CS217930B1 - Kmen Streptomyces rimosus CCM 3506 - Google Patents

Abstract

Vynález se týká nového kmene Streptomyces rimosus CCM 3506, který transformuje 5-hydroxy-anhydrotetraoyklin na 6-deoxy- -5-hydroxytetraeyklin.

Description

Vynález se týká kmene Streptomyces rimosus CCM 3506, transformujícího 5-hydroxy-anhydrotetracyklin na 6-deoxy-5-hydroxytetracyklin (doxycyklin), při kultivaci v tekutých živných půdách, obsahujících zdroje asimilovateinšho uhlíku, např. sacharózu nebo škrob, zdroje asimilovateinšho dusíku, např. kukuřičnou máčecí vodu nebo mouku kukuřičnou, bavlníkovou či sojovou a minerální živné soli.

Zmíněný kmen umožňuje výrobu tetracyklinového antibiotika doxycyklinu biologickou cestou. Dosud běžně klinicky užívaná tetracyklinová antibiotika, tj. chlortetracyklin, tetracyklin a oxytetraeyklin, mají velmi široké uplatnění, přesto věak mají některé vlastnosti, které jejich použití brzdí. Jde např, o vyarážení ve formě nerozpustné báze, čímž poklesne absorpce, nežádoucí působení na střevní mikroflóru apod. Naproti tomu doxycyklin se rychle a úplně absorbuje, vytvoří při nižších dávkách vysokou koncentraci v krvi, je asi třikrát účinnější než dosud užívané tetracykliny.

6-deoxy-tetracykliny se dosud vyrábějí chemickou cestou (C. R. Stephens se sp·, J. Am. Chem. Soc. 80, 5324, 1958; americký patentový spis č. 3 200 149), a to postupem, který je náročný na suroviny (drahé katalyzátory), na přístrojové vybavení a na dodržování fyzikálních parametrů.

Biologický postup má své přednosti i výhody pro svoji jednoduchost. Gehetickou cestou se podařilo připravit kmen Streptomyces rimosus, schopný transformovat 5-hydroxy-enhydrotetracyklin na 6-deoxy-5-hydroxytetracyklin. Anhydrotetracykliny lze snadno získat působením silné minerální kyseliny, například chlorovodíkové, z tetracyklinů.

Ve francouzském patentovém spisu č. 2 187 301 je popsána příprava kmene Streptomyces alboflavua a lusitanua transformující anhydrotetracykliny. Jeko hlavní a podstatný znak přípravy je uvedena dokonalá dehydratace kultury.

Postup vedoucí k získání nového kmene podle vynálezu se liší rozdílným genetickým přístupem. Vychází ze znalosti biosyntézy tetracyklinů, zvláště pak z posledních dvou až čtyřech fází (P. A. Miller a sp.; Bioch. Bioph. Res. Comm. 18, 325, 1965; americký patentový spis č. 3 433 709) a zaměřuje se na blokování poslední fáze, tj. biosyntézy oxytetracykli nu, přípravou variant neprodukujících oxytetraeyklin (OTC^-). Kmeny OTC jsou z hlediska genetického dvojího typu: vzniklé bu3 zablokováním 5a,11a-dehydrogenázové aktivity a pak konečným produktem je 5a,11a-dehydro-5-hydroxytetracyklin nebo zablokováním hydrolázové aktivity (týká se hydroxylace v pozici 6) a vzniká 6-deoxy-5-hydroxytetracyklin. Tudíž ne věechny OTC“ kmeny transformují anhydrooxytetracyklin na 6-deoxy-5-hydroxytetracyklin, ale jen kmeny s porušenou hydroxylázovou a zachovanou 5a,11a-dehydrogenázovou aktivitou. Selekcí nebo mutagenním zásahem byly z kmenů OTC získány kmeny schopné transformace.

Kmen Streptomyces rimosus CCM 3506 byl připraven genetickými zásahy zaměřenými v prvé fázi na izolaci kmenů OTC a ve druhé fázi pak na kmeny schopné transformace. Výchozím kmenem byl kmen Streptomyces rimosus ATCC 10970. Pro mutagenní pokusy byly připravovány suspenze spor smytím kultury ze šikmého agaru spolurační půdy 10 ml sterilní destilované vody a třikrát promyty destilovanou vodou. Před použitím byla suspenze filtrována přes vatový filtr. 7 ml suspenze spor v Petriho misce o průměru 70 mm bylo ozařováno ze vzdálenosti 200 mm germiuidní lampou Phillips TUV 40W po dobu 30s. Během pokusu byla suspenze míchána elektromagnetickým míchadlem. V pokusech přežívalo 1.10¹ % spor. Izoláty z těchto pokusů byly vybírány podle toho, zda ztratily schopnost produkovat OTC, což se zjiělovalo sereening testem. Z kolonií izolátů byly očkovány horní plošky válečků agarové sporulační půdy a ty kultivovány v Petriho miskách o průměru 100 mm. Misky jednoho pokusu byly uloženy ve skleněných krabicích s nádobkou s vodou, aby nevysychaly, a byly inkubovány 5 dnů při 28 °C. Poté byly přeneseny na testovací misky s kmenem Bacillus subtllis 6633 citlivým na OTC. Po 18 hodinách kultivace byly vybírány kmeny bez inhibičních zon, tj. kmeny OTC.

