CS212246B2 - Způsob přípravy tetradekapeptidu - Google Patents

Abstract

Vynález se týká způsobu přípravy tetradekapeptidu vzorce I H-D-Val-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Aen-L-Phe-L-Phe- -L-Trp-L-Lys”L”Thr~Ij-Phe-L-"Thr-L"Ser-L-Cyspůsobením fluorovodíku na derivát obecného vzorce II R-D-Val-Gly-L-Cys(R1)-L~Lys(Rg)-L-Asn-L- -Phe-L-Phe-L- Trp(R5) -L-Lya (R2) -L-Thr(B-j) -L- -Phe-L-Thr(Rj)-L-Ser(R^)-L-Cyβ(R,)-X (II), kde R, R., R?) R,, a R. jsou ochranné skupiny, R5 j * je vodík nebo formyl5 skupina a X představuje skupinu vzorce pryskyřice kde je pryskyřicí polystyren. Sloučenina vzorce I je analogem somatostatinu.

Description

Somatostatin (rovněž známý jako inhibiční faktor uvolňování somatotropinu) je tetradekapeptid vzorce

L-Ala-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-Lys-L-Thr-Li-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH.

Tento tetradekapeptid byl izolován z extraktů hypothelamu ovci a zjistilo se, že je úěinný při inhibiči sěkrece růstového hormonu, rovněž známého jako somatotropin /viz P. Brazeau, W. Vale, R. Burgus, N. Ling, M. Butcher, J. River a R. Guillemin, Science, 179. 77 (1973)/.

Kromě toho patent USA S. 3 904 594 uvédí přírodní somatostatin a generickou třídu jiných sloučenin s dodekapeptldovou sekvencí, odpovídající polohám 3 až 14 přírodního hormonu.

Sloučenina účelně označovaná jako D-Ala’-somatostatin byla kromě toho popsána v práci Ferlend a dalěí, Molecular and Cellular Endocrinology, 4, 79 až 88 (1976). D-Ala’-somatostatin, ačkoli je strukturně stereo!somerem přírodního L-Ale’-somatostatinu, je přibližně polovičně účinný ve srovnání s přírodním somatostatinem při in vivo inhibicl sekrece žaludeční kyseliny. Sloučenina podle vynálezu, D-Val’-somatostatin, se liší od D-Ala’-somatostatinu substitucí dvou vodíkových atomů methylskuplnami, Při úvahách o potenciální fermakologické účinnosti D-Val’-somatostatinu by se mělo dojít k závěru, že jeho účinnost by měla být podobná jako účinnost D-Ala’-somatostatinu. Teoreticky by tedy bylo možno předpokládat, že D-Val’-somatostatin bude méně účinný než přírodní hormon, jako in vlvo inhibitor sekrece žaludeční kyseliny. D-Val’-somatostatin má věak účinnost poněkud vyšší, než ja účinnost přírodního hormonu. Tento výsledek ukazuje, že účinnost D-Val’-somatostatinu nebylo možno předpokládat na základě srovnání se strukturně podobnými známými sloučeninami.

Předmětem vynálezu je způsob přípravy tetradekapeptidu vzorce I,

H-D-Val-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH (I) který se provádí tak, že se na sloučeninu obecného vzorce 11,

R-D-Val-Gly-L-Cys(R, ) -L-Lys(Rg) -L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp(R₅) -L-Lys (Rg) -L-Thr (H-j) -L-Phe-L-Thr(R₃)-L-Ser(R₄)-L-Cys(R₁ )-X _(I; kde představuje

R ochrannou skupinu alfa-sminoskupiny,

R₁ ochrannou skupinu thioskupiny,

Rg ochrannou skupinu epsílon-aminoskupiny, každý ze symbolů

Rj a R₄ ochrannou skupinu hydroxyskupiny,

Rj vodík nebo formylskupinu a

X skupinu vzorce pryskyřice kde pryskyřicí je polystyren, působí fluorovodíkem.

Jako příklad výchozí látky obecného vzorce II lze uvést sloučeninu vzorce N-(BOC)-D-Vel-Gly-L-(PMB)Cys-L-(CBzOC)-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-(For)Trp-L-(CBzOC)-Lys-L-(Bzl)Thr-L-Phe-L-(Bzl)Thr-L-(Bzl)Ser-L-(PMB)Cys-0-CH₂212246 pryskyřice

Ύ7 kde je pryskyřicí polystyren.

