CS200564B1 - Diagnostický proužek ke stanovení azokopulovatelných látek v-biologických kapalinách - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu přípravy stabilních diagnostických proužků pro důkaz a semikvantitativni stanovení azokopulovatelných látek v biologických materiálech.

Kvalitativní detekce a kvantitativní stanoveni různých součásti moče, krve, mozkomišniho moku a jiných tělních kapalin se stává v posledních letech jednou z nejdůležitějšich diagnostických metod. V mnoha případech dovoluje určit diagnosu onemocněni dřivé, než se toto projeví klinicky. Obzvláštní význam mají pak stanoveni, Jtaerá lze provést pomocí takzvaných rychlých testů, Jako jsou například diagnostické proužky, neboř tyto testy je možná použit i mimo dosah specielně vybavené laboratoře, například v ordinaci praktického lékaře, u lůžka pacienta a podobně.

Mezi diagnosticky velmi významná vyšetřeni patři mimo jiné i důkaz a kvantitativní stanoveni látek, poskytujících s diazoniovými solemi výrazně zbarvené sloučeniny. Typickými představiteli takovýchto azokopulovatelných látek v biologických materiálech, zejména moči, jsou dvě hlavni žlučová barviva, bilirubin a urolobilinogen. Dejich důkaz a kvantitativní stanoveni například v moči, dovoluje nejen podpořit diagnosu různých krevních, Jaternich nebo žlučníkových onemocněni, ale často umožňuje jako Jediná metoda rozpoznat tato onemocněni dřivé, než dojda k jejich klinické manifestaci.

<. ’ Pro citlivý, specifický důkaz a stanoveni bilirubinu v biologických materiálech je používána takzvaná Van dsn Berghova azokopulačni reakce, založená na vzniku barevné azo200 564

200 564 sloučeniny azobilirubinu, která-ee vytvoř! z bilirubinu působením vhodná diazoniové soli. Při metodách spektrofotometrických so pro tuto reakci néjčastěji používá diazotované kyselina sulfanilové, u tabletových testů pak například p-nitrobenzendlazonium-p-toluensulfonát (viz patent DE 1 102 444); v diagnostických proužcích jsou pak užívány diazoniové soli, odvozené od různé substituovaných hlavně halogenovaných anilinů, jako jsou například 2,4-dichloraniliny, 2,5-dichloraniliny nebo 2,6-dichloraniliny (viz například patenty US i 208 762 a 1 300 311 nebo patenty GB i 389 386 a 1 389 368). Ke stanoveni urobilinogenu je pak užívána analogická azokopulační reakce, avšak s použitím diazoniové soli, substituované na aromatickém jádře elektropositivními radikály,, jako.Jsou například nlžši alkylová zbytky, alkoxylové zbytky a podