CS217192B1

CS217192B1 - Method of making the heparine

Info

Publication number: CS217192B1
Application number: CS249960A
Authority: CS
Inventors: Zdenek Roubal; Vlastimil Pavlik
Original assignee: Zdenek Roubal; Vlastimil Pavlik
Priority date: 1960-04-13
Filing date: 1960-04-13
Publication date: 1982-12-31

Description

Vynález se týká způsobu výroby heparinu ze zvířecích orgánů, zejména z hovězích plic.The invention relates to a method for producing heparin from animal organs, in particular from bovine lungs.

Dosud nejhospodářnšjší způsob výroby, chráněný šs. patentem č. 91 903 (v němž je také souhrnně uvedena literatura o tomto tématu) postupuje v podstatě tak, že se autolyzovaná tkáň hovězích plic extrahuje 2 až 5 hodin roztokem hydroxidu a chloridu sodného při pH 7,5 až 10,5, s výhodou při pH 8,9 až 9,1 při teplotě 50 až 55 °C, načež se teplota směsi po zvýšení na 85 až 100 °C, s výhodou na 90 °C, ihned sníží na 20 až 30 °C, směs se odstředí a filtrát se sráží kyselinou s ethanolem při pH 2,2 až 2,3, vyloučená sraženina se izoluje, po promytí ethanolem a etherem vysuší a opět extrahuje, s výhodou dvakrát, roztokem hydroxidu a chloridu sodného při pH 7,0 až 7,9 a teplotě 50 až 55 °C, načež se ze spojených extraktů po známém enzymatickém štěpení pepsiném a pankreatinem izoluje srážením kyselinou a ethanolem surový heparin.So far the most economical method of production, protected by SS. U.S. Patent No. 91,903 (which is also summarized in the literature) essentially proceeds by extracting autolysed bovine tissue for 2 to 5 hours with a solution of sodium hydroxide and sodium chloride at a pH of 7.5 to 10.5, preferably at a pH of 8.9 to 9.1 at a temperature of 50 to 55 ° C, after which the temperature of the mixture, after increasing to 85 to 100 ° C, preferably to 90 ° C, is immediately lowered to 20 to 30 ° C, centrifuged and the filtrate is precipitated with an acid with ethanol at pH 2.2 to 2.3, the precipitate formed is isolated, after washing with ethanol and ether, dried and again extracted, preferably twice, with a solution of sodium hydroxide and chloride at pH 7.0 to 7.9 and 50 DEG-55 DEG C., then crude heparin is isolated from the combined extracts after the known enzymatic cleavage of pepsin and pancreatin by acid and ethanol precipitation.

Tímto způsobem se získá 3 000 000 až 3 750 000 m. j. surového heparinu ze 100 kg hověííoh plic.In this way, 3,000,000 to 3,750,000 IU of crude heparin are obtained from 100 kg of bovine lung.

Při propracování způsobu výroby heparinu podle čs. patentu č. 91 903 byly získány nové poznatky, které umožnily další zhospodárnění celého postupu a získání surového a tím i čistého heparinu v mnohem vyšším výtěžku.In the elaboration of the method of production of heparin according to the art. No. 91,903, new findings have been obtained which have made the whole process more economical and yielded crude and thus pure heparin in a much higher yield.

Nový zlepšený způsob výroby heparinu ze zvířecích orgánů, zejména z hovězích plic, je předmětem vynálezu. Podstata tohoto způsobu záleží v tom, že se rozmělněná plioní tkáň podrobí nejprve proteolyse při teplotě 37 až 42 °C a pH 7,0 až 9,0, načež se proteolysát za stálého udržování pH na hodnotě 7,0 až 10,0, s výhodou 8,5 až 9,0 extrahuje roztokem chloridu a hydroxidu sodného 2 až 5 hodin při teplotě 50 až 55 °C, potom se teplota směsi po zvýšení na 85 až 100 °C, s výhodou na 90 °C, ihned sníží :.a 20 až 30 °C, směs se odstředí a filtrát po okyselení na pH 1,8 až 2,3 se sráží ethanolem nebo methanolem, vyloučená sraženina sa izoluje, po promytí ethanolem nebo methanolem a vysušení se opět extrahuje roztokem chloridu a hydroxidu sodného při pH 7,0 až 9,0 a teplotě 50 až 55 °C, načež se po ochlazení na teplotu 15 až 25 °C a odstředění izoluje z filtrátu árážením ethanolem nebo methanolem při pH 4,5 až 6,0 surový heparin.A new improved method of producing heparin from animal organs, in particular bovine lungs, is an object of the invention. The essence of this method is that the milled plion tissue is first subjected to proteolysis at a temperature of 37-42 ° C and a pH of 7.0-9.0, followed by proteolysate while maintaining a pH of 7.0-10.0. preferably 8.5 to 9.0 is extracted with a solution of sodium chloride and sodium hydroxide for 2 to 5 hours at a temperature of 50 to 55 ° C, then the temperature of the mixture is increased immediately after increasing to 85 to 100 ° C, preferably to 90 ° C:. and 20-30 ° C, centrifuged and acidified to pH 1.8-2.3 with ethanol or methanol, the precipitate was collected, washed with ethanol or methanol and dried again with sodium chloride and sodium hydroxide solution pH 7.0-9.0 and 50-55 ° C, then, after cooling to 15-25 ° C and centrifugation, crude heparin is isolated from the filtrate by precipitation with ethanol or methanol at pH 4.5-6.0.

