CS201802B1 - Inaktivovaná adjuvantná vakcína proti Aujeszkého choroba a sposob jej přípravy - Google Patents

Description

201 802

popis vynálezu

REPUBLIKA

‘ ’ K AUTORSKÉMU OSVEDČENIU

<6Q (23) Výstavná priorita (22) Přihlášené 02 02 78 (21) PV 681-78

ÚŘAD PRO VYNÁLEZY

A OBJEVY (40) Zverejnené 29 02 80(45) Vydané 30 04 83 (51) Int. Cl? A 61 K 39/245,C 12 N 7/06 (75)

Autor vvnálezu ŽUPPA ALOJZ doc.MVDr.CSc.,BRANYIK ALEXANDER ing.CSc., 3ALAJ JURAJ MVDr., SUPPQVA JOLANDA ing., NITRAíENSIK JAROMÍR doo.MVDr.CSG.,Štěpánek jan MVDr.cso., brno

KLADKY <54) Inaktivovaná adjuvantná vakcína proti Aujeszkého choroba a sposob jej přípravy 1

Vynález ea týká inaktivovanej adjuvantnej vakcíny proti Aujeszkyho chorobě vnímavýchdruhov hospodářských a užitkových zvierat a sposobu jej přípravy.

Virus Aujeszkyho choroby vyvolává nákazlivé ochorepie u viaoerých druhov hospodářskýcha užitkových zvierat, to je ošípaných, hovádzieho dobytka, oviec, psov, mačiek a kožušino-vých zvierat, ktoré sa vyznačuje vysokou morbiditou a mortalitou a zapříčiňuje vysoké náro-dohospodářské straty. Ochranné očkovanie proti Aujeszkyho chorobě sa doposial robí prevážnepomooou živých vakoín, vyrábaných z atenuovanýoh, respektive avirulentnýoh kmenov /žuffa, A.,Grunert, Z., 1974» Les vaccines utilisés en Tcheooslovaquie contre la maladie D Aujeszky·,Cah. Méd. Vér. 4^, 334-337} Bártha, A., 1961» Kísérletek az Aujeszky-féle virus virulen-ciájának szelídítésére., Mágy. állatorv. lapja 16 /2/, 42-45/. živé vakcíny z avirulentnýohkmeňov sú neškodné a ich aplikácia v primeranej dávke vyvolává u očkovaných zvierat ochranuproti klinickému oohoreniu pri ioh kontakte s infekciou /Žuffa, A·, 1976» ?he signifikanoeoř specific prophylaxie řor control of Aujeszky*s disease·, Proč. 4-th Int. Pig Vet. Soo.Congr., Ames USA, G 10 /En/} Szabó, A., Grunert, Z., 1971« Persistence of virulent Pseudo-rabies Virus in Herds of Vaooinated and Nonvaooinated Pigs., Acta Virologioa, 15, 87-94/·Proti používaniu živých vakcín sa vyslovujú námietky, že sa nimi vnáša do chovu a populáoieošípaných infekčné agens, ktoré može u vakcinovaných zvierat přetrvával a pri přesune vak-cinováných zvierat do zdravých ohovov sprostredkoval přenos infekcie /Skoda, R·, 1976t The 201 802 201 802 2 control of Aujeszky s disease in larga ewine units by use of attenuated live vaooines. Proč 4-th Iqt. Pig Vet. šoc. Congr., Ames USA, Q 6/, Baskerville, A·, Perran, J.B., Dow, C·,1973« Aujeszky e disease in pigs·, Vet. Bull. 42/9/» 465-480/. Tieto námietky proti použí-vaniu živých vakcín sa stali opodstatněnými najma potom, čo sa dokázalo, že virus Aujeazky-ho choroby, rovnako ako iné herpetické virusy ludí a zvierat, može po primárnéj infekci!,doprevádzanej klinickým oohorenim alebo prebiehajúcej inaparentne, navodil přetrvávájúoulatentnú infekciu /Sabó, A·, Bajčáni, <J. 1976: latent pseudorabies virus infection in pigs.Acta virologica, 20, 208-214/.

