KR0137259B1

KR0137259B1 - 구인 추출물의 제조방법

Info

Publication number: KR0137259B1
Application number: KR1019930014717A
Authority: KR
Inventors: 김철; 서정진
Original assignee: 장용택; 신풍제약주식회사
Priority date: 1993-07-30
Filing date: 1993-07-30
Publication date: 1998-04-25
Also published as: KR950002779A

Abstract

본 발명은 구인 (Lubricus rucellus)을 자기분해시키고, 그 용액을 동결과 해빙을 반복하여 분순물을 침전 시킨후, 원심분리를 행하고 얻어진 상등액을 동결건조하여 구인 추출 건조분말을 제로하는 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기의 원심분리를 행하고 얻어진 상등액을 규조토 및 제균 필터로 여과하고 동결건조하는 방법에 관한 것이다.

Description

구인 추출물의 제조방법

본 발명은 구인 추출물의 신규한 제조 방법에 관한 것이다. 더 상세하게 설명하면, 본 발명은 혈전중 또는 혈전 형성에 기인한 고혈압, 고지혈증, 동맥경화등의 치료제로서 유용한 생리활성과 안전성 및 안정성을 갖는 구인 추출물을 제조할 수 있는 개선된 방법에 관한 것이다.

구인 (Lumbricus rubellus)은 지룡 또는 지렁이라고도 칭해지고 있으며, 오래전부터 해열, 진경, 이뇨, 해독약으로 사용되어 왔다. 근래에 와서 구인의 혈전 용해 효과가 밝혀짐에 따라 그에 의한 혈전증 또는 혈전 형성에 기인한 고혈압, 고지혈증 등의 치료제로서의 이용 가능성이 대두되었고, 따라서 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

지금까지 밝혀진 구인 건조물 또는 추출물의 제조방법에 관한 선행기술로는 예를 들어, 일본국 특허공개 소 60-62965 호 (공개일 1985년 4월 11일), 일본국 특허공개 소 64-47720 호 (출원일 1987년 8월 18일), 대한민국 특허공개 제 84-1417호 (공개일 1984년 9월 26일), 제 85-8444호 (공개일 1985년 12월 18일), 대한민국 특허 공고 93-1983 (공고일 1993년 3월 20일)등이 있으며, 이들 선행기술에 기재된 방법에서는 일반적으로 구인의 이물을 제거한 후 건조시키는 방법 및 구인을 수세하여 이물을 제거한 후 균질화하여 동결건조시키는 방법이 이용되어 왔다. 그러나, 이와같은 방법에 의해서는 구인의 소화관내의 이물 및 분토를 완전히 배설시키지 못하며, 특히 구인의 표면과 장내에 존재하는 많은 미생물을 비롯한 여러 종류의 오물을 효율적으로 제거하는 것이 불가능하였다.

또한 구인을 세척후 분쇄하여 그대로 동결건조하게 되면 구인 체내에 있는 각종 불순물 및 혈구등이 완전히 제거되지 못하여 구인 추출물이 암황색의 오미와 오취가나는 분말 상태로 수득되는 단점이 있다. 더구나 이러한 동결건조 방법에 의해 제조된 구인 건조물에는 용혈성 인자인 헤모리신(hemolysin)이 그대로 잔존하기 때문에 부작용의 염려가 상당히 높다. 따라서 상기한 바와같은 종래의 추출 방법에 의해 제조한 구인 추출물들은 안전성 및 안정성이 보장되지 않을 뿐아니라 복용을 편리하게 하기 위해 액제나 기타 제형으로 제제화하는데 있어서 많은 문제점을 가지고 있었다.

이에 본 발명자는 상기 언급한 선행기술의 방법에서 제기되었던 문제점들을 해소하면서, 혈전 용해력이 높은 구인 추출물을 제조하기 위해 다양한 제조 공정 및 제조 조건을 광범위하게 연구한 결과 구인의 분쇄 방법 및 불순물 제거 공정에 관하여 신규하며 진보성이 있는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 구인 추출물을 제조하는 신규하며 개선된 방법을 제공함을 목적으로 한다. 즉, 본 발명의 목적은 구인을 자가분해(autolysis)시키고, 수득된 용액을 반복해서 동결 및 해빙시켜 불순물을 침전시켜 제거한 후, 원심분리하여 수득한 상등액을 동결건조시킴을 특징으로 하여 구인 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 방법에 의하면 구인을 자가분해시킴으로써 구인의 분해와 용혈성인자의 제거를 동시에 수행할 수 있어 제조 공정이 보다 간결해지고 효소 활성도 우수하며, 동결과 해빙을 반복하여 불순물을 침전시키고 제균 및 기타 여과를 통하여 미생물 및 각종 이물을 제거함으로써 보존성이 현저히 개선되고 복용이 용이해진 구인 추출물을 제조할 수 있다.