Ochranné skupiny obsažené ve sloučeninách obecného vzorce II musí mít vlastnosti splňující dvě hlediska. Jednak musí ochranné skupiny zabraňovat tomu, aby reaktivní seskupení přítomné v určité molekule nepodlehlo reakci během vystavení molekuly podmínkám, které by jinak měly za následek zánik tohoto reaktivního seskupení. Ochranná skupina věak musí mít na druhá straně takovou povahu, aby ji bylo možno snadno odštěpit za současné regenerace původní reaktivní skupiny, a to za takových podmínek, které by neměly nežádoucí vliv na jiná části molekuly. Skupiny vhodné k těmto účelům, tj. k ochraně amino-, hydroxy- a thioskupiny jsou odborníkovi dobře známé. Popisu těchto ochranných skupin a jejich použití byly věnovány celá svazky. Jedním z nich je práce Frotective Groups in Organic Chemistry, red.

J. F. W. Mc Omie, vyd., Plenům Press, New York, 1973.

Ve shora uvedených vzorcích definujících intermediémí sloučeniny představuje R ochrannou skupinu alfa-aminoskupiny. Ochranné skupiny aminoskupiny jsou dobře známé věem odborníkům v chemii peptldů a mnohé z nich jsou uvedeny ve shora citované Mc Omieově práci v kapitole 2, jejímž autorem je J. W. Bartoň. Jako ilustrativní příklady takových ochranných skupin lze uvést benzyloxykarbonyl-, p-chlorbenzyloxykarbonyl-, ρ-brombenzyloxykarbonyl-, o-chlorbenzyloxykarbonyl-, 2,6-dichlorbenzyloxykarbonyl-, 2,4-dichlorbenzyloxykarbonyl-, o-brombenzyloxykarbonyl-, terc.butyloxykarbonyl-(BOC), terc.amyloxykarbonyl-, 2-(p-bifenylyl) iaopropyloxykarbonyl-(BpOC), adamantyloxykarbonyl-, cyklohexyloxykarbonyl-, cykloheptyloxykarbonyl-, trifenylmethyl-/trityl) a p-toluensulfonylskupinu. Přednostní ochrannou skupinou alfa-aminoskupiny ve významu R je terc.butyloxykarbonylskupina.

R, představuje ochrannou skupinu aulfhydrylového substituentu. Mnohé tyto ochranné skupiny jsou popsány v Mc Omieově práci citované shora v kapitole 7, jejímiž autory jsou R. G. Blckey, V. R. Rao a W. G. Rhodes. Jako ilustrativní příklady těchto ochranných skupin lze uvést ρ-methoxybenzyl-, benzyl-, ρ-tolyl-, benzhydryl-, acetamidomethyl-, tri tyl-, p-ni trobenzy 1-, terc.butyl-, isotmtyloxymethylskupinu a jakákoliv z velkého počtu tri tylových derivátů. Další příklady lze nalézt například v encyklopedii Houben-Weyl, Methoden der Organiechen Chemie, Synthese von Peptlden/, sv. 15/1 β 15/2, (1974). Stuttgart, NSR. Přednostní ochrannou skupinou aulfhydrylskupiny ve významu R, je p-methoxybenzylskupina.

Rg představuje vhodnou ochrannou skupinu epsílon-aminoskupiny. Jako ilustrativní příklady mohou sloužit skupiny uvedené shora jako skupiny vhodné pro ochranu alfa-aminoskupiny, jako typické skupiny vhodné k tomuto účelu lze uvést benzyloxykarbonyl-, terč.butyloxykarbonyl-, terc.amyloxykarbonyl-, cyklopentyloxykerbonyl-, adamantyloxykarbonyl-, p-methoxybenzyl oxykarbonyl-, ρ-chlorbenzyloxykarbonyl-, ρ-brombenzyloxykarbonyl-, o-chlorbenzyloxykarbonyl2,6-dichlorbenzyloxykarbonyl-, 2,4-dichlorbenzyloxykarbonyl-, o-brombenzyloxykarbonyl-, p-nitrobenzyloxykarbonyl-, isopropyloxykarbonyl-, cyklohexyloxykarbonyl-, cykloheptyloxykarbonyl- a p-toluensulfonylskupinu.

