženia ako pri príprave ino-kula. Získá sa 8 — 12 g sušiny s obsahom24—36 % dusíkatých látok. Výsledky sú rovnakéako pri použití nalyofilizovanej kultúry Coprinušsp. Příklad 7 Inokulom připraveným z lyofilizovanej kultúryCoprinuš sp. ako je uvedené v příklade 6 sa očkujecelulózový substrát, ktorou je slámová drž s obsa-hom 70—80 % vlhkosti, do ktorého boli přidané nahmotnost’ 1 kg nasledujúce živitny: močovina 32 g,K2HPO4 1,6 g. Substrát sa uloží do hliníkovýchalebo umelohmotových plytkých nádob velkosti100 x 120 cm v hrúbke vrstvy 4—8 cm. Po spařenísa substrát naočkuje vegetatívnym inokulom II.stupňa a to 60 až 100 ml na 1 kg substrátua ponechá sa kultivovat’ 7—12 dní pri teplote32

± 2 °C, pri relatívnej vlhkosti ovzdušia v kulti-vačnom priestore 60—98 %. Po ukončenej kulti-vácii obsahuje substrát 20 % dusíkatých látok. VYNÁLEZU žy v množstve 2,5 ml na 10 cm2 povrchu, potom samycélium mechanicky rozdrtí a vytvořená suspen-zia fragmentov hyf, oidií a chlamydospor sa ampul-ku je po 2 ml a přikryje vatovou zátkou a vkládá sado mraziaceho kúpda na 10 až 30 minút pri teplote— 50 až —70 °C a voda z kultúr sa pri tlaku 10-1 Paodsublimuje za 12 až 24 hodin a ampulovanévzorky s vysušenou kultúrou sa okamžité zataviaa uložia pri laboratorněj teplote.