이러한 본 발명의 방법에 따라 제조된 구인 추출물은 기종의 제조방법에서 수득된 구인 추출물에 비해 높은 생리활성을 나타내며 용혈 성분 및 세균등이 제거되어 높은 안전성 및 우수한 저장 안정성을 갖는다.

본 발명의 제조방법에서 사용한 구인 추출물의 원료로는 천연산 구인 또는 양식 구인중의 어느것이나 사용할 수 있으며, 구인의 종류는 실질적으로 제한을 받지 않으나 바람직하게는 갯지렁이과 또는 붉은 지렁이과에 속하는 것을 주로 사용한다.

본 발명의 방법에 따르면 구인 원료를 그대로 사용할 수도 있으나, 천연 구인의 표피에는 분토 및 모래등이 많이 붙어있으므로 물로 세척하여 사용하는 것이 바람직하다. 또한 통상의 어패류 세척 방법에 따라 유기산, 무기산 또는 이들의 염의 수용액으로 세척하거나, 그 중에 일정시간 담그어 분토를 배설시키고 또는 담수로 세척한 구인을 사용할 수도 있다.

세정된 구인은 물과 혼합하여 호모 믹서로 분쇄하여 자가 분해시키거나, 그대로 자가분해시킨다. 이 때 구인과 물의 비율은 부피의 증가로 인한 동결건조시의 어려움을 고려하여 1 : 1 내지 1 : 2 가 적합하며, 온도는 자가분해가 활발하게 진행하는 30내지 60℃, 특히는 30 내지 50℃가 바람직하다. 이렇게 함으로써 자가분해와 동시에 용혈성인자(homolysin)의 불활성화가 일어나게 된다. 그런데 용혈성인자는 비교적 고온에서 불활성화되므로 자가분해를 30내지 40℃정도의 저온에서 수행하는 경우에는 추가로 다시 50℃ 내지 60℃의 온도에서 더 처리하여 용혈성 인자를 완전히 불활성화시키는 것이 바람직하다. 60℃ 보다 고온에서는 효소활성이 감소되므로 바람직하지 않다. 자가분해 시간은 온도와 시간과의 상관관계를 고려하여 3 시간 내지 20 시간, 특히 5 내지 10 시간이 바람직하다.

호모믹서 등에 의한 물리적 분쇄를 행하지 않고 자가분해시키는 경우에는, 필요에 따라 구인 1㎏에 대해 Ca²⁺이온을 10mM 내지 200mM 의 양으로 첨가함으로써 자가분해를 촉진시켜 분해공정을 단축시킬 수 있다.

이러한 목적에 적합한 Ca²⁺이온 공급원으로는 예를들어 염화칼슘, 인산칼슘 등과 같이 효소에 대한 안정화제나 활성화제로서 칼슘이온을 제공할 수 있는 칼슘염이라면 어느것이나 가능하다. 이렇게 하여 얻어진 구인 분해물을 급속히 동결 및 해빙하는 과정을 수회 반복하여 수행한다. 이러한 급속동결 및 해빙과정에 의해 구인 분해물내에 혼재되어 있던 혈구 및 불순물들이 침전된다. 이러한 목적으로 동결 및 해빙과정의 수행시에는 바람직하게는 동결은 0 내지 -20℃의 온도로 수행하며 해빙은 실온으로 상승시킴으로써 수행된다.

이러한 과정은 바람직하게는 2 내지 5회, 특히는 2회 반복 수행한다. 이렇게 하여 처리된 구인 분해물을 정치시켜 침전물을 제거하고 상등액만을 분리한다.

분리된 상등액을 원심분리하고 여과 과정을 거쳐 구인 추출물을 수득한다.

이때 원심분리는 4000 내지 5000 rpm 으로 30분 내지 2 시간 수행하는 것이 바람직하다.

이 액은 제균 여과나 기타 여과가 가능하여 세균들을 제거시켜 액제화시킬 수 있는 장점이 있다. 여과 공정은 제균 여과나 기타 미세한 불순물을 제거할 수 있는 어느 여과 방법에 의해서도 수행할 수 있으며, 예를 들면 규조토 여과, 멤브레인 필터 여과 또는 이들의 병용도 가능하다. 멤브레인 필터 여과의 경우 약 0.45㎛의 공극 크기의 것을 사용하여 무균적인 추출액을 얻을 수 있다.

