CS202630B1 - Způsob imunodifuze ve vrstvě agarového gelu - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu imunodifuze ve vrstvě agarového (resp. agarosového nebo jiného obdobného) gelu s nehomogenně rozptýlenou protilátkou.

V lékařství je často třeba stanovit v biologických materiálech antigen v běžných koncentracích. V praxi se užívá jednak metod kvalitativních, zvláště protisměrné imunodifuze ve vrstvě agarového gelu a imunoelektroforézy, kdy je možno provést hrubý odhad množství antigenu, jednak metod kvantitativních, a to zvláště jednosměrné imunodifuze ve zkumavkách nebo trubičkách a metody radiální difúze ve vrstvě agarového gelu s homogenně rozptýlenou protilátkou, jindy ve spojení s elektroforézou ve vrstvě agarového gelu s homogenně rozptýlenou protilátkou (tzv. raketová technika), dále metod, používajících značkovaného antigenu radioaktivními izotopy (tzv. RIA - metody), a zákalových fotometrických metod.

Kvalitativní metody jednak nedovoluji stanovit skutečný obsah antigenu v materiálu, jednak při nevhodném poměru antigen : protilátka mohou vést k hrubě zkreslujícímu odhadu. Kvantitativní metody mají nevýhodu, že jsou.většinou značně nákladné a pracné, a některé z nich vyžadují ke svému provedení náročného až velmi drahého vybavení, což se nepříznivě projevuje při provádění hromadných vyšetření, nutných při depistážích, například při depistáži snížených koncentrací protilátek u dětí předškolního věku.

202 630

202 830_

Vynález řeší způsob, umožňujíc! dostatečně rychlé a ve velkých sériích proveditelné stanovení antigénu s dostačující přesností bez potřeby náročnější laboratorní techniky. Přitom je spotřeba protilátek - specifických antisér, které představují hlavní položku v nákladech, minimální. Rovněž pracnost je velmi nízká ve srovnání a uvedenými postupy.

Předmětem vynálezu je způsob imunodifuze ve vrstvě agarového nebo obdobného gelu s nehomogenně rozptýlenou protilátkou.

Podstatou vynálezu je, že ee alespoň část vrstvy gelu nasytí protilátkou, jejíž koncentrace klesá kolmo k definované přímce, úměrně se vzdáleností od ní, a potom ae vnese alespoň v jednom místě s nulovou nebo nejnižši koncentrací protilátky jednak vzorek antigenu a jednak v místě stejně od definované přímky vzdáleném, ale ve směru přímky posunutém, odpovídající antigen o známé koncentraci. Po dokončené imunoprecipitaci ae zjišluje vzdálenost vytvořených precipitátů od místa vnesení ve směru vzrůstu koncentrace protilátky.

Předmět vynálezu přináší vyšší účinek tím, že umožní v případech,· kdy jeou k dispozici monošpecifieká antiséra s vhodným titrem protilátek k tvorbě precipitátů, objektivní hromadné stanovení antigenů, například imunoglobulinů, bez použití elektroforézy nebo jiných nákladných zařízení. Vyšetření je snadné a dostatečně přesné pro screening a je velmi nenáročné na potřebné zařízení. Má vysokou kapacitu a spotřeba antisér je velmi malá.

Použití způsobu podle vynálezu je schematicky znázorněno na připojeném výkrese, kde je na obr. 1 znázorněn pohled na podložní sklo ze etrany agarové vrstvy a na obr. 2 řez A-A podle obr. 1.

Na obr. 1 a 2 je znázorněno podložní sklo J, s vretvou £ agarového gelu. Vrstva 2. je podél definované přímky 2· ^v uvedeném pohledu rovnoběžné s podélnou hranou 10 podložního akla 1, nasycena protilátkou £ tak, že koncentrace protilátky 2 klesá kolmo na definovanou přímku JJ. Pokles koncentrace protilátky 2 j® ^na °^^Γ· 2 schematicky znázorněn snižující ae výškou šrafované části. Ve zvolené vzdálenosti 4 od definované přímky J je provedena do agarového gelu řada otvorů 30 až 34 o stejném průměru, přibližně stejně od sebe vzdálených.

Způsobem podle vynálezu za použití nosiče, upraveného například podle obr. 1 a 2, se postupuje takto:

Na podložních aklech 1 na vodorovném podkladě se připraví nalitím roztaveného agarového gelu ve vhodném pufru stejnorodá vrstva 2 agarového gelu. Po zatuhnutí se do ní vyřízne korýtko - realizace definované přímky 2 ~t čo něhož se vnese antisérum vhodné koncentrace do vymizení reflexu. Difúzí se tak nasytí agarový gel 2 protilátkou 2· Den po vnesení antiséra, kdy ae koncentrace protilátky difúzí upraví podle obr. 2, vypíchnou se do agarové vrstvy 2 otvory 30 až 34 o stejném průměru, do otvorů 31 až 34 ee vnesou jednotlivá zkoušené séra s neznámou koncentrací antigénu do vymizení reflexu, do otvoru 30

202 630 standardní sérum o známé koncentraci antigenu, podložní sklo 1 ee vloží do vlhká komůrky a nechá se proběhnout imunoprecipitace.

Po 24 hod. ee podložní aklo 1 β agarovou vrstvou 2 vyjme, ponoří se do fyziologického roztoku o teplotě 40 až 45 °C, v němž se během 8 až 24 hod. vyperou přebytečné nepřecipitované bílkoviny z agarové vrstvy 2. Podložní sklo 1 se vyjme, opláchne dest. vodou a agarová vrstva £ se usuší, nejlépe pod filtračním papírem. Po vyschnutí se imunoprecipitace vybarví asi 10 minut roztokem 0,1 % Amidočerně 10B v 1% kyselině octové, potom se přebytek barviva opět vypere v 1% kyselině octové. Po usušení ae měří - srovnávají vzdálenosti 410 až 440 vytvořených precipitátů £1 až 44 se vzdálenosti 400 precipitátu £0 odpovídající standardu.

Pro praxi je vhodné mít k dispozici několik standard o známých koncentracích antigenů, například téhož séra v několika ředěních.

Způsob podle vynálezu se zvláště výhodně využije při depistáži snížené imunity dětí předškolního věku jako screening.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způeob imunodifuze ve vrstvě agarového nebo obdobného gelu s nehomogenně rozptýlenou protilátkou, vyznačující se tím, že se alespoň část vrstvy (2) gelu nasytí protilátkou (5), jejíž koncentrace klesá kolmo k definované přímce (3), úměrně se vzdáleností (4) od ní, a potom se vnese alespoň v jednom místě (31 až 34) s nulovou nebo nejnižší koncentrací protilátky (5) jednak vzorek antigenu, a jednak v místě (30) stejně od definované přímky (3) vzdáleném, ale ve směru přímky posunutém, odpovídající antigen o známé koncentraci, přičemž po dokončené imunoprecipitaci se zjišťuje vzdálenost (400 až 440) vytvořených precipitátů (40 až 44) od místa vnesení ve směru vzrůstu koncentrace protilátky.