CS203818B1 - Spdsob přípravy merkaptodeoxycelulózy - Google Patents

Description

POPIS VYNÁLEZU

K AUTORSKÉMU OSVEDČENIU 203818 (Π) (Bl)

ČESKOSLOVENSKA SOCIALISTICKÁ

REPUBLIKA <1S)

/22/ Přihlášené 22 06 79/21/ /PV 4301-79/ (51) Int. Ci? C 08 B 15/02

ÚŘAD PRO VYNÁLEZY

A OBJEVY (40) Zverejnené 30 06 80(45) Vydané 15 11 82 (75)

Autor vynálezu

GEMEINER PETER ing. CSc., BRATISLAVA (54) Spdsob přípravy merkaptodeoxycelulózy > i ·.

Vynález sa týká spósobu přípravy merkaptodeoxycelulózy z chlorodeoxycelulózy.

Vodonerozpustne nosiče obsahujúce tiolové skupiny majú Široké možnosti uplatneniá v róz- nych oblastíach enzymového inžinierstva. Najčastejšie sa používajú v afinitnej chromatografiitiolových enzýmov /Methods in Enzymology 34 jAffinity Techniquesj 1974/ a pri imobilizácii „enzýmov/0. R. Zaborsky, Immobilized Enzymes, CRC Cleveland 1974/. Až na polyakrylamidovéhoprechodcu /Enzacryl Polythiol, Koch-Light/ sa dnes vyrábajú polytioly výlučné na báze póly-sacharidov, a to hlavně agarózy napr.: Activated Thiol-Sepharose 4B, Thiopropyl-Sephaťose 6B,či sietovanej agarózy napr.: příslušné polytioly série Sepharose CL, všetko Pharmacia FineChemicals, Uppsala. Příprava týchto polysacharidov obsahujúcich tiolové skupiny vychádza z aktivácie poly-sacharidu brómkyánom [Activated Thiol-Sepharose 4B, Upplands Grafíska AB /1974/; resp. z 0-al-kylácie agarózy bis-epoxidmi či A-halohydrínrai /R. Axén, H. Dřevin, J. Carlsson, Acta Chem.

Scand. B 29 / 1975/ 471 ; H. Nishikawa, P. Bailon, J. Solid-Phase Biochem. 1 33/. Uvede- • né postupy jednak používajú u nás netradičné polysachatidy /agaróza, dextrán/ ako aj devizovéchemikálie /napr.: brómkyán, glutathión, 2,2'-dipyridyldisulfid, bisepoxidy, dithiothreitol/.

Naviac u celulózy nedávajú tieto spósoby přípravy uspokojivé výsledky /J, Zemek, t. Kuniak, P. Gemeiner, PV - 7358/78/. Na druhej straně sa javí ako vhodný východiskový materiál pre pří-pravu tiol-polysacharidov chlórodeoxycelulóza /CD-celulóza/, lahko pripravitelná za miernychreakčných podmienok s poměrně vysokými stupčami substitúcie /DS 0,3/ /T. L. Vigo, C. W. Welch,Textile J. Res. 40 /1970/ 109/. Chlór v tejto CD-celulóze možno nahradit běžnými nukleofilný-mi substituentami, napr. -amino, -merkapto, -hydroxy a iné. Tak je v případe chlórodeoxydéx-tránu popísaná substitúcia za tiosíran za vzniku tiosíran-deoxydextránu /TSD-dextránu/ /A. F.

Kolová et al., Cell. Chem. Technol. 12 /1978/553/. Takýto TSD-dextrán sa potom prevedie alka-lickým štiepením v prostředí argonu na merkaptodeoxydextrán /MD-dextrán/. 203818 203818 2

Naše výsledky výskumu v tejto oblasti ukázali, že aj CD-celulózu je možiio uspokoj ivopreviest na tiosíran-deoxycelulózu. Jej redukcia tiolmi, ako sd napr.: kyselina tioglykolováalebo Z^merkaptoetanol v slabo alkalickom prostředí a v přítomnosti chelátotvorných činidiel,vedře ku tvorbě merkaptodeoxy-celulózy.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že v prvom stupni sa prevedie CD-celulóza vo vodnomroztoku tipsíranu sodného pri teplote 90 až 105 °C po dobu 35 až 45 hodin pri mólovom pomereCD skupiny pólysacharidu : tiosíran 1:10 až 15 pri hydromodule ,0 až 15 na tiosíran-deoxy-ce-lulózu, načo v druhora stupni po premytí produktu do negatívnej reakcie na tiosírany a vysušísa přidá vodný tlmivý roztok kyseliny tioglykolovej resp, 2-merkaptoetanolu o pH 7,7 až 7,9obsahujáci 1 až 5 mM Chelaton 3 pri mólovom pomere tiosíranové skupiny polysacharidu : tiol1:15 až 20 a pri hydromodule 10 až 15 a nechá pSsobií 20 až 40 minut pri teplote 20 až 30 °C. CD-celulóza připravená podlá I, L. Vigo, C. M. Welch, Textile Res, J, 40 /1970/ 109s DS 0,3 až 0,6 je dostatočne vhodná pre přípravu MD-celulózy. Takáto CD-celulóza má výraznézvýšená tepelná odolnost.