Jak bude zřejmé z dalšího popisu, způsob přípravy tetradekapeptldů obecného vzorce I zahrnuje periodické odštěpování ochranné skupiny alfa-aminoskupiny z terminélní aminokyseliny přítomné v peptidovém řetězci. Jediným omezením, pokud se týče totožnosti ochranné skupiny epsílon-aminoskupiny lysinového zbytku, spočlvé tedy v tom, že ochranné skupina musí mít takovou povahu, aby se neodštěpovala za podmínek používaných pro selektivní odštěpování alfa-aminoskupiny. Vhodné volba ochranných skupin alfa-amino a epsllon-aminoskupin je pro běžného odborníka v chemii peptidů snadné, je pouze třeba uvéžit relativní snadnost, s jakou lze jednotlivé ochranné skupiny odštěpit. Tak například skupiny jako je 2-(p-bifenylyl)isopropyloxykarbonylskupina (BpOC) a tritylakupina jsou velmi labilní a lze je odštěpovat i v přítomnosti slabé kyseliny. Středně silné kyseliny, jako kyseliny chlorovodí3 kové, trifluoroctové nebo fluoridu bořitého v kyselině octové, je zapotřebí pro odštěpení jiných skupin, jako terč.butyloxykarbonyl-, terc.amyloxykarfaonyl-, adamantyloxykarbonyla p-methoxybenzyloxykarbonylskupiny. Pro odštěpení jiných ochranných skupin je nutno použít ještě silnějších kyselin, tak například odštěpování benzyloxykarbonyl-, halogenbenzyloxykarbonyl-, ρ-nitrobenzyloxykarbonyl-, cykloalkyloxykarbonyl- a isopropyloxykarbonylskuplny vyžaduje silně kyselé podmínky, tj. použití bromovodíku, fluorovodíku nebo trifluoracetétu bromitého v kyselině trifluoroctové.

Samozřejmě se za použití silnějších kyselin rovněž odštěpí i všechny labilnější skupiny. Při volbě ochranných skupin aminoskupin je tedy třeba zajistit, aby skupina na alfa-aminoskupině byla labilnější než ochranné skupina epsílon-aminoskuplny, a podmínky odětěpo véní musí být selektivnější, aby dochézelo jen k odštěpování ochranné skupiny alfa-aminosku piny.

Přednosti kombinace ochranných skupin vyhovující těmto podmínkám je kombinace o-chlorbenzyloxykarbonyl- nebo cyklopentyloxykarbonylskupiny ve významu R₂ a terč.butyloxykarbonyl skupiny jako ochranné skupiny alfa-aminoskupiny používaná u každá aminokyseliny adovaná na řetězec polypeptidu.

Skupiny Rj a R^ představují ochranné skupiny alkoholická hydroxyskupiny threonlnu a se řinu. Mnohá taková ochranné skupiny jsou popsány ve shora citovaná Mc Omieově prácí, kapitole 3, jejímž autorem je C. B. Reese. Jako typická příklady takových ochranných skupin lze uvést 0,-C^ alkylskuplny, jako methyl-, ethyl- a terč.butylskupinu, benzylskupinu, substituovanou benzylskupinu, jako je p-methoxybenzyl-, ρ-nitrobenzyl-, p-ehlorbenzyl- a o-chlorbenzylskupina, Cj-C^ alkanoylekupiny, jako je formyl-, acetyl- a propionylskupina, trifenyl methylskupinu (tritylskupinu). Když jsou a R^ ochranné skupiny, s výhodou sa v obou případech jako tyto skupiny volí benzylskupiny.

Skupina Rg představuje vodík nebo formylskupinu a definuje skupinu >nr₅ tryptofanového zbytku. Formylskupina slouží jako ochranné skupina. Použití táto ochranná skupiny není obligatorní, a proto může Rg představovat bud vodík (skupina nechráněná na dusíku), nebo formylskupinu (skupina chráněné na dusíku).

