CS218709B1 - Spdsob přípravy nerozpustného chromolytického proteinu - Google Patents

Abstract

Vynález sa týká spósobu přípravy nerozpustného chromolytického proteinu. Podstata vynálezu spočívá v tom, že v prvom stupni sa protein rozpustí pri teplote 15 až 25 °Cna 10 až 20 hmot. % roztok, načo sa v druhom stupni přidá sieťovací reagent s výhodou epichlórhydrín a dvojsodná sol kyseliny 8-amino-5-[-3/sulfoetylsulfonyl/anilino]-6 antrachinonsulfónovej a po rozpuštění farbiva sa reakčný roztok alkalizuje hydroxidom sodným, dobré sa zamieša a nechá reagovat’ po dobu 15 až 24 hodin pri teplote 15 až 25 °C, načo sa zosietený chromogénny gel mixuje v zriedenom metanole, neutralizuje, odfiltruje, premýva metanolom, vysuší a suchý protein sa pomelie za sucha na gufovom mlýne na částice 40 až 250 μ. Vynález má použitie v klinickej biochémii pri stanovení proteolytických enzýmov v biologických tekutinách, v priemyselnej aplikácii pri medzioperačnej kontrole kultivačných médií pri priemyslovej výrobě enzýmov.

Description

3

Vynález sa týká spósobu přípravy nerozpustné-ho chromolytického proteinu vhodného na stano-venie proteázovej enzýmovej aktivity spektrofote-metrickou metódou.

Najčastejšie používané známe metódy na stano-venie proteolytickej aktivity sú veTmi zdíhavéa málo přesné. V zásadě sú založené na tom, že sa meriamnožstvo uvolněného proteinu v priebehu proteo-lytickej hydrolýzy, ktoré sa stanovuje ako rozpust-ná frakcia v kyselině trichloroctovej M. Kunitz: J.Gen. Physiol. 30, 291 (1947), připadne pomocoupozitívnej reakcie s fenolovým reagens podláFolína [M. L. Anson: J. Gen. Physiol. 22, 79(1938)].

Metoda založená na využití chromolytickéhosubstrátu na báze kazeínu nie je bežne dostupnápre poměrně zložitú přípravu azokazeínu [S. Ber-man a spol.: Proč. Expzl. Biol. Med. 107,798—83(1961)].

Velmi citlivý chromolytický substrát možno při-pravit podlá Aut. osv. č. 194 592 založený nasieťovaní a farbení róznych typov proteinu. Vyža-duje však lyofilizáciu vyfarbeného a premytéhoproteinu, čo je poměrně náročná technologickáoperácia.

Uvádzané nedostatky rieši nová přihláška vyná-lezu, ktorá umožňuje pripraviť chromolytický ne-rozpustný sieťovaný proteinový substrát bez ko-nečnej lyofilizácie modifikovaného proteinu s vy-sokou citlivosťou pre rožne typy proteázovýchenzýmov vhodný pre spektrofotometrické stano-veni© proteolytických enzýmových aktivit.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že v prvomstupni sa protein s výhodou hovádzí sérum albu-min, ovalbumin, kazeín alebo ich zmes rozpúšťa vovodě pri teplote 15 až 25 °C na 10 až 20 % hmot.roztok, načo sa v druhom stupni přidá sieťovacíreagent s výhodou epíchlorhydrín v množstve 0,5až 5 % hmot. na hmotnost suchého proteinu a 5 až20 % hmot. farbiva s výhodou dvojsodná sofkyseliny 8-amino-5-[3/sulfoetylsulfonyl/anilino]-6-antrachinonsulfonová na hmotnost suchého pro-teinu a po rozpuštění farbiva sa reakčný roztokalkalizuje s takým množstvom 25 % hmot. rozto-kom hydroxidu sodného aby jeho výsledná kon-centrácia v reakčnom roztoku bola 0,7 až 1,2 %hmot., dobré sa zamieša anechá sa staticky reago-vat’ po dobu 15 až 24 hodin pri teplote 15 až 25 °C,načo sa zosietený chromogénny proteinový gélmixuje v zriedenom alkohole s výhodou metanolev rýchloobrátkovom mixeri, neutralizuje s kyseli-nou octovou, odfiltruje a na filtri sa premývazriedeným metanolom do bezfarebnej reakciefiltrátu, nakoniec sa premýva bezvodým metano-lom, vysuší pri teplote 60 °C a suchý protein sapomelie za sucha na gulovom mlýne na částice 40až 250 μ.