Zavedeuie tiosíranovej skupiny sa mSže prevádzat s tiosíranom sodným pri teplote 90 až105 °C po dobu 35 až 45 hodin. Výsledný produkt obsahuje 0,4 až 0,6 mmólov tiosíranových sku-pin na 1 g suchého preparátu.

Redukcia tiosíranovej skupiny na tiolová sa prevádza pflsobením kyseliny tioglykolovejči 2-merkaptoetanolu vo vodných tlmivých roztokoch pH 7,7 až 7,9 obsahujácích Chelaton 3.

Po redukcn sa produkt rýchlo premyje pufrovaným vodným roztokom obsahujácim Chelaton 3, de-stilovanou vodou obsahujácou Chelaton 3 a aceton. Výsledný produkt obsahuje 0,25 až 0,5 mmó-lov tiolových skupin na 1 g suchého preparátu. Výhodou navrhovaného spSsobu přípravy merkaptodeoxy-celulózy je, že preparáty umožňujevyrábať z domácích lacných surovin poměrně jednoduchým technologickým postupom. Příklady prevedenia Přikladl 10 g chlorodeoxy-celulózy /CD-celulózy/ obsahujácej 1,8 mmóla Cl/g sa nechá napučatv 100 ml 2,1 M vodného roztoku tiosiranu sodného. Reakčná zmes sa potom udržiava 40 hodin pri100 °C za občasného premiešania. Produkt sa premyje vodou do negatívnej reakcie na tiosírano-vé ió-ny, acetónom a nechá sa vysušit pri 40 °C. Suchý produkt sa rozsuspenduje v 80 ml 0,1 Mvodného roztoku hydrouhličitanu sodného obsahujáceho 5 mM Chelaton 3. Za stálého miešania sapřidá 10 ml kyseliny tioglykolovej a pH sa upraví přidáním koncentrovaného hydroxidu sodnéhona 7,8. Suspenzia sa nechá miešat 30 minát pri laboratórnej teplote. Produkt sa rýchlo pre-myje na sklenom filtri 0,1 M vodným roztokom hydrouhličitanu sodného obsahujácim 5 mM Chela-ton 3, destilovanou vodou obsahujácou 1 mM Chelaton 3 a acetónom, vždy do negatívnej reakciena tioly. Produkt sa vysuší pri 40 °C.

Preparát obsahuje 2,4 Z síry a O',475 mmólov/g titrovatelných tiolových skupin.

Poznámka: +Chelaton 3 - sodná sol kyséliny etyléndiaminotetraoctovej Příklad 2

Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielora, že pri redukcii tiosiranu CD-celulózy sa použi-je ,0 ml 2-merkaptoetanolu. Suchý produkt obsahuje 2,85 Z síry a 0,33; mmólov/g titrovatelnýchtiolových skupin.

Claims (1)

1. 3 203818 Příklad 3 Postup podlá příkladu 1 stý» rozdielom, že ako východisková CD-celulóza sa použije pre-parát s obsahám 3,2 ramólov Cl/g a v 1. stupni 3,85 M vodný roztok tiosíranu sodného. Suchýprodukt obsahuje 2,5 Z síry a 0,25 mmólov/g titrovatelných skupin. Vynález má uplatnenie všade, kde je potřebné izolovat či čistit enzýmy a iné bielkovinyobsahujúce tiolové skupiny a kde je výhodné imobilizovaí enzýmy prostedníctvom ich cysteíno-vých zvyškov, a to či už v priemyselnej praxi alebo vo výskuma. PREDMEI VYNALEZU Sp8sob přípravy merkaptodeoxy-celulózy vyznačený tým, že chlorodeoxycelulóza sa v prvomstupni nechá reagovat s vodným roztokom tiosíranu sodného pri teplote 90 až 105 °C po dobu35 až 45 hodin pri mólovom požere chlorodeoxy CD skupiny polysacharidu : tiosíran 1:10 až 15pri hydromodule 10 až 15, načo v druhom stupni, po premytí produktu do negatívnej reakcie natiosírany a vysušení sa přidá vodný tlmivý roztok kyseliny tioglykolovej alebo 2-mcrkaptoeta-nolu o pH 7,7 až 7,9 obsahujúci 1 až 5 mM Chelaton 3 pri mólovom pomere tiosíranové skupinypolysacharidu : tiol 1:15 až 20 a pri hydromodule 8 až 12 a nechá pSsobit 20 až·40 minut priteplote 20 až 30 °C a nakoniec sa premýva rýchlo na filtri vodným tlmivým roztokom obsahujú-cim 1 až 5 mM Chelaton 3, destilovanou vodou obsahujucou 0,5 až 1 mM Chelaton 3 a. acetónom,vždy do negatívnej reakcie na tioly. Srvrroprafia. a· p- tí»oA 7. Moit