CS217931B1 - Kmen Streptomyces alboflavus CCM 3505 - Google Patents

Abstract

Vynález se týká nového kmene Streptomyces alboflavus CCM 3505, který transformuje 5-hydroxy-anhydrotetracyklin na 6- -deojty-5-hydroaytetracyklin.

Description

(54) Kmen Streptomyces alboflavus CCM 3505

Vynález se týká nového kmene Streptomyces alboflavus CCM 3505, který transformuje 5-hydroxy-anhydrotetracyklin na 6-deojty-5-hydroaytetracyklin.

2,7931

Vynález ee týká kmene Streptomyces alboflavus CCM 3505, transformujícího 5-hydroxy-anhydrotetracyklin na 6-deoxy-5-hydroxytetracyklin (doxycyklin), při kultivaci v tekutých živných půdách obsahujících zdroje asimilovatelného uhlíku, například sacharózu nebo škrob, zdroje asimilovatelného dusíku, například kukuřičnou máčecí vodu nebo mouku kukuřičnou, bavlníkovou či sojovou a minerální živná soli.

Zmínšný kmen umožňuje výrobu tetracyklinového antibiotika doxycyklinu biologickou cestou. Dosud bšžnš klinicky užívaná tetracykllnová antibiotika, tj. chlortetracyklin, tetracyklin a oxytetracyklin, mají velmi široké uplatnění, přesto však mají ngkteré vlastnosti, které jejich použití brzdí. Jde např. o vysrážení ve formě nerozpustné báze, čímž poklesne absorpce, nežádoucí působení na střevní mikroflóru apod. Naproti tomu doxycyklin se rychle a úplně absorbuje, vy tvoří při nižších dávkách vysokou koncentraci v krvi, je asi třikrát účinnější než dosud užívané tetracykliny.

6-Deoxytetracykliny se dosud vyrábějí chemickou cestou (C, R. Stephens se sp., J. Am. Chem, Soc. 80, 5324, 1958; americký patentový spis č. 3 200 149) a to postupem, který je náročný na suroviny (drahé katalyzátory), na přístrojové vybavení a na dodržování fyzikálních parametrů.

Biologický postup má své přednosti i výhody pro svoji jednoduchost. Genetickou cestou se podařilo připravit kmen Streptomyces alboflavus, schopný transformovat 5-hydroxy-anhydrotetracyklin na 6-deoxy-5-hydroxytetracyklin. Anhydrotetracykliny lze snadno získat z tetracyklinů působením silné minerální kyseliny, např. chlorovodíkové.

Ve francouzském patentovém spisu č. 2 187 301 je popsána, příprava kmene transformujícího anhydrotetracykliny. Jako hlavni a podstatný znak přípravy je uvedena dokonalá dehydratace kultury. Postup vedoucí k získání nového kmene podle vynálezu se liší rozdílným genetickým přístupem. Vychází ze znalosti biosyntézy tetracyklinů, zvláště pak z posledních 3 až 4 fází (P. A. Miller se sp., Bioch. Bioph. Res. Comm. 18, 325, 1965; americký patentový spis č. 3 433 709) a zaměřuje se na blokování poslední fáze, tj. biosyntézy oxytetracyklinů, přípravou variant neprodukujících oxytetracyklin (OTC“). Kmeny OTC“ jsou z genetického hlediska dvojího typu: vzniklé bučí zablokováním 5a,11a-dehydrogenázové aktivity a pak konečným produktem je 5a,11a-dehydro-5-hydroxytetracyklin nebo zablokováním hydroxylázové aktivity (týká se hydroxylaoe v pozici 6) a vzniká 6-deoxy-5-hydroxytetracyklin. Tudíž ne všechny OTC“ kmeny transformují dehydro-oxytetraoyklin na 6-deoxy-5-hydroxytetraoyklin, ale jen kmeny s porušenou hydroxylázovou a zachovanou 5a,11a-dehydrogenázovou aktivitou. Selekcí nebo mutagenním zásahem byly z kmenů OTC” získány kmeny schopné transformace.

Kmen Streptomyces alboflavus CCM 3505 byl připraven genetickými zásahy zaměřenými v prvé fázi na izolaci kmenů OTC” a ve druhé fázi pak na kmeny schopné transformace. Výchozím kmenem byl kmen Streptomyces alboflavus ATCC 15846. Pro všechny mutagenní pokusy byly připravovány suspenze spor smytím kultury ze šikmého sporulačního agaru sporulační půdy 10 ml sterilní destilované vody a třikrát promyty pufrem podle použitého mutagenu. Před použitím byla suspenze filtrována přes vatový filtr. Suspenze spor výchozího kmene pufru o pH 6 byla vystavena působení nitrosoetylmočoviny (NEU) v koncentraci 0,1 M po dobu 60 minut, po této době přežívalo řádově 1.10® % spor. V dalším pokusu byl kmen OTC” vystaven působení N-metyl-N-nitro-N-nitrosoguanidinu v pufru o pH 8 a v koncentraci 0,01 M. Po 60 minutovém působení přežívalo řádově 1.10° % spor. Izoláty z těchto pokusů byly vybírány podle toho, zda ztratily schopnost produkovat OTC, což se zjišlovalo screening testem. Z kolonií izolátů byly očkovány horní plošky válečků agarové sporulační půdy a ty kultivovány v Petriho miskách o průměru 100 mm. Misky jednoho pokusu byly uloženy ve skleněných krabicích s nádobkou naplněnou vodou,, aby nevysychaly, a byly inkubovány 5 dnů při 28 °C. Poté byly přeneseny na testovací misky s kmenem Baeillus subtilis 6633 citlivým na OTC. Po 18 hod. kultivace byly vybírány kmeny bez inhibiěníeh zón, tj. kmeny OTC”.

Ze Streptomyces alboflavus ATCC 15846 byl vybrán kmen OTC“ ^z pokusů NEU, který se stal mateřským kmenem kmene Streptomyces alboflavus CCM 3505 podle vynálezu. Z.pokusů byla výše uvedeným testem zjištěna frekvence reverzí 3,3 %. Zbývající izoláty byly dále testovány screening testem podle schopnosti transformovat 5-hydroxy-anhydrotetracyklin na 6-deoxy-5-hydroxytetracyklin tak, že byly čárově očkovány na Petriho misky vždy 1 kmen na 1 misku a po 5denní kultivaci při 28 °G bylo do vzdálenosti 10 mm od kultury umístěno malé množství 5-hydroxy-anhydrotetracyklinu. Po dalších 20 hodinách působení při 28 °C byly misky hodnoceny podle barvy zářeni v ultrafialovém světle: 5-hydroxy-anhydrotetracyklin svítí citrónově žlutě, 6-deoxy-5-hydroxytetracyklin oranžově žlutě. Tímto testem byly vyloučeny kmeny netransformující .

Posledním testem bylo sledování vlastní transformace kultivací na třepačce (3,83.S~', výchylka 25 mm) při 26 až 38 °C, s výhodou při 28 °C, ve dvou stupních. Vegetativní inokulum je kultivováno 30 hodin a jím v množství 3,3 % obj. očkována produkční fáze. Ta je kultivována za týchž podmínek jako vegetativní inokulum. Roztok 5-hydroxy-anhydrotetracyklinu ve směsi dimetylformamidu s vodou (1:1), v koncentraci 5 až 12 g/litr lze přidat na začátku kultivace, výhodnější je však přídavek v době dobře narostlé kultury. Kultivace končí kolem 120. hod. Přítomnost 6-deoxy-5-hydroxytetracyklinu se testuje papírovou chromatografii nebo chromatografii na tenké vrstvě v systému kyselina citrónová - n-butanol - chloroform. Výsledky chromatografie se potvrzují autobiografií, tj. přenesením chromatogramů jednotlivých kmenů na misky s testovacím kmenem Bacillus subtilis 6633, tedy biologickou účinností. Kmen Streptomyces alboflavus CCM 3505 byl připraven působením N-metyl-N-nitro-N-nitrosoguanidinu na výěe uvedený mateřský kmen.

