CS217192B1

CS217192B1 - Způsob výroby heparinu

Info

Publication number: CS217192B1
Application number: CS249960A
Authority: CS
Inventors: Zdenek Roubal; Vlastimil Pavlik
Original assignee: Zdenek Roubal; Vlastimil Pavlik
Priority date: 1960-04-13
Filing date: 1960-04-13
Publication date: 1982-12-31

Description

Vynález se týká způsobu výroby heparinu ze zvířecích orgánů, zejména z hovězích plic.

Dosud nejhospodářnšjší způsob výroby, chráněný šs. patentem č. 91 903 (v němž je také souhrnně uvedena literatura o tomto tématu) postupuje v podstatě tak, že se autolyzovaná tkáň hovězích plic extrahuje 2 až 5 hodin roztokem hydroxidu a chloridu sodného při pH 7,5 až 10,5, s výhodou při pH 8,9 až 9,1 při teplotě 50 až 55 °C, načež se teplota směsi po zvýšení na 85 až 100 °C, s výhodou na 90 °C, ihned sníží na 20 až 30 °C, směs se odstředí a filtrát se sráží kyselinou s ethanolem při pH 2,2 až 2,3, vyloučená sraženina se izoluje, po promytí ethanolem a etherem vysuší a opět extrahuje, s výhodou dvakrát, roztokem hydroxidu a chloridu sodného při pH 7,0 až 7,9 a teplotě 50 až 55 °C, načež se ze spojených extraktů po známém enzymatickém štěpení pepsiném a pankreatinem izoluje srážením kyselinou a ethanolem surový heparin.

Tímto způsobem se získá 3 000 000 až 3 750 000 m. j. surového heparinu ze 100 kg hověííoh plic.

Při propracování způsobu výroby heparinu podle čs. patentu č. 91 903 byly získány nové poznatky, které umožnily další zhospodárnění celého postupu a získání surového a tím i čistého heparinu v mnohem vyšším výtěžku.

Nový zlepšený způsob výroby heparinu ze zvířecích orgánů, zejména z hovězích plic, je předmětem vynálezu. Podstata tohoto způsobu záleží v tom, že se rozmělněná plioní tkáň podrobí nejprve proteolyse při teplotě 37 až 42 °C a pH 7,0 až 9,0, načež se proteolysát za stálého udržování pH na hodnotě 7,0 až 10,0, s výhodou 8,5 až 9,0 extrahuje roztokem chloridu a hydroxidu sodného 2 až 5 hodin při teplotě 50 až 55 °C, potom se teplota směsi po zvýšení na 85 až 100 °C, s výhodou na 90 °C, ihned sníží :.a 20 až 30 °C, směs se odstředí a filtrát po okyselení na pH 1,8 až 2,3 se sráží ethanolem nebo methanolem, vyloučená sraženina sa izoluje, po promytí ethanolem nebo methanolem a vysušení se opět extrahuje roztokem chloridu a hydroxidu sodného při pH 7,0 až 9,0 a teplotě 50 až 55 °C, načež se po ochlazení na teplotu 15 až 25 °C a odstředění izoluje z filtrátu árážením ethanolem nebo methanolem při pH 4,5 až 6,0 surový heparin.

Proteolysa rozmělněná pllcní tkáně se provede pankreatinem, s aktivitou výhodně 1:70, po dobu 16 až 20 hodin.

Výhody způsobu podle vynálezu ve srovnání se způsobem podle čs. patentu č. 91903 jsou tyto:

1. Plicní tkáň není nutno předek zbavovat tukových a chrupavkovitých součástí.

2. Proteolysa pankreatinem trvá kratší dobu (20 hodin) než původní autolysa (4 dny).

3. Proteolypa pankreatinem rozštěpí bílkovinné tkáně použité suroviny (pile) mnohem hlouběji než autolysa, takže se uvolní veškerý heparin, který lze v dalším lépe izolovat.