Pro kmen Streptomyces rimosus ATCC 10970 bylo použito jako mutagenu pouze UV-záření.

Z pokusů tyl získán kmen OTC“, který se stal mateřským kmenem kmene Streptomyces rimosus CCM 3506 podle vynálezu. Z pokusů výše uvedeným testem byla zjištěna frekvence reverzi 1,5 %. Zbývající izoláty byly dále testovány screening testem»podle schopnosti transformovat 5-hydroxy-anhydro-tetracyklin na 6-deoxy-5-hydroxytetracyklin tak, že byly čárově očkovány na Petriho misky vždy jeden kmen na jednu misku a po 5denní kultivaci při 28 °C bylo do vzdálenosti 10 mm od kultury umístěno malé množství 5-hydroxy-anhydrotetracyklinu. Po dalších 20 hodinách působení při 28 °C byly misky hodnoceny podle barvy záření v ultrafialovém světle: 5-hydroxy-anhydrotetracyklin svítí citrónově žlutě, 6-deoxy-5-hydroxytetracyklin oranžově zlatě. Tímto testem byly vyloučeny kmeny netransformující.

Posledním testem bylo sledování vlastní transformace kultivací na třepačce (3,83.s^-1, výchylka 25 mm) při 26 až 38 °C, výhodně při 28 °C, ve dvou stupních. Vegetativní inokulum je kultivováno 30 hodin a jím v množství 3,3 % obj. očkována produkční fáze. Ta jo kultivována za týchž podmínek jako vegetativní inokulum. Roztok 5-hydroxy-anhydrotetracyklinu ve směsi dimetylformamidu s vodou (1:1), v koncentraci 5 až 12 g/1 lze přidat na začátku kultivace, výhodnější je však přídavek v době debře narostlé kultury. Kultivace končí kolem 120. hodiny. Přítomnost 6-deoxy-5-hydroxytetracyklinu se testuje papírovou chromatografii nebo chromatografii na tenké vrstvě, v systému kyselina citrónová - n-butanol - chloroform. Výsledky chromatografie se potvrzují autobiografií, tj. přenesením chromatogramů jednotlivých kmenů na misky s testovacím kmenem Bacillus subtilis 6633, tedy biologickou účinností. Kmen Streptomyces rimosus CCM 3506 podle vynálezu se neliší morfologicky od výchozího kmene, je však odlišný svými fyziologickými vlastnostmi, které jsou projevem genetických změn: jde o neschopnost biosyntetizovat oxytetracyklin a o schopnost transformovat 5-hydroxyanhydrotetracyklin na 6-deoxy-5-hydroxytetracyklin.

Nový kmen Streptomyces rimosus byl uložen v československé sbírce mikroorganismů Univerzity J. E. Purkyně v Brně, Tř. Obránců míru 10, pod č. CCM 3506.

V následujícím příkladu provedení je ilustrována kultivace nového kmene a provedení transformace 5-hydroxyanhydrotetracyklinu na 6-deoxy-5-hydroxy-tetracyklin.

Příklad provedení

Kulturou kmene Streptomyces rimosus CCM 3506 vyrostlou na šikmém agaru sporulační půdy Medium 196 Difco se kličkou spor očkuje 30 ml živné půdy ve varné baňce o objemu 500 ml.

Tato půda mé složení:

kukuřičná máčecí voda 1,0% hm.

sacharóza 1,5 hydrogenfosforečnan amonný 0,2 dihydrogenfosforečnan draselný 0,2 síran hořečnatý krystalický 0,025 vodovodní voda do 100,0 pH před sterilizací 6,6, po sterilizaci (30 minut při 120 °C) asi 6,3. Kultivace na rotační třepačce (3,83.s^-1, výchylka 25 mm) při 28 °C trvá 30 hodin.

Získaným vegetativním inokulem se množství 3,3 % obj. očkuje 30 ml produkční půdy ve varných baňkách o objemu 500 ml tohoto složení:

kukuřičná máčecí voda 3,0 % hm.

sacharóza 1,25 chlorid vápenatý 0,95 hydrogenfosforečnan amonný 0,26 vodovodní voda do 100,0 pH před sterilizací 6,6, po sterilizaci (30 minut při 120 °C) asi 6,7.

217930 4

Po naočkování se kultivuje na rotační třepačce'(3,83.s”¹ » výchylka 25 mm) při 28 °C, za 72 hodin se přidá 1,2 ml roztoku anhydrooxytetracyklinu ve smšsi dimetylformamid - voda (1:1), obsahujícího 250 mg anhydrooxytetracyklinu v 1 ml. Po 48 hodinách sa stanoví přítomnost 6-deoxy-5-hydroxytetracyklinu papírovou chromatografií a jeho biologická účinnost autobiografií.

Antibiotikum se převede do fermentační kapaliny okyselením na pH 1. Z čirého filtrátu se izoluje z kyselého prostředí jako sůl s aromatickou sulfokyselinou nebo při neutrálním pH jako komplex se zinkem nebo vápníkem a hořčíkem. Tyto sloučeniny se pak převedou na hydrochlorid. Celkový výtěžek operace je 50 až 55 %.

Claims (1)

1. Kmen Streptomyces rimosus CCM 3506 transformující 5-hydroxy-anhydrotetraeyklin na 6-deoxy-5-hydroxytetracyklin.