Použivanie živých vakcin je preto indikované v oblastiach enzootioky zamořených Aujeszkyho vírusom, kým v oblastiach a Státooh so sporadickým výskytem Aujeszkyho choroby sa od-porúča používal vakoíny inaktivované.

Osobitný význam a uplatnenie najde účinná inaktivovaná vakcína proti Aujeszkyho cho-robě pri oohrannom očkovaní hovádzieho dobytka a ovlec. Tieto druhy zvierat sú totiž na in-fekciu Aujeszkyho vírusom velmi vnímavé, pričom ochorenie prebieha vo všetkých prípadochletálne. 2ivé vakoíny, neškodné pre najnižšie věkové kategorie uvedených druhov zvierat,musia sa preto vyrábal z avirulentnýoh kmenov s limitovanou sohopnoslou reprodukcie v orga-nizme očkovancov. To však znamená, že pri antigennej stimulaci! sa uplatňuje len malé množetvo inokulovaného vakolnačného virusu, čoho prejavom je poměrně slabá imunltná odpoveň.Prlinaktivovanej vakeíne možno do aplikačnej dávky koncentroval poměrně velká množstvo viruso-vého materiálu, ktorého antigenitu možno Sálej potencoval vazbou na vhodné adjuvans.

Inaktivované vakoíny, vyrábaná z orgánov experimentálně infikovaných zvierat, sa uká-zali ako neúčinné. Prvé pokusy o přípravu účinnej inaktivovanej vakoíny proti Aujeszkyhochorobě z virusu napestovaného na buňkových kultúraoh a inaktivovaného formaldehydom/Koch, A., Abraham, E., 1952» Immunisationsversuohe mit dem Aujeszkischen Virus., Acta vet.Hung. 11/4/, 270-279.; Suffa, A. 1963» Versuch zur Immunislrung von Laboratoriumstiereund Sohweinen mittels Pormaldehyd- und UV/Strahlen inaktieviertem Aujeszky-Virus·, Aroh.f.Exptl. Vet.-med. 17/3/, 593-613/, alebo ultrafialovými lúčmi /předtým citovaný 2uffa, Bélá-di, I·, Ivánovics, D·, 1954» Immunislerung von laboratoriumstieren mit dera Virus der Au-jeszkisohen Krankheit nach deesen Inaktivierung mit Ultraviolettstrahlen. Acta Mlorobiol.Aoad. Sci. Hung. 2/1-2/, 151-160/, s použitím gélu hydroxidu hlinitého ako adjuvans, saukázali neúspěšné. Ani rozruženle infekčnosti Aujeszkyho virusu, napestovaného na buňkovýchkultúraoh, pomocou kyseliny dusitej neviedlo k přípravě účinnej inaktivovanej vakoíny. Vovekoínaoh pripravenýoh z vírusov inaktivovanýeh pomocou saponínu /Barbinsehi, C., Papado-pol, M., 1966» Oeroetari prlvind imuzarea in boala lui Aujeszky cu vacciu preparát din vi-rus dea cultura adsorbit ai eaponinat. Luor. Inst Pasteur 111/1-1964/, 71-84/, alebo kryš-tálovej violeti /ledjalkov, S. a spol., 1968» Versuohe zur Herstellung von Vakzine gegenAujeszkysohe Krankheit aus inaktiviertem Virus. 1. Mitt. Arch. exp. Vet. Med. 22, 499-507/,nemožno vylúČil prítomnosl infekčného virusu /predtým citovaný Baskerville a spol. 1973/·Bfektivnejiou ea ukázala vakoína připravená Haralambievom a spol. /Haralambiev, H., Mermer-ski, K., Slineonov, S., 1967« Untersuohungen uber dle Zmmunogenitat der mit Aethanol inak-tivlerten Vakzine gene dle Aujeszkysohe Krankheit., Aroh. exp. Vet Med. 21/2/, 501-507/ 3 201 802 z tkenivového virusu inaktivovaného pomocou etanolu s přidáním parafínového oleje akoadjuvans. Nakolko Ida o jednoduché zmiešanie vody s