4. Odpadá dodatečné enzymatické štěpení komplexu heparinu s bílkovinou působením pepsinu a penkreatinu.

5. Výtěžek surového heparinu a tím i konečného čistého přípravku je téměř dvojnásobný.

6. Celý postup je kratší a i další Čištění surového heparinu až po konečný produkt je jednodušší.

Příklad provedení

100 kg hovězích plic (čerstvých nebo mražených) se jemně rozemele a smísí s 50 1 vody. Směs se vyhřeje na 38 až 40 °C, přidají se 4 1 chloroformu jako konservans a 870 g pankreatinu (s enzymatickou aktivitou např. 1:70) a pH směsi se upraví 40% vodným roztokem NaOH na hodnotu 8,5 až 9,0. Ze občasného míchání se udržuje teplota a pH směsi v uvedených mezích po dobu 16 až 20 hodin. Po skončené proteolyse se přidá 35 1 vody, kg NaCl a pH se upraví na hodnotu 8,5 až 9,0. Směs se zahřeje na 55 °C a při této teplotě se udržuje za stálého míchání 2 hodiny, potom se teplota zvýši na 90 °C (ze účelem koagulace zbytků plicní tkáně), načež se směs ihned ochladí na 20 až 30 °C a koagulovaný materiál se odstředí. Získá se asi 200 1 filtrátu, který se okyselí koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na pH 2,0 a sráží dvojnásobným objemem ethanolu. Je-li třeba, upraví se pH dalším přídavkem kyseliny chlorovodíkové na hodnotu 1,9 až 2,0. Vyloučená sraženina se oddělí, např. odstředěním nebo jiným vhodným způsobem, promyje 50 1 ethanolu a vysuší. Získá se kolem 1,5 kg komplexu heparinu s bílkovinou (substance 1).

kg popsaným způsobem získané substance I se suspendují ve 42 1 vody při 55 °C, přidají se 4 kg NaCl a pH se upraví 40% vodným roztokem NaOH na 8,0 až 8,5· Za stálého míchání se teplota a pH udržují na uvedených hodnotách po dobu 2 hodin. Největší část inaktivního materiálu se při tom nerozpustí, zatímco veškerý heparin vejde do roztoku. Suspense se potom ochladí na 20 °C a nerozpuštěný materiál se odstraní odstředěním. Filtrát se okyselí kyselinou chlorovodíkovou na pH 5,0 až 5,5 a;sráží dvojnásobným objemem ethanolu. Vyloučená sraženina ae izoluje, promyje ethanolem a vysuší. Získá se asi 150 £ surového heparinu s účinnosti okolo 30 m. j./mg, což odpovídá výtěžku 45 000 až 50 000 m.j./kg hovězích plic.

Surový heparin se dále zpracovává a čisti známým způsobem, např. frakcionací acetonem a odbarvováním, přičemž se získá čistý heparin s biologickou aktivitou 110 až ,30 m. j./mg ve výtěžku kolem 25 000 m. j./kg hovězích plic.

Místo ethanolu lze ke srážení a promývání použít se stejným účinkem i methanolu.

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

1. Způsob výroby heparinu ze zvířecích orgánů, zejména z hovězích plic, vyznačující se tím, že se rozmělněná plicní tkáň podrobí nejprve proteolyse při teplotě 37 až 42 °C a pH 7,0 až 9,0, načež se proteolysát za stálého udržování pH na hodnotě 7,0 až 10,0, s vý hodou 8,5 až 9,0, extrahuje roztokem chloridu a hydroxidu sodného 2 až 5 hodin při teplotě 50 až 55 °C, potom se teplota směsi po zvýšení.na 85 až 100 °C, s výhodou na 90 °C, ihned sníží na 20 až 30 °C, směs se odstředí a filtrát se po okyselení na pH 1,8 až 2,3 sráží ethanolem nebo methanolem, vyloučená sraženina se izoluje, po promytí ethanolem nebo metha nolem a vysušení se opět extrahuje roztokem chloridu a hydroxidu sodného při pH 7,0 až 9,0 a teplotě 50 až 55 °C, načež se po ochlazení na teplotu 15 až 25 °C a odstředění izoluje z filtrátu srážením ethanolem nebo methanolem při pH 4,5 až 6,0 surový heparin.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se proteolysa rozmělněné plicní tkáně provede pankreatinem, s aktivitou výhddně 1:70, po dobu 16 až 20 hodin.