이렇게 수득된 액상의 구인 추출물을 냉동 진공 건조시킴으로써 분말화한다. 냉동 진공 건조단계는 액상의 구인 추출몰을 동결 건조기에 넣어 50℃내지 20℃, 바람직하게는 30℃에서 완전히 동결시킨후 0.1내지 0.2㎜Hg 진공하에서 12내지 20시간 건조시키고, 계속해서 0℃에서 10내지 15시간, 20℃에서 5내지 12시간 건조시킨 다음 최종적을 30℃내지 40℃에서 5내지 10시간 동안 건조시켜 수행할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 구인 추출몰의 성상은 미황색을 띠며 기존의 방법에 의하여 제조된 건조 분말에 비하여 용해성이 높고 구인 특유의 오미와 오취가 제거됨으로써 제제화시 기타 제형 변경이 가능한 구인 추출물이다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 구인 추출몰은 약제학적 분야에서 공지된 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 보조제, 예를들면 유당, 백당, 만니톨, 인산칼슘, 미결정 셀롤로스등과 같은 부형제, 아라비아 고무, 젤라틴, 소르비톨, 포도당, 트라가칸트, 히드록시프로필셀롤로스, 히드록시프로폭시메틸셀롤로스, 알긴산나트륨등과 같은 결합제, 감자전분, 계면활성제등을 함유한 전분과 같은 붕해제, 탈크, 스테아린산, 경화유, 스테아린산마그네슘, 산화규소, 폴리에틸렌글리콜 등과 같은 활탁제, 구연산나트륨, 규산, 글리세린 지방산 에스테르, α사이클로덱스트린, 폴리소르페이트 80등과 같은 안정화제 및 소르빈산칼륨, 파라옥시안식향산메틸 등과 같은 보존제 등을 사용하여 산제(분제), 정제, 과립제 , 당의정, 캡슐제등 통상의 약제학적 고형제제 형태로 제형화시킬 수 있다.

본 발명의 제조 방법에 따르면, 혈전 용해 효소의 작용이 우수하면서도 용혈성 인자가 제거되고, 안정성 및 저장성이 좋은 구인 추출물을 효율적으로 제조할 수 있다.

본 발명의 다음 제조 실시예 및 실험예에 의해 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이들에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

실시예 1.

물로 세척한 구인(Lumbricus rubellus) 1㎏을 200mM CaCl₂를 함유하는 수용액 1ℓ에 넣어 30내지 40℃ 사이에서 8시간동안 천천히 교반하면서 완전히 자가 수용액 1ℓ에 넣어 30내지 40℃사이에서 8시간 동안 천천히 교반하면서 완전히 자가 분해 시킨다. 완전히 자가분해가 끝난후 60℃에서 30분 가온 처리한다. 수득한 용액을 0℃까지 급속 냉각시킴으로써 동결시키고, 20℃에서 하루동안 방치한후, 다시 온도를 실온으로 상승시킴으로써 해빙시키는 과정을 2회 반복한다. 층이 분리된 후에 상등액을 회수하여 5000rpm에서 1시간 동안 원심분리를 행한다. 상등액을 규조토 여과와 0.45㎛ 멤브레인 필터 여과를 연속적으로 행하여 무균적인 추출액을 얻고, 이 액을 동결 건조기에서 30∼40℃로 동결시킨 다음 0.2㎜Hg 진공하에서 20시간동안 건조시키고, 0℃에서 15시간, 20℃에서 12시간 및 최종적으로 35℃에서 5시간동안 건조시켜 구인 건조분말을 95g을 수득한다.

실시예 2.

물로 세척한 구인(Lumbricus rubellus) 1㎏을 증류수 1ℓ에 넣어 50℃에서 10시간동안 자가분해시켜 추출한 후, 수득한 용액을 0℃까지 급속 냉각시킴으로써 동결 시키고 20℃에서 하루동안 방치한후 다시 온도를 실온으로 상승시켜 해빙시키는 과정을 2회 반복한후 원심분리를 행한다. 상등액을 규조토 여과와 0.45㎛ 멤브레인 필터 여과를 연속적으로 행하여 무균적인 추출액을 얻고 이 액을 동결 건조기에서 30∼40℃로 동결한 다음 0.2㎜Hg, 진공하에서 20시간, 0℃에서 15시간, 20℃에서

실시예 3.

물로 세척한 구인(Lumbricus rubellus) 생체 1㎏을 증류수 1ℓ에 넣어 호모믹서로 습식분쇄후 온도를 50℃로 일정하게 유지시키면서 5시간 자가분해 시킨다.

수득한 용액을 0℃까지 급속 냉각시킴으로써 동결시킨 다음 20℃에서 하루정도 방치한 후 다시 온도를 실온으로 상승시켜 해빙하는 과정을 2회 반복한후 층 분리가 되면 상등액만을 회수하여 5000rpm에서 1시간 원심분리를 행한다. 원심분리된 상등액을 규조토 여과와 0.45㎛ 멤브레인 필터 여과를 연속적으로 행하여 무균적인 추출액을 만든다. 이액을 30℃로 동결한 다음 0.2㎜Hg 진공하에서 20시간 0℃에서 15시간, 20℃에서 12시간 및 최종적으로 35℃에서 5시간동안 건조시켜 구인 건조분말 100.5g을 수득한다.