Proteolysa rozmělněná pllcní tkáně se provede pankreatinem, s aktivitou výhodně 1:70, po dobu 16 až 20 hodin.Proteolysis of the pulverized lung tissue is performed with pancreatin, with an activity of preferably 1:70, for 16 to 20 hours.

Výhody způsobu podle vynálezu ve srovnání se způsobem podle čs. patentu č. 91903 jsou tyto:Advantages of the method according to the invention compared to the method according to U.S. Pat. No. 91903 are as follows:

1. Plicní tkáň není nutno předek zbavovat tukových a chrupavkovitých součástí.1. The lung tissue does not need to be rid of the ancestral fat and cartilage components.

2. Proteolysa pankreatinem trvá kratší dobu (20 hodin) než původní autolysa (4 dny).2. Proteolysis of pancreatin lasts less than 20 hours than the original autolysis (4 days).

3. Proteolypa pankreatinem rozštěpí bílkovinné tkáně použité suroviny (pile) mnohem hlouběji než autolysa, takže se uvolní veškerý heparin, který lze v dalším lépe izolovat.3. Proteolypa pancreatin cleaves protein tissues of the raw material used (pile) much deeper than autolysis, so that all heparin is released, which can be better isolated in the next.

4. Odpadá dodatečné enzymatické štěpení komplexu heparinu s bílkovinou působením pepsinu a penkreatinu.4. There is no additional enzymatic cleavage of the heparin-protein complex by the action of pepsin and pencreatin.

5. Výtěžek surového heparinu a tím i konečného čistého přípravku je téměř dvojnásobný.5. The yield of crude heparin and hence of the final pure preparation is almost twice as high.

6. Celý postup je kratší a i další Čištění surového heparinu až po konečný produkt je jednodušší.6. The whole procedure is shorter and further purification of crude heparin up to the final product is easier.

Příklad provedeníExemplary embodiment

100 kg hovězích plic (čerstvých nebo mražených) se jemně rozemele a smísí s 50 1 vody. Směs se vyhřeje na 38 až 40 °C, přidají se 4 1 chloroformu jako konservans a 870 g pankreatinu (s enzymatickou aktivitou např. 1:70) a pH směsi se upraví 40% vodným roztokem NaOH na hodnotu 8,5 až 9,0. Ze občasného míchání se udržuje teplota a pH směsi v uvedených mezích po dobu 16 až 20 hodin. Po skončené proteolyse se přidá 35 1 vody, kg NaCl a pH se upraví na hodnotu 8,5 až 9,0. Směs se zahřeje na 55 °C a při této teplotě se udržuje za stálého míchání 2 hodiny, potom se teplota zvýši na 90 °C (ze účelem koagulace zbytků plicní tkáně), načež se směs ihned ochladí na 20 až 30 °C a koagulovaný materiál se odstředí. Získá se asi 200 1 filtrátu, který se okyselí koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na pH 2,0 a sráží dvojnásobným objemem ethanolu. Je-li třeba, upraví se pH dalším přídavkem kyseliny chlorovodíkové na hodnotu 1,9 až 2,0. Vyloučená sraženina se oddělí, např. odstředěním nebo jiným vhodným způsobem, promyje 50 1 ethanolu a vysuší. Získá se kolem 1,5 kg komplexu heparinu s bílkovinou (substance 1).100 kg of bovine lungs (fresh or frozen) are ground finely and mixed with 50 l of water. The mixture is heated to 38-40 ° C, 4 L of chloroform as a preservative and 870 g of pancreatin (with an enzymatic activity of eg 1:70) are added and the pH of the mixture is adjusted to 8.5-9.0 with 40% aqueous NaOH. . From occasional stirring, the temperature and pH of the mixture are kept within these limits for 16-20 hours. After complete proteolysis, 35 L of water, kg of NaCl were added and the pH adjusted to 8.5-9.0. The mixture is heated to 55 ° C and maintained at this temperature with stirring for 2 hours, then the temperature is raised to 90 ° C (to coagulate lung tissue residues), whereupon the mixture is immediately cooled to 20-30 ° C and coagulated material. is centrifuged. About 200 L of filtrate is obtained, which is acidified to pH 2.0 with concentrated hydrochloric acid and precipitated with twice the volume of ethanol. If necessary, the pH is adjusted to 1.9 to 2.0 by further addition of hydrochloric acid. The precipitate formed is collected, for example by centrifugation or other suitable means, washed with 50 l of ethanol and dried. About 1.5 kg of heparin-protein complex (substance 1) are obtained.