V popisu je používáno dále uvedených zkratek, z nichž většina jsou zkratky v tomto oboru běžně zavedené:

Ala - - alanin

Asn - asparagin

Cys - cystein

Gly - glycin

Lys - lysin

Phe - fenylalanin

Ser - serin

Thr - třeonin

Trp - tryptofan

Val - valin

DCC - N,N'-dicyklohexylkarbodiimid

DMF - N,N -dimethylformamid

BOC - terč.butyloxykarbonyl

PMB - p-methoxybenzyl

CBzOC - o-chlorbenzyloxykarbonyl

CPOC - cyklopentyloxykarbonyl

Bzl - benzyl

For - formy 1

BpOC - 2-(p-bifenylyl)isopropyloxykarbonyl.

I když volba konkrétních ochranných skupin, kterých se mé použít při přípravě sloučenin obecného vzorce I, je v rozsahu zkušeností odborníka v syntéze peptidů, je samozřejmé,

Se sekvence reakcí, které musí být provedeny, ovlivňuje volbu konkrétních ochranných skupin.

Jinými slovy, zvolené ochranná skupina musí být stálá jak vůči použitým reakčním složkám, tak za podmínek následujících reakčních stupňů. Tak například, jak již bylo v určitém rozsahu uvedeno, musí zůstat konkrétné použité ochranné skupina netknuta za podmínek použitých při odštěpování ochranné skupiny alfa-aminoskupiny terminálního zbytku aminokyseliny peptidového fragmentu při přípravě pro kondenzaci následujícího aminokyselinového fragmentu na peptidový řetězec. Je rovněž důležité zvolit jako ochrannou skupinu takovou skupinu, které zůstane netknuta během budování peptidového řetězce a kterou lze snadno odštěpit po skončení syntézy požadovaného tetradekapeptidového produktu. Všechny tyto faktory jsou však v rozsahu zkušeností odborníka v tomto oboru.

Jak je ze shora uvedené diskuse zřejmé, mohou se tetradekapeptidy obecného vzorce II připravovat syntézou v pevné fázi. Tato syntéza spočívá v postupném budování peptidového řetězce, počínaje na terminélním uhlíkovém konci peptidu. Většinou se postupuje tak, že se nejprve cystein váže prostřednictvím své karhoxylové funkční skupiny k pryskyřici, reakcí cysteinu s chráněnou aminoskupinou a chráněnou sulfhydrylovou skupinou s chlormethylovou nebo hydroxymethylovanou pryskyřicí. Příprava hydroxymethylované pryskyřice je popsána v práci Bodanszky a další, Chem. Ind. (Londýn), £8, 1597 až 1598 (1966). Chlormsthylovaná pryskyřice je obchodně dostupná.

Při provádění vazebné reakce karboxylové funkční skupiny cysteinu a pryskyřice se nejprve chráněný cystein převede na česnou sůl. Tato sůl se pak nechá reagovat s pryskyřicí způsobem popsaným v práci B. F. Gisin, Helv. Chim. Acta, £6. 1476 (1973). Alternativně se může cystein vázat k pryskyřici tak, že se jeho karboxylové funkční skupina nejprve běžným způsobem aktivuje. Tak například se může nechat cystein reagovat, s pryskyřicí v přítomnosti sloučeniny aktivující karboxyskupinu, jako je Ν,Ν'-dlcyklohexylkarbodlimid (DCC).

Po navázání volné karboxyskupiny cysteinu na pryskyřičný nosič se začne postupně budovat peptidový řetězec, postupnou kondenzací jednotlivých aminokyselin k N-terminální části peptidového řetězce. Přitom je tedy zapotřebí v každém stupni odštěpit ochrannou skupinu alfa-aminoskupiny z aminokyseliny v terminální části peptidového fragmentu a pak se připojí k volnému a reaktivnímu N-konci terminální aminokyseliny následující aminokyselinový zbytek.

Odštěpení ochranné skupiny alfa-aminoskupiny se může provádět v přítomnosti kyseliny, jako kyseliny bromovodíkové, chlorovodíkové, trifluoroctové, p-toluensulfonové, benzensulfonové, naftalensulfonové a octové, za vzniku odpovídající adiční soli produktu s kyselinou.