Kmen Streptomyces alboflavus CCM 3505 podle vynálezu se neliší morfologicky od výchozího kmene, je však odlišný svými fyziologickými vlastnostmi, které jsou projevem genetických změn: jde o neschopnost biosyntetizovat oxytetracyklin a o schopnost transformovat 5-hydroxy-anhydrotetracyklin na č-deoxy-5-hydroxytetracyklin.

Nový kmen Streptomyces alboflavus byl uložen v Československé sbírce mikroorganismů Univerzity J. E. Purkyně v Brně, Tř. Obránců míru 10, pod číslem CCM 3505.

V následujícím příkladu provedení je ilustrována kultivace nového kmene a provedení transformace 5-hydroxy-anhydrotetracyklinu na 6-deoxy-5-hydroxytetracyklin.

Příklad provedení

Kulturou kmene Streptomyces alboflavus CCM 3505 vyrostlou na šikmém agaru sporulační půdy XVI se kličkou spor očkuje 30 ml živné půdy ve varné baňce o objemu 500 ml.

Složení půdy XVI:

dextrin bílý pepton síran hořečnatý kryst. síran železnatý kryst. sacharoza močovina masový extrakt chlorid sodný hydrogenfosforečnan draselný agar

1,5% hm.

0,5

0,05

0,001

0,3

0,01

0,1

0,05

0,05

2,0 pH upravit pomocí NaOH (20% roztok) na 7,3, sterilizace 30 minut při 120 °C

Složení půdy pro přípravu vegetativního inokula:

kukuřičná máčecí voda 1,0 % hm, sacharóza 1,5 hydrogenfosforečnan amonný 0,2 dihydrogenfosforečnan draselný 0,2 síran hořečnatý krystalický 0,025 vodovodní voda do 100,0 pH před sterilizací 6,6, po sterilizaci (30 minut při 120 °C) asi 6,3. Kultivace na rotační třepačce (3,83.s^-1, výchylka 25 mm) při 28 °C trvá 30 hodin.

Získaným vegetativním inokulem v množství 3,3 % obj. očkuje 30 ml produkční půdy ve varných baňkách o objemu 500 ml tohoto složení:

kukuřičná máčecí voda 3,0 % hm.

secharóza 1,25 chlorid vápenatý 0,95 hydrogenfosforečnan amonný 0,26 vodovodní voda do 100,0 pH před sterilizací 6,3, po sterilizaci (30 minut při 120 °C) asi 6,7.

Po naočkování se kultivuje na rotační třepačce (3,83.s^-1, výchylka 25 mm) při 28 °C, za 72 hodin se přidá 1,2 ml roztoku anhydrooxytetracyklinu ve smčsi dimetylformamid - voda (1:1) obsahujícího 250 mg anhydrooxytetracyklinu v 1 ml. Po 48 hodinách se stanoví přítomnost 6-deoxy-5-hydroxytetracyklinu papírovou chromatografií a jeho biologická účinnost autobiografií.

Antibiotikum se přivede do fermentační kapaliny okyselením na pH 1. Z čirého filtrátu se izoluje z kyselého prostředí jako sůl a aromatickou sulfokyselinou nebo při neutrálním pH jako komplex se zinkem nebo vápníkem a hořčíkem. Tyto sloučeniny se pak převedou na hydrochlorid. Celkový výtěžek operace je 50 až 55 %.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYN Á'.,L E Z U

   Kmen Streptomyces alboflavus CCM 3505, transformující 5-hydroxy-anhydrotetracyklin na 6-deoxy-5-hydroxytetracyklin.