Aby sa získal proteinový gél s homgénnoudistribúciou priečnych vázieb medzi makromole-kulami proteinu ako i homogennou distribúciouviazaného farbiva v zosietenom proteínovom géle 218709 je nevyhnutné rešpektovť niektoré zvláštnosti he-terogénnych reakcií v Konkrétnem reakčnom sys-téme.

Predovšetkým je dóležité, aby protein bol dobrérozpustný vo vodě. Keď je protein rozpuštěný taksa přidá sieťovací reagent a až po dokonalompremiešaní sa přidá pevné f arbivo, ktoré sa v rozto-ku proteinu rozpúšťa pomaly. Na dobré rozpuste-nie farbiva sú potřebné 1 až 2 hodiny za intenzívne-ho miešania reakčného roztoku.

Na dostatočné zosietenie bielkoviny je potřebnéokolo 1 % sieťovacieho reagentu. Ak sa použijeváčšie množstvo sieťovacieho reagentu, tak hotovýprodukt má nižší napúčací objem a teda i nižšiucitlivost’ k proteolytickej hydrolýze.

Rovnako dóležitou operáciou přípravy chromo-lytického proteinového gélu je spolahlivé vymytienezreagovaného farbiva.

Je výhodné volné f arbivo odstraňovat’ postupnoudekantáciou váčších častíc gélu, potom gél mixovat’v rýchloobrátkovom mixéri na požadovanú velkost’častíc a zbytok farbiva vymyť na filtri najprv vodou,potom zmesou vody a alkoholu resp. acetonuv pomere 1 : 1 áž nakoniec bezvodým alkoholomalebo acetónom. Vysušený chromogénny vo voděnerozpustný protein sa pomelie na částice 50 až100 μ a je vhodný pre analytické účely stanoveniaróznych proteolytických enzýmov. Výhodou nového spósobu přípravy chromolytic-kého nerozpustného proteinového gélu je, že: — je energeticky nenáročný, pretože všetky mo-difikačné reakcie pri jeho príprave prebiehajú prilaboratórnej teplote, — umožňuje přípravu chromolytického protei-nového gélu so širokým rozsahom fyzikálnychvlastností gélu pre specifické potřeby jeho použí-vania, — hotový produkt nie je potřebné skladovať prizníženej teplote a je dostatočné stabilný pri sklado-vaní pri teplote do 30 °C, — nevyžaduje žiadne nákladné technologickéoperácie a móže sa preto vyrábať v běžnýchlaboratórnych zariadeniach,

Dalšie přednosti nového postupu sú evidentněz nasledovných príkladov, ktoré však nie sú vyčer-jpávajúce, ale len ilustrativně. Příklad 1 1 kg hovádzieho sérového lyofilizovaného albu-minu sa rozpustí v 6,25 litra destilovanej vody. Podokonalom rozpuštění proteinu sa přidá 10 mlepichlorhydrínu a mieša sa 30 minút. Potom sanaraz přidá 120 g farbiva Remazol briliant blueR (sof kyseliny 8-amino-5-[3-/sulfoetylsulfonyl/anilino]-6-antrachinonsulfonová), a mieša sa priteplote miestnosti po dobu 2 hodin. Potom sa přidáza intenzívneho miešania naraz 250 ml hydroxidusodného o konc. 25 % hmot. a miešanie pokračujeaž kým reakčný roztok nezhustne, čo trvá okolo2 až 5 minút. Po zhustnutí reakčného roztoku sazastaví miešanie a reakčná zmes sa nechá reagovat’cez noc (16 až 20 hodin) pri laboratórnej teplote,

Claims (1)