Jinou metodou odštěpování ochranné skupiny aminoskuplny je působení fluoridem boritým. Tak například se působením diethyletherétu fluoridu boritého v ledové kyselině octové fragment peptidu s chráněnou aminoskupinou převede na komplex s fluoridem boritým, který se pak převede na volný peptidový fragment působením zásady, jako vodného hydrogenuhličitanu draselného. Může se použít kterékoli z těchto metod za předpokladu, že se jí dosáhne odštěpení ochranné skupiny N-terminélní alfa-aminoskupiny bez porušení jakýchkoli dalších ochranných skupin přítomných v peptidovém řetězci. S ohledem na tento požadavek se přednostně odštěpuje N-terminélní ochranné skupina za použití kyseliny trifluoroetové. Obvykle se štěpení provádí při teplotě asi od 0 °C do teploty místnosti.

Po odštěpení ochranné skupiny v N-terminélní poloze je získaný produkt obvykle ve formě adiční soli s kyselinou, které bylo použito pro odštěpování ochranné skupiny. Tento pro5 dukt se pak může převést ne sloučeninu s volnou aminoskupinou působením slabé zásady, typicky terciárního aminu, jako pyridinu nebo triethylamlnu.

Nyní je řetězec peptldu připraven pro reakci 8 následující aminokyselinou. Reakce s aminokyselinou se může provádět kteroukoli z několika známých technik. Pro připojování následující aminokyseliny k N-konci řetezce peptldu se používá aminokyseliny, které má volnou karboxyskupinu, ale která má vhodně chráněnou alfa-aminoskupinu a všechny ostatní popřípadě přítomné reaktivní skupiny. Aminokyselinu je pro reakci s N-koncem řetězce peptldu třeba aktivovat. Jedním ze způsobů aktivace, kterého lze při syntéze použít, je převedení aminokyseliny na směsný anhydrld. Přitom se volná karboxylové funkční skupina aminokyseliny aktivuje reakcí s jinou kyselinou, typicky s derivátem kyseliny uhličité ve formě chloridu kyseliny. Jako příklady takových chloridů kyselin, kterých lze použít pro tvorbu směsných anhydridů, lze uvéet ethylchlorformiét, fenylchlorformlét, sek.butylchlorformiét, isobutylchlorformiát a pivaloylchlorid.

Jiným způsobem aktivace karboxylové funkční skupiny aminokyseliny pro kondenzaci s řetězcem peptldu je převedení aminokyselin na reaktivní esterový derivát. Jako příklady takových reaktivních esterů lze uvést 2,4,5-trichlorfenylester, pentachlorfenylester, p-nitrofenylester, ester vzniklý z 1-hydroxybenzotriazolu a ester vzniklý z N-hydroxysukcinimidu.

Jiným způsobem připojování C-terminólní čésti aminokyseliny k peptidovému fragmentu je způsob, při kterém se kondenzace provádí v přítomnosti alespoň ekvlmolémího množství N,N'-dlcyklohexylkarbodiimldu (DCC), Posledně uvedeného způsobu se přednostně použlvé při přípravě tetradekapeptldu obecného vzorce II, kde X představuje skupinu vzorce pryskyřice

Po připravení řetězce peptldu e požadovaným sledem aminokyselin se může výsledný peptiů odstranit z pryskyřičného nosiče. To se provádí působením fluorovodíku na tetradekapeptid vázaný k pryskyřici s chráněnými reaktivními skupinami. Působením fluorovodíku se odštěpí peptid od pryskyřice, kromě toho se jím však odštěpí všechny ostatní ochranné skupiny přítomné na reaktivních skupinách peptidového řetězce, stejně tak jako ochranné skupina alfa-aminoskupiny terminélní aminokyseliny. Když se peptid odštěpuje od pryskyřice za současného odštěpení ochranných skupin působením fluorovodíku, přednostně se reakce provádí v přítomnosti anisolu. Zjistilo se, že přítomnost anisolu inhibuje potenciální alkylacl určitých zbytků aminokyselin přítomných v řetězci peptldu. Kromě toho se odštěpováni přednostně provádí v přítomnosti ethylmerkaptanu. Ethylmerkaptan slouží k ochraně indolového kruhu tryptofanového zbytku a kromě toho usnadňuje převedeni chráněných cysteinových zbytků do thiolové formy. Rovněž v případě, že R^ představuje formylekupinu, usnadňuje přítomnost ethylmerkaptanu odštěpení formylskupiny fluorovodíkem.