kg popsaným způsobem získané substance I se suspendují ve 42 1 vody při 55 °C, přidají se 4 kg NaCl a pH se upraví 40% vodným roztokem NaOH na 8,0 až 8,5· Za stálého míchání se teplota a pH udržují na uvedených hodnotách po dobu 2 hodin. Největší část inaktivního materiálu se při tom nerozpustí, zatímco veškerý heparin vejde do roztoku. Suspense se potom ochladí na 20 °C a nerozpuštěný materiál se odstraní odstředěním. Filtrát se okyselí kyselinou chlorovodíkovou na pH 5,0 až 5,5 a;sráží dvojnásobným objemem ethanolu. Vyloučená sraženina ae izoluje, promyje ethanolem a vysuší. Získá se asi 150 £ surového heparinu s účinnosti okolo 30 m. j./mg, což odpovídá výtěžku 45 000 až 50 000 m.j./kg hovězích plic.kg of substance I as described above are suspended in 42 l of water at 55 ° C, 4 kg of NaCl are added and the pH is adjusted to 8.0-8.5 with a 40% aqueous NaOH solution. values for 2 hours. The bulk of the inactive material does not dissolve while all heparin enters the solution. The suspension is then cooled to 20 ° C and the undissolved material is removed by centrifugation. The filtrate was acidified to pH 5.0-5.5 with hydrochloric acid and precipitated with twice the volume of ethanol. The precipitate formed is collected, washed with ethanol and dried. About 150 .mu.l of crude heparin is obtained with an efficacy of about 30 IU / mg, which corresponds to a yield of 45,000 to 50,000 IU / kg of bovine lung.

Surový heparin se dále zpracovává a čisti známým způsobem, např. frakcionací acetonem a odbarvováním, přičemž se získá čistý heparin s biologickou aktivitou 110 až ,30 m. j./mg ve výtěžku kolem 25 000 m. j./kg hovězích plic.Crude heparin is further processed and purified in a known manner, for example by acetone fractionation and decolourisation, to give pure heparin with a biological activity of 110 to 30 mU / mg in a yield of about 25,000 mU / kg of bovine lung.

Místo ethanolu lze ke srážení a promývání použít se stejným účinkem i methanolu.Instead of ethanol, methanol can be used with the same effect for precipitation and washing.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

A method for producing heparin from animal organs, in particular bovine lungs, characterized in that the pulverized lung tissue is first subjected to proteolysis at a temperature of 37 to 42 ° C and a pH of 7.0 to 9.0, followed by proteolysate while maintaining pH at 7.0 to 10.0, preferably 8.5 to 9.0, is extracted with a solution of sodium chloride and sodium hydroxide for 2 to 5 hours at 50 to 55 ° C, then the temperature of the mixture is increased to 85 to 100 ° C, preferably to 90 ° C, immediately reduced to 20 to 30 ° C, centrifuged and the filtrate is acidified to pH 1.8 to 2.3 with ethanol or methanol, the precipitate formed is isolated after washing with ethanol or methanol and dried again extracted with chloride and sodium hydroxide solution at pH 7.0 to 9.0 and 50 to 55 ° C, after cooling to 15 to 25 ° C and centrifugation isolated from the filtrate by precipitation with ethanol or methanol at pH 4.5 to 6.0 crude heparin.

2. The method of claim 1, wherein the proteolysis of the pulverized lung tissue is performed with pancreatin, preferably 1:70, for 16-20 hours.