olejom, dochádza po krátkodobom atátiemulzie vakcíny k rozdeleniu na vodnú a olejovú fázu. Simeonov a spol. /Simeonov, S., Va-silev, V», Jotov, M«, 1973« Sravnitelno izpitvanie na saponinovi vaksiny protiv boleettana Aujeszki., Vet. Med. Nauki 10/2/, 83-88/ nahradili olejové adjuvans saponinom. Porovná-vali účinnost troch inaktivovaných vakcín, připravených pomocou formaldehydu, kryštálovejvioleti a saponínu. Borgen, H.C., Expenaen, 1«, 1970» Immunizíng efect of photoinaotivatedpseudorabies virus., Zbl. Bekt. I. Orig», 214/1/, 13-16, předložili v uvedenej publikáoiidokaž o tom, že vystavenie Aujeszkyho virusu posobeniu ultrafialových lúčov vedle k rozru-šeniu jeho infekčnosti bez porušenia povrchových štruktúr virionov a tým k zachovaniu an-tigenity. KeSže testovanie imunizačnýoh schopností virusu inaktivovaného ultrafialovýmilúčmi sa robilo aplikáciou velkých, pre praktické účely nepoužitelných dávok, a nakolkotechnické tažkosti inaktivácie a technologické problémy spraoovania inaktivovaného virusuna vakcínu ostali nedoríešené, nenašiel tento sposob inaktivácie Aujeszkyho virusu pri vý-robě vakcíny proti Aujeszkyho chorobě praktické uplatnehie. Preukaznú imunitnú edpoveS vy-volala vakcína predstavujúca virus nepěstovaný na bunkovej kultuře stabilnej škreččej li-nie BHK-21, inaktivovaný etyletylénimínom a viazaný na dietylamínoetyl dextran /Škoda, R.,Wittmann, 6., 1973» Die Immunlsierung von Schweinen mit Vakzinen sus Inaktiviertem Aujesz-ky-Virus. Zbl. Vet. Med. B 20, 127-138/. Jednorázové podanie vakcíny ošípaným v přiměře-ných dávkách vyvolalo aktívnu tvorbu protilátok a chránenost proti infekci! definovanýmmnožstvom virulentného virusu. Neudává sa však stupen imunity po aplikácii nižších dávokvakcíny, resp. u dobytka len po dvojnásobnom očkovaní, ako sa to vyžaduje pre prakticképoužívanie vakcíny.

DeLagneau a spol. /De Lagneau, J.P., a spol. 1973: Immunisation contre la maladieD*Aujeszky a l*aide ďun nouveau vaccin huileux a virus inactivé, Rec. Méd. Vet, 151/10/,561-575/ použili pre inaktivovanie Aujeszkyho virusu, pomnoženého na bunkovej liniiIB-RS-2, klasický sposob, to je formaldehyd a pre stimulovanie antigenity virusu lipoidnéadjuvans. Dvojnásobné podanie vakcíny vyvolalo u laboratórnych zvierat a ošípaných tvorbuprotilátok v titroch 1»16 až 1»128 a chránenost proti infekci! definovaným množstvom le-tálnych dávok. Účinnú inaktivovanú vaxcinu proti Aujeszkyho chorobě připravil Genov aspol. tak, že virus inaktivoval 1,3-propiolaktónom a následné ho viazal na adjuvans pred--stavujúci gél hydroxidu hlinitého /Genov, 1., Řezačka, A·, Genová, A·, 1967» Polučavaneinaktivirana s betapropiolakton vakcina srešču boleetta na Aueski s stem Ruse/· Nedostat-kem tejto vakcíny je použitý inaktivačný prostriedok, ktorý bol vyřaděný zo zoznamu látok,použitelných pre přípravu biopreparátov, nakolko sa dokázala jeho mutagenita /Paerish,B.J., Searle, C.D., 1966» Carcinogenity of beta-propiolactone and 4-nitro quinoline N-oxi-de for the skin of guinea pig., Brit. J. Cancer 20, 200-205/.