Fo shora popsaném štěpení se získé jako produkt peptid s přímým řetězcem obsahujícím 14 zbytků aminokyselin.

Následující příklady provedení blíže objasňují přípravu sloučenin obecného vzorce II a meziproduktů. Příklady mají pouze Ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném směru neomezují.

Příklad 1

N-terc.butyloxykarbonyl-L-cysteinyl-(S-p-methomybenzyl)methylované polystyrénové pryskyřice

K 500 ml Ν,Ν-dlmethylformamldu (DMF) obsahujícímu česnou sůl N-terc.butyloxykarbonyl-(S-p-methoxybenzyl)cysteinu [připravenou z 9,06 g (26,5 mmolu) zvolené kyseliny) se přidé 51,0 g chlormethylované polystyrénové pryskyřice (0,75 mmolu/g). Směs se míché 6 dnů při teplotě místnosti. Pryskyřice se odfiltruje a postupně promyje třikrát směsí 90 % DMF a 10 % vody, třikrát 95% ethanolem a třikrát DMF. K pryskyřici suspendované v 500 ml DMF se přidé roztok 10,5 g octanu česného. Směs se míchá 6 dnů při teplotě místnosti. Pryskyřice se odfiltruje a postupně promyje jednou vodným DMF, třikrát směsí 90 % DMF a 10 % vody, třikrát 95% ethanolem, třikrát methylenchloridem, třikrát 95% ethanolem a třikrát chloroformem. Prachové částice se odstraní tím, že'se pryskyřice čtyřikrát suspenduje v chloroformu a kapalina se vždy oddělí. Pak se pryskyřice suší za vakua při 40 °C přes noc. Získé se 44,8 g titulního produktu. Analýza minokyselin ukazuje, že produkt obsahuje 0,25 mmolu cystě inu na gram pryskyřice. Cystein se stanovuje jako kyselina cysteinové v produktu hydrolýzy prováděné za použití směsi dioxanu a koncentrované kyseliny chlorovodíkové 1:1, ke které bylo přidéno malé množství dimethylsulfoxidu.

Příklad 2

N-terc.butyloxykarbonyl-L-valyl-glycyl-L-(S-p-methoxybenzyl)cysteinyl-L-(N-epsilon-o-chlorbenzyloxykarbonyl)-lysyl-L-aeparaginyl-L-fenylalanyl-L-fenylalahyl-L-(formýl)tryptofyl-L~(N-epeilon-o-chlorbenzyloxykarbonyl)lyeyl-L-(O-benzyl)threonyl-L-fenylalányl-L-(0-benzyl)threonyl-L-(0-benzyl)seryl-L-(S-p-methoxybenzyl)cysteinylmethylovená polystyrénové pryskyřice

Produkt z příkladu 1 (7,0 g) se umístí do reakční nádoby automatického syntetizétoru peptidiů (Beekman 990) a v tomto zařízení se k produktu připojí dvanáct ze zbývajících třinácti aminokyselin. Výsledný chráněný tridekapeptid vázaný k pryskyřici se rozdělí na dva stejné díly a k produktu obsaženému v jednom z těchto dílů se připojí koncový zbytek. Použité aminokyseliny a jejich pořadí jsou:

, 2, 3 4.

7 8, 9.

11 , 12, 13.

N-tere.butyloxykarbonyl-(O-benzyl)-L-serin,

N-terc.butyloxykarbonyl-(0-benzyl)-L-threonin,

N-terc.butyloxykarbonyl-L-fenylalanin,

N-terc.butyloxykarbonyl-(0-benzyl)-L-threonln,

N“-terč.butyloxykarbonyl-N-epsi1on-o-chlorbenzyloxykarbonyl-L-lysin, N^a-terč.butyloxykarbonyl-N-formyl)-L-tryptofan,

N-terc,. butyloxykarbonyl-L-fenylalanin,

N-terc.butyloxykarbonyl-L-fenylalani n, p-nitrofenylester N-terc.butyloxykarbonyl-L-asparaginu, N“-ter.butyloxykarbonyl-N-ep8ilon-o-chlorbenzyloxykarbonyl-L-lysin, N-terc.butyloxykarbonyl-(S-p-methoxybenzyl)-L-cystein,

N-terc.butyloxykarbonylglycin a

N-terc.butyloxykarbonyl-D-valin.