1. 4 kedy sa reakcie ukončí. Zosietený a vyfarbenýpevný protein sa mixuje v alkohole (naj výhodné j-šie v metanole) zriedenom vodou v pomere 2:1.K rozmixovanému proteinu v alkohole sa přidá 100ml konc. kyseliny octovej zriedenej dvojnásobnýmmnožstvom metanolu aby sa zneutralizoval volnýhydroxid sodný. Reakčná suspenzia sa odfiltrujea na filtri sa premýva zriedeným metanoloms vodou (1 : 1) až filtračný roztok je bezfarebný.Potom sa premýva stále koncentrovanějším meta-nólom až nakoniec bezvodým, dobré sa odsajea zosietený vyfarbený protein sa vysuší v sušiamipri teplote do 60 °C. Vysušený protein sa pomeliev gufovom mlýne a presituje cez šito 0,250 mescha nakoniec cez šito 0,04 mesch aby sa odstránilinajjemnejšie podiely. Výťažok o váhe 1030 g má velkost’ častíc medzi40 až 250 μ a obsah viazaného farbiva 9,2 % a jevysokocitlivým substrátom pre všetky typy proteá-zových enzýmov. Příklad 2 Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom, že akoprotein sa použije ovalbumín a 200 g farbivaRemazol briliant blue R a 20 ml epichlorhydrínuako sieťovacieho reagentu. Získaný protein 1040 g má obsah viazanéhofarbiva 16 % hmot. a je velmi citlivým substrátomna neutrálně a alkalické proteázy, menej citlivý nakyslé proteázy. PREDMET Spósob výroby nerozpustného chromolytickéhoproteinu vyznačujúci sa tým, že v prvom stupni saprotein s výhodou hovádzí sérum albumin, ovalbu-mín, kazeín alebo ich zmes rozpustí vo vodě priteplote 15 až 25 °Cna roztok hmotnostnej koncen-trácii 10—20 %, načo sa v druhom stupni přidásieťovací reagent s výhodou epichlorhydrínv množstve 0,5 až 5,0 % hmotnostných na hmot-nost’ suchého proteinu a 5 až 20 % hmotnostnýchfarbiva s výhodou dvojsodnej soli kyseliny 8-ami-no-5-[-3/sulfoetylsulfonyl/anilino]-6-antrachi-nonsulfónovej) na hmotnost’ suchého proteinu a porozpuštění farbiva sa reakčný roztok alkalizuje Příklad 3 218709 Postup pódia příkladu 1 s tým rozdielom, že akoprotein sa použije kazeínový hydrolyzát 1200 g,ktorý sa však zle rozpúšťa a na jeho rýchlejšierozpustenie sa najprv 1 hodinu mieša vo voděpotom sa přidá hydroxid sodný podlá příkladu1 a mieša sa 1 hodinu. Potom sa přidá 150 g farbivaRemazol briliant blue R a mieša sa 2 hodinya nakoniec sa přidá 15 ml epichlorhydrínu, mieša sa30 minút a nechá sa reagovat’ cez noc ako v příklade1. Výťažok proteinu 1050 g má obsah viazanéťiofarbiva 12 % hmot. a je rovnoměrně citlivý kuvšetkým typom proteázových enzýmov. Příklad 4 Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom, že akoprotein použijeme zmes sérového hovádzieho al-buminu, ovalbumínu v pomere 1:1a další postupje rovnaký ako v příklade 1. Výsledný zmesný chromogénny protein má vy-rovnaná citlivost’ pre všetky typy proteázovýchenzýmov. Vynález má uplatnenie predovšetkým v klinickejbiochémii pri stanovení proteolytických enzýmovv biologických tekutinách ale i v priemyselnejaplikácii pri medzioperačnej kontrole kultivačnýchmédií pri priemyslovej výrobě enzýmov. VYNÁLEZU s takým množstvom roztoku hydroxidu sodnéhoo koncentrácii 25 % hmotnostných, aby jehovýsledná koncentrácia v reakčnom roztoku bola0,7 až 1,2 % hmotnostných, dobré sa zamiešaa nechá sa staticky reagovat’ po dobu 15 až 24 hodinpri teplote 15 až 25 °C, načo sa zosietený chromo-génny gél mixuje v zriedenom metanole, neutrali-zuje sa s kyselinou octovou, odfiltruje a na filtri sapremýva zriedeným metanolom do bezfarebnejreakcie filtrátu, nakoniec sa premýva koncentrova-ným metanolom, vysuší pri teplote do 60 °Ca suchý protein sa pomelie za sucha na gufovommlýne na částice 40 až 250 μ. Cena: 2,40 Kčs Vytiskly Moravské tiskařské závody, provoz 12, Leninova 21, Olomouc