Nevýhodou doposial navrhovaných inaktivovaných vakcín proti Aujeszkyho chorobě je, že sú připravené alebo z virusu nepěstovaného na kultúrách stabilných bunkovýoh linií, čo ovplyvňuje neškodnost vakcín pre potenciálnu onkogenitu takýchto tkaniv, alebo na primár- ných kulturách připravovaných z obličiek 1 až 3 mesačných ošípaných, čo zvyšuje výrobně 201 802 4 náklady· Okrem toho, pri doposial připravených inaktivovanýoh vakcínach proti Aujeszkyhochorobě nebol dostatečné deklarovaný imunizačný účinok pre váetky druhy vnímavých a ekono-mioky zaujímavých zvierat, pri aplikáoii rozdielnych dávok vakoíny.

Uvedené nedostatky sú riežené inaktivovanou adjuvantnou vakoínou proti Aujeszkyhochorobě vnímavých druhov hospodářských zvierat, obsahujúoou v 1 ml 10®’° až 107’$ TKID^/ml inaktivovaného virusu Aujeszkyho choroby, kmeňa Rača-TK-5, uvedeného v Seskoslovenskejzbierke mikroorganizmov na Výskumnom ústave veterinárneho lekárstva v Brně Medlánkach,Hudcova ul. 60 pod označením CCM V-95 a ΙΟ7*·* až ÍO8’^ TKID,j0/ml inaktivovaného virusuAujeszkyho choroby kmeňa Buk-TK-200 uloženého v předtým citovanej zbierke pod označenímCCM V-93, emulgovaného v lipoidno-saponínovom adjuvans a sposobom jej přípravy, pozostá-vajúcej z výběru a vhodného poměru imunogennýoh virusových kmeňov so schopnostou rásína heterológnom tkanive vzhladom k očkovancom, účinnej inaktivácie etanolom a saponínom,pri zachovaní antigenity a poměru inaktivačných látok k zmesnému antigénu vyhřátých víru- ·sových kmeňov.