Sled operací, kterými se provádí odětěpení ochranné skupiny, neutralizace a připojení aminokyseliny v případě každé z aminokyselin zaváděných do peptidu, je tento:

1. trojnásobné promytí chloroformem (vždy 10 ml/g pryskyřice), vždy po dobu 3 minut,

2. odětěpení BOC skupiny dvacetiminutovým působením směsi 29 % kyseliny trifluoroctové 48 % chloroformu a 6 % triethylsilanu v množství 10 ml/g po dobu 20 minut, postup se opakuje dvakrát,

3. dvojnásobné promytí chloroformem (vždy 10 ml/g pryskyřice), vždy po dobu'3 minut,

4. jedno promytí methylenchloridem (vždy ,0 ml/g pryskyřice), po dobu 3 minut,

5. trojnásobné promytí směsí 90 % terč.butylalkoholu a 10 % terč.amylalkoholu (vždy 10 ml/g pryskyřice), vždy po dobu 3 minut,

6. trojnásobné promytí methylenchloridem (vždy 10 ml/g pryskyřice), vždy po dobu 3 minut,

7. neutralizace 3% triethylaminem v methylenchloridu (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 mi nut - opakuje se třikrát,

8. Promývání methylenchloridem (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

9. promývání směsí 90 % terč.butylalkoholu a 10 % terč.amylalkoholu (10 ml/g pryskyřl ce) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

10. promývání methylenchloridem (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát, i

11. přidání 1,0 mmol/g pryskyřice chráněná aminokyseliny a 1,0 mmolu/g pryskyřice Ν,Ν'-dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) v 10 ml/g pryskyřice methylenchloridu a míšení po dobu 120 minut,

12. promývání methylenchloridem (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

13. Promývání směsí 90 % .terč.butylalkoholu a 10 % terč.amylalkoholu (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

14. promývání methylenchloridem (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

15· neutralizace působením 10 ml/g pryskyřice 3% triethylaminu v methylenchloridu po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

16. promývání methylenchloridem (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

17. promývání směsí 90 56 terč.butylalkoholu a 1 0 % terč.amylalkoholu (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát, .

18. promývání methylenchloridem (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

19. promývání 10 ral/g pryskyřice dimethylformamidem po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

20. přidání 1,0 mmolu/g pryskyřice chráněně aminokyseliny a 1,0 mmolu/g pryskyřice Ν,Ν'-dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) v 10 ml/g pryskyřice směsi DMF a methylenchloridu 1:1 a míšení po dobu 120 minut,

21. promývání 10 ml/g dimethylformamidem po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

22. promývání methylenchloridem (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

23. promývání směsí 90 56 terč.butylalkoholu a 1 0 56 terč.amylalkoholu (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

24. promývání methylenchloridem (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

25. neutralizace působením 10 ml/g pryskyřice 356 triethylaminu v methylenchloridu po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

26. promývání methylenchloridem (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

27. promývání směsí 90 % terč.butylalkoholu a 10 % terč.amylalkoholu (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát a

28. promývání methylenchloridem (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se tři krát.

Shora uvedeného sledu operací se používá pro připojeni každé z aminokyselin, s výjimkou glycinu a asparaginu. Připojení glycinu se provádí pouze za použití stupňů 1 až 18. Asparaginový zbytek se zavádí prostřednictvím reaktivního p-nitrofenylesteru. Přitom se stu peň 11 nahradí těmito třemi stupni:

a) promývání 10 ml/g pryskyřice dimethylformamidem po dobu 3 minut - opakuje se třikrát ,

b) přidání 1,0 mmolu/g pryskyřice p-nitrofenylesteru K-terc.butyloxykarbonyl-L-asparaginu v 10 ml/g pryskyřice směsi dimethylformamldu a methylenchloridu 1:3 a míchání po dobu 720 minut a

c) promývání 10 ml/g pryskyřice dimethylformamidem po dobu 3 minut - opakuje se třikrát.

Rovněž stupeň 20 se modifikuje tak, že se přidá p-nitrofenylester N-terč.butoxykarbonyl-L-asparaginu ve směsi dimethylformamidu a methylenchloridu 3:1 a směs ae míchá 720 minut .

