CS203818B1

CS203818B1 - Spdsob přípravy merkaptodeoxycelulózy

Info

Publication number: CS203818B1
Application number: CS430179A
Authority: CS
Inventors: Peter Gemeiner
Original assignee: Peter Gemeiner
Priority date: 1979-06-22
Filing date: 1979-06-22
Publication date: 1981-03-31

Description

Vynález sa týká spósobu přípravy merkaptodeoxycelulózy z chlorodeoxycelulózy.

Vodonerozpustne nosiče obsahujúce tiolové skupiny majú Široké možnosti uplatneniá v róznych oblastíach enzymového inžinierstva. Najčastejšie sa používajú v afinitnej chromatografii tiolových enzýmov /Methods in Enzymology 34 jAffinity Techniques] 1974/ a pri imobilizécii „ enzýmov/0. R. Zaborsky, Imtnobilized Enzymes, CRC Cleveland 1974/. Až na polyakrylamidového prechodcu /Enzacryl Polythiol, Koch-Light/ sa dnes vyrábajú polytioly výlučné na báze pólysacharidov, a to hlavně agarózy napr.: Activated Thiol-Sepharose 4B, Thiopropyl-Sephaťose 6B, či sietovanej agarózy napr.: příslušné polytioly série Sepharose CL, všetko Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala.

Příprava týchto polysacharidov obsahujúcich tiolové skupiny vychádza z aktivácie polysacharidu brómkyánom [Activated Thiol-Sepharose 4B, Upplands Grafíska AB /1974/,' resp. z 0-alkylácie agarózy bis-epoxidmi čicí, -halohydrínini /R. Axén, H. Dřevin, J. Carlsson, Acta Chem.

Scand. B 29 / 1975/ 471 ; H. Nishikawa, P. Bailon, J. Solid-Phase Biochem. 1 33/. Uvede• né postupy jednak používajú u nás netradičné polysachatidy /agaróza, dextrán/ ako aj devizové chemikálie /napr.: brómkyán, glutathión, 2,2*-dipyridyldisulfid, bisepoxidy, dithiothreitol/.

Naviac u celulózy nedávajú tieto spósoby přípravy uspokojivé výsledky /J, Zemek, L. Kuniak,

P. Gemeiner, PV - 7358/78/. Na druhej straně sa javí ako vhodný východiskový materiál pre přípravu tiol-polysacharidov chlórodeoxycelulóza /CD-celulóza/, lahko pripravitelná za miernych reakčných podmienok s poměrně vysokými stupftami substitúcie /DS 0,3/ /T. L. Vigo, C. W. Welch, Textile J. Res. 40 /1970/ 109/. Chlór v tejto CD-celulóze možno nahradit běžnými nukleofilnými substituentami, napr. -amino, -merkapto, -hydroxy a iné. Tak je v případe chlórodeoxydéxtránu popísaná substitúcia za tiosíran za vzniku tiosíran-deoxydextránu /TSD-dextránu/ /A. F.

Kolová et al., Cell. Chem. Technol. 12 /1978/553/. Takýto TSD-dextrán sa potom prevedie alkalickým štiepením v prostředí argonu na merkaptodeoxydextrán /MD-dextrán/.

Naše výsledky výskumu v tejto oblasti ukázali, še aj CD-celulózu je možiio uspokoj ivo previest na tiosíran-deoxycelulózu. Jej redukcia tiolmi, ako sd napr.: kyselina tioglykolová alebo Z^merkaptoetanol v slabo alkalickom prostředí a v přítomnosti chelátotvorných činidiel, vedie ku tvorbě merkaptodeoxy-celulózy.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že v prvom stupni sa prevedie CD-celulóza vo vodnom roztoku tipsíranu sodného pri teplote 90 až 105 °C po dobu 35 až 45 hodin pri mólovom pomere CD skupiny pólysacharidu : tiosíran 1:10 až 15 pri hydromodule ,0 až 15 na tiosíran-deoxy-celulózu, načo v druhora stupni po premytí produktu do negatívnej reakcie na tiosírany a vysuší sa přidá vodný tlmivý roztok kyseliny tioglykolovej resp. 2-merkaptoetanolu o pH 7,7 až 7,9 obsahujúci 1 až 5 mM Chelaton 3 pri mólovom pomere tiosiranové skupiny polysacharidu : tiol 1:15 až 20 a pri hydromodule 10 až 15 a nechá pSsobií 20 až 40 minút pri teplote 20 až 30 °C.

CD-celulóza připravená podlá I. L. Vigo, C. M. Welch, Textile Res, J, 40 /1970/ 109 s DS 0,3 až 0,6 je dostatočne vhodná pre přípravu MD-celulózy. Takáto CD-celulóza má výrazné zvýšenu tepelnú odolnost.