Virus Aujeszkyho choroby a to kmene BUK-TK-200 a Ráče TK-5, sa osobitne pomnožujúznámým sposobom na primárných kultúrach, alebo subkultúrach kuřácích, alebo kačacíchembryonálnych buniek, narastenýoh na ékle, alebo v suspenzi!· Na kultiváciu buňkovýchkultúr použitých pre pomnoženie uvedených kmeňov Aujeszkyho virusu sa použijú vhodnéživné média, najma tie, ktoré obsahujú fragmenty bovinného mliečneho albuminu a potřebnémnožstvo oicavčích, alebo vtáčích sér /Portefield, J.S., 1967: Aniraal tissue culture, vzborníku pod edičným vedením Maramorosha, K. a Koprowského, H·, Acad· Press New York/·Nevylučuje sa použitie definovaných médií obsahujúcich látky ovplyvňujúce metabolickú amitotickú aktivitu buniek vo vrstvovýoh, alebo suspenzných kultúrach. Buňkové kultúry sainfikujú jednak kmeňom BUK-TK-200 a jednak kmeňom Rača TK-5, pri multiplicite «d 0,1 do1,0 ΤΚΙΒ^θ na jednu buňku. Po 24 až 48 hodlnovej inkubáoli infikovaných kultúr pri 37 °Csa získá pomnožený virus v objeme udržovaoieho média s infekčnými titrami pri kmeni BačaTK-5 od 10®»° až 10®’° a pri kmeni BUK-TK-200 od 107,° do ΙΟ8’5 ΤΚΠ)5ο v 1 ml suspenzie.Připravené virusové suspenzie obidvocb kmeňov Aujeszkyho virusu sa zbavia buněčného detri-tu sedimentáciou, odstředěním, alebo filtráoiou· Virusové suspenzie kmeňov Rača TK 5 aBUK-TK-200 β uvedenými hodnotami infekčnýoh titrov sa spolu zmiežajú v lubovolnom pomere,s výhodou v pomere 1:2 a následné inaktlvujú posobením etanolu vo výslednej konoentráoiiod 15 do 25 hmotovýoh peroent pri teplote 25 až 35 °C počas 18 až 72 hodin, účlnkom sapo-nínu, ktorý je súčasne adjuvansom, vo výslednej konoentráoii od 0,05 do 0,4 hmotovýohperoent pri teplote 20 až 35 °C po dobu 18 až 72 hodin, kombinovaným účinkom etanolu asaponinu v jednom roztoku, alebo následným přidáváním jednotlivých látok bezprostrednepo sebe, alebo do uplynutia 72 hodin v uvedených konoentráoiaoh počas 14 až 72 hodin vrozsahu uvedených teplot· Po kontrole inaktivácie virusu, ktorá sa uskutočni intramusku-lárnou aplikáoiou králikom v dávkaoh 2 aŽ 10 ml, sa antigény emulgujú so známými adju-vantnými olejami v definovanom pomere vodnej fáze k olejom· Lipoidno-saponínová emulziavakoíny sa stabilizuje uložením počas 12 až 24 hodin pri teplote 20 až 25 °0 a následné 5 201 aa chladí na 2 až 10 °C· Obsah adjuvantných olejov, ktoré obsahujú minerálně oleje o kiněmatickej viskositě 20.10^ až 120.10^ m2 · s”1, estery vyšších mastných kyselin, akými súlanolín, arlaoel, cereol a emulgátory typu tweenov v takom pomere, aby vytvářeli emulziuvoda v oleji, alebo voda v oleji a vo vodě, ktorých zastúpenie vo vakcíne představuje 12až 60 hmotových %, s výhodou 16 hmotových %. Příklad prevedenia

Uvedený příklad predmet vynálezu nijak neobmedzuje, ani nevyčerpáva· Primárné kultúry zkuřácích, alebo kačacích embryí, alebo ich subkultúry, vytvárajúce na povrchu skla kulti-vačných nádob súvislú jednovrstvu, sa zbavia rastového média pozostávajúceho z Earlovhoroztoku obohateného o 7 hmotových percent telacieho séra a 0,4 hmotových peroent laktalbumínhydrolyzátu, prepláchnu 2 až 3 krát ústojným fyziologickým roztokom a jednotlivo infi-kujú kmeňmi BUK-TK-200 a Rača-TK-5, uvedenými v popisnéj časti, pri multiplicite infekcie0,1 až 1,0 TKIDg0 na buňku» Infikované buňkové kultúry sa zalejú Earlovým roztokom oboha-teným o 0,3 hmotových percent laktalbumínhydrolyzátu a inkubujú počas 24 až 48 hodin pri37 °C. Po vírusspecifickej degenerácii tkaniva, určenej mikroskopicky, sa inkubácia přemi·ší a získá infekčná kvapalina, ktorá sa zbaví buněčného detritu odstředěním, alebo filtrá·ciou oez gázu. Dva objemové diely virusovéj suspenzie kmeňa Buk-TK-200 s infekčným titromnajmenej lO?*^ TKID^Q/ml a jeden objemový dlel suspenzie kmeňa Rača-TK-5 s infekčným tit-rom najmenej 10θ*° TKID^/ml sa spolu zmiešajú a k zmesnej virusověj suspenzi! sa přidáetanol do výslednej koncentrácie 20 hmotových percent a roztok saponínu o koncentrácii 10hmotových percent vo vodě do výBlednej koncentrácie 0,1 hmotových percent vo vírusovejsuspenzii. Inaktivačné prostriedky sa pridávajú v spoločnom roztoku, alebo v následnostibezprostredne po sebe· Inaktivácia prebieha počas 72 hodin pri teplote 30 °C·