Výsledný peptid vázaný k pryskyřici se za vakua vysuěí. Produkt se hýdrolyzuje za varu pod zpětným chladičem ve směsi koncentrovaná kyseliny chlorovodíková a dioxanu po dobu 72 hodin. Analýza aminokyselin výsledného produktu poskytuje tyto výsledky (jako standardu se používá lysinu}: Asn 1,04, 2Thr 2,68, Ser 1,08, Val 1,12, Gly 1,04, 3Phe 3,87, 2Lys 2,00 Trp 0,75.

Tryptofan se stanoví 21 hodinovou hydrolýzou vzorku produktu v přítomnosti dimethylsulfoxidu a thioglykolové kyseliny. Cystein se neurčuje, poněvadž při analýze touto metodou dochází k jeho rozkladu.

Příklaů 3

D-valyl-glycyl-L-cysteinyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-fenylalanyl-L-fenylalanyl-L-tryptofyl-L-lysyl-L-threonyl-L-fenylalanyl-L-threony.l-L-seryl-L-cystein

Ke směsi 5 ml anisolu a 5 ml ethylmerkaptanu se přidá 2,828 g (při úrovni substituce 0,150 mmolu/g) chráněného tetradekapeptidu, vázaného k pryskyřici z příkladu 2. Směs se ochladí v kapalném dusíku a přidestiluje se 56 ml kapalného fluorovodíku. Výsledné směs se nechá ohřát na 0 °C a míchá se po dobu 2 hodin. Fluorovodík se pak oddestiluje. Ke zbylé směsi se přidá ether a vzniklá směs se ochladl na 0 °C. Vzniklá pevné látka se odfiltruje a promyje etherem. Produkt se vysuší a tetradekapeptid zbavený ochranných skupin se extrahuje ze směsi s pryskyřicí za použití 1 M kyseliny octové a malého množství ledové kyseliny octové.

Roztok v kyselině octové se pak ihned ve tmě lyofllizuje do sucha. Výsledné bílé pevné létka se suspenduje ve směsi 10 ml odplyněné 0,2 M kyseliny octové a 4 ml ledové kyseliny octové. Suspenze se zahřívá, ale všechna pevné létka se úplně nerozpustí. Nerozpustný podíl se odfiltruje a neprůhledný bezbarvý filtrát se nanese na sloupec Sephadexu G-25F. Chromatografie se provédí za těchto podmínek:

rozpouštědlo: odplyněné 0,2 M kyselina octové rozměry sloupce: 75 x 1 500 mm, teplota: 26 °C, průtokové rychlost: 629 ml/h, objem frakce: 22,0 ml.

Absorbance při 280 nm každé frakce se vynese do grafu oproti číslu frákck. Získé se křivka s velkým širokým maximem a přilehlým ramenem (inflexí). UV-spektroskopie ukazuje, že hlavní čést maxima tvoří produkt. Spojí se frakce 224 až 240 (tj. eluét od 4,906 do 5 280 ml, maximum odpovídá průtoku celkem 5 054 ml eluétu).

Spojené frakce neobsahují produkt odpovídající rameni křivky. UV-spektroskopie ukazuje, že ve spojených frakcích je obsaženo 175 mg produktu (výtěžek 24,8 96). Blluanovou titra· cí alikvotního vzorku se zjistí, že obsah sulfhydrylových skupin je 93,6 % teorie.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob přípravy tetradekapeptidu vzorce I,

   H-D-Val-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH (I) vyznačený tím, že ae na sloučeninu obecného vzorce IX,

   R-D-Val-Gly-L-Cys (R,) -L-Lys (Rg)-L-A sn-L-Phe-L-Phe-L-Trp(Rj) -L-Lys (Rg) -L-Thr (R-j) -L-Fhe-L-Thr<R₃)-L-Ser($₄)-L-Cys(R,)-X (II) kde představuje

   R ochrannou skupinu alfa-aminoskuplny,

   R, ochrannou skupinu thioskupiny,

   Rg ochrannou skupinu epsilon-aminoskupiny, každý ze symbolů ochrannou skupinu hydroxy skupiny, vodík nebo formylskupinu a skupinu vzorce

   Κβ 8 R *5

   X pryskyřice

   -^CM\ , kde je pryskyřici polystyren, působí fluorovodíkem.