비교예

물로 세척한 구인(Lumbricus rubellus) 생체 1㎏을 1.50g의 인산 2수소 칼슘을 용해시킨 시트르산 수용액(PH 5.8) 2.5ℓ에 넣어 15℃에서 8시간 동안 방치하여 구인의 소화관내의 분토를 배설시킨다. 그 후 구인을 분리하여 다시 물로 2회여 구인의 소화관내의 배설시킨다. 그 후 구인을 분리하여 다시 물로 2회 세척하고 호모믹서로 습식분쇄후 분쇄물을 동결건조기에 넣어 30℃에서 동결시킨후, 0.2㎜Hg 진공하에서 12시간, 0℃에서 15시간, 20℃에서 12시간 및 최종적으로 35℃에서 5시간 동안 건조시켜 구인 건조분말 120g을 습득한다.

실험예 1 : 혈전용해 실험

로빈(K.C. Robbin)과 수마리아(L.Summaria)의 카제인 분해법 및 아스터브(Asturb)와 뮬러즈(Mullerts)의 표준 피브린 평판법[Arch. Biochem. Biophys., Vol 40, pp. 346531(1952)]에 따른 본 발명의 방법으로 수득한 구인 추출물의 인체 혈액중에서의 혈전 용해 활성을 측정하였다.

시료로는 실시예 1내지 3에서 수득된 구인 건조분말 및 대조용으로는 비교예에서 수득된 구인 건조분말 각 30㎎씩을 생리식염수 1㎖에 용해시키고, 30℃에서 2시간동안 교반한후, 15000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 사용하였다.

본 실험에서의 혈전 용해 시험 결과는 표1에서와 같다.

[표 1]. 혈전용해 시험

실시예 2 : 용혈 시험

본 시험에서는 실시예 1, 2, 3에서 얻어진 구인 건조분말 및 대조용으로 비교예에서 얻어진 건조분말 각 150㎎씩을 생리 식염수 1㎖에 용해시켜 37℃에서 4시간 동안 추출한 후, 15,000rpm에서 10 동안 원심분리하여 분리된 상등액을 시료로서 사용하였다. 체중 약 3.5㎏의 성숙한 토끼 귀정맥으로부터 혈액을 채취하여 탈 섬유소 처리를 행항후, 섬유소가 제거된 혈액을 인산염 생리식염수로 300배 희석, 표준 혈액을 제조하여 시험관에 표준 혈액 5㎖씩 넣고 각 시료 100ℓ씩을 가하여 30분 후에 혈구계(hemocytometer)를 사용하여 현미경을 사용하여 반응액중의 적혈구 수를 측정하였다. 그 결과는 다음 표2와 같다.

표2. 용혈시험

(주) 양성 : 적혈구가 존재하지 않음을 의미(완전 용혈)

음성 : 적혈구 존재(용혈성인자 제거)

상기 실험의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 공지의 방법에 따라 제조된 구인 건조 분말은 상당한 용혈 현상을 나타낸 반면 본 발명에 따라 제조된 구인 건조분말은 용혈현상을 거의 나타내지 않았다.

실험예 3 : 무균시험

구인 추출 건조분말의 생균수 (주로 세균) 측정은 시료 1.0g을 멸균 증류수 10㎖에 녹여 영양 한천 배지에 도말하여 37℃에서 48시간 배양후 나타난 콜로니수를 측정하였다. (표3)

[표 3]. 무균 시험

상기 실험 1, 2 및 3의 결과로부터, 본 발명에 따라 제조된 구인 건조분말은 용혈 현상으로 인한 심각한 부작용없이 탁월한 혈전 용해 효과를 나타내며, 또한 무균 상태이기 때문에 보존성이 현저하게 개선되었음을 알 수 있다.

Claims

a) 구인(Lumbricus rubellus)에 Ca²⁺이온을 첨가하여 30내지 40℃에서 3내지 20시간 동안 자가분해시킨 후, 연속하여 50내지 60℃로 열처리하고, b) 그 용액을 동결과 해빙을 반복하여 불순물을 침전시킨 후, c) 원심분리하여 얻어진 상등액을 동결건조시킴을 특징으로 하여 구인추출 건조분말을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 구인을 5내지 10시간 동안 자가분해시키는 방법.
제1항에 있어서, Ca²⁺이온의 농도를 10mM 내지 200mM로 하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 b)에서 동결은 0℃내지 20℃에서, 해빙은 실온에서 2내지 5회 반복 수행하는 방법.