Zavedeuie tiosíranovej skupiny sa mňže prevádzat s tiosírsnom sodným pri teplote 90 až 105 °C po dobu 35 až 45 hodin. Výsledný produkt obsahuje 0,4 až 0,6 mmólov tiosíranových skupin na 1 g suchého preparátu.

Redukcia tiosíranovej skupiny na tiolovú sa prevádza pflsobením kyseliny tioglykolovej či 2-merkaptoetanolu vo vodných tlmivých roztokoch pH 7,7 až 7,9 obsahujúcích Chelaton 3.

Po redukcn sa produkt rýchlo premyje pufrovaným vodným roztokom obsahujúcim Chelaton 3, destilovanou vodou obsahujúcou Chelaton 3 a aceton. Výsledný produkt obsahuje 0,25 až 0,5 mmólov tiolových skupin na 1 g suchého preparátu.

Výhodou navrhovaného spflsobu přípravy merkaptodeoxy-celulózy je, že preparáty umožňuje vyrábať z domácích lacných surovin poměrně jednoduchým technologickým postupom.

Příklady prevedenia

Přikladl g chlorodeoxy-celulózy /CD-celulózy/ obsahujúcej 1,8 mmóla Cl/g sa nechá napučat v 100 ml 2,1 M vodného roztoku tiosiranu sodného. Reakčná zmes sa potom udržiava 40 hodin pri 100 °C za občasného premiešania. Produkt sa premyje vodou do negatívnej reakcie na tiosíranové ió-ny, acetónom a nechá sa vysušit pri 40 °C. Suchý produkt sa rozsuspenduje v 80 ml 0,1 M vodného roztoku hydrouhličitanu sodného obsahujúceho 5 mM Chelaton 3. Za stálého miešania sa přidá 10 ml kyseliny tioglykolovej a pH sa upraví přidáním koncentrovaného hydroxidu sodného na 7,8. Suspenzia sa nechá miešat 30 minút pri laboratórnej teplote. Produkt sa rýchlo premyje na sklenom filtri 0,1 M vodným roztokom hydrouhličitanu sodného obsahujúcim 5 mM Chelaton 3, destilovanou vodou obsahujúcou 1 mM Chelaton 3 a acetónom, vždy do negatívnej reakcie na tioly. Produkt sa vysuší pri 40 °C.

Preparát obsahuje 2,4 Z síry a O',475 mmólov/g titrovatelných tiolových skupin.

E2SSÉS!S2^{: +}Chelaton 3 - sodná sol kyséliny etyléndiaminotetraoctovej

Příklad 2

Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielora, že pri redukcii tiosiranu CD-celulózy sa použije 10 ml 2-merkaptoetanolu. Suchý produkt obsahuje 2,85 Z síry a 0,33; mmólov/g titrovatelných tiolových skupin.

Příklad 3

Postup podlá příkladu 1 stý» rozdíelom, že ako východisková CD-celulóza sa použije preparát s obsahám 3,2 ramólov Cl/g a v 1. stupni 3,85 M vodný roztok tiosíranu sodného. Suchý produkt obsahuje 2,5 Z síry a 0,25 mmólov/g titrovatelných skupin.

Vynález má uplatnenie všade, kde je potřebné izolovat či čistit enzýmy a iné bielkoviny obsahujúce tíolové skupiny a kde je výhodné imobilizovaí enzýmy prostedníctvom ich cysteínových zvyškov, a to či už v priemyselnej praxi alebo vo výskuma.

Claims

Sposob přípravy merkaptodeoxy-celulózy vyznačený tým, že chlorodeoxycelulóza sa v prvon stupni nechá reagovat s vodným roztoko» tiosíranu sodného pri teplote 90 až 105 °C po dobu 35 až 45 hodin pri mólovom požere chlorodeoxy CD skupiny polysacharidu : tiosíran 1:10 až 15 pri hydromodule 10 až 15, načo v druhom stupni, po premytí produktu do negatívnej reakcie na tiosírany a vysušení sa přidá vodný tlmivý roztok kyseliny tioglykolovej alebo 2-merkaptoetanolu o pH 7,7 až 7,9 obsahujúci 1 až 5 mM Chelaton 3 pri mólovom pomere tiosíranové skupiny polysacharidu : tiol 1:15 až 20 a pri hydromodule 8 až 12 a nechá pSsobit 20 až-40 minut pri teplote 20 až 30 °C a nakoniec sa premýva rýchlo na filtri vodným tlmivým ro2tokom obsahujúcim 1 až 5 mM Chelaton 3, destilovanou vodou obsahujucou 0,5 až 1 mM Chelaton 3 a. acetónom, vždy do negatívnej reakcie na tioly.