Styri objemové diely zmesnej inaktivovanej vírusovej suspenzie sa zmiešajú s 0,85objemovými dielmi lahkých minerálnych olejov /například Marcol/, 0,15 objemovými dielmiesterov vyšších mastných kyselin /například Arlacel/ a s 0,02 objemovými dielmi emulgá-tora /například Tween 80/ a zmes sa emulguje miešaním v zariadení pri vysokých obrátkách,alebo pod účinkem tlaku /například Turmix, alebo Ultrathurax/ pri laboratorněj teplote po-čas 60 sekúnd. Lipoidno-saponínová emulzia vakcíny sa stabilizuje státim počas 16 hodinpri laboratórnsj teplote a následné sa skladuje pri 2 až 10 °C. Účinnosl inaktivovanej adjuvantnej vakcíny proti Aujeszkyho chorobě, podlá vynálezu,potvrdzujú výsledky v nasledujúcej tabulke, v ktorej sa uvádzajú titre virus neutralizu-júcich protilátok v krvnom sére roznych druhov zvierat vnímavých na infekciu Aujeszkyhovírusom v závislosti na množstve i.m. aplikovanej vakcíny a chránenosí proti vyvolávajú-cej infekcii definovaným množstvem smrtelných dávok.

Claims (3)

1. 201 802 6 Tabulka 1 Druh zvierat Titre VN-protilátok v krvnomsére po dvojrázovej apliká-cii ···. ml vakcíny Chránenosl proti vy-volávajúeej infekoii••IDe. u zvierat oč-kovaných ·· ml vakcíny 1 2 5 10 1 2 5 Norky 2-4 4-16 4-32 N 102 103 N Ošípané 4-16 8-32 8-64 N 103 1O4 104 Hovadzí dobytok 2-16 8-64 8-128 32-256 104 106 106 PŘED MET VYNÍLEZU 1« Inaktivovaná adjuvantná vakoína proti Aujeszkyho choroba vnímavých druhov hospodářs-kých a úžitkovýoh zvierat vyznačujúca aa tým, že v 1 ml obsahuje 10^’° až lO?’^TKIDg0/ml inaktivovaného virusu Aujeszkyho choroby kmeňa Rače-TK-5 CCM V-95 a 10?’3 až108»5 TKID(j0/ml inaktivovaného virusu Aujeszkyho choroby kmeňa Buk-TK-200 CGM V-93»emulgované v lipoidnom alebo lipoidno-saponínovom adjuvans·
2. 2. Sposob přípravy vakcíny podlá bodu 1, vyznačujúci sa tým, že sa virusové kmene Aujesz-kyho choroby pomnožujú na vrstvených alebo suspenzných primokultúrach alebo eubkultú-rach kuřácích alebo kačacích embryonálnych buniek a potom sa inaktivujú účinkom etano-lu vo výslednej koncentrácii v médiu od 10 do 25 hmotových % pri teplote 25 °C až 35 °0počas 20 až 72 hodin, alebo účinkom saponínu vo výslednej koncentrácii v médiu od 0,1do 0,33, hmotových % pri teplote 25 °C až 35 °C počas 12 až 72 hod·, alebo kombinovanýmúčinkom etanolu a saponínu v lubovolnom poradí, alebo v spoločnom roztoku v uvedenýchkoncentračnýoh pomeroch pri teplote 12 °C až 37 °C počas 12 až 72 hod· a následné saemulguje 80 až 420 ml vírusovej suspenzie v zmesi adjuvantnýoh olejov obsahujúcioh60 až 85 ml lahkých minerálnych olejov a 3 až 13 ml esterov mastných kyselin·
3. 3· Sposob přípravy vakcíny podlá bodu 2· vyznačujúci sa tým, že vytvořená emulzla sa sta-bilizuje státlm pri 12 až 25 °C počas 10 až 28 hodin a následné sa ochladí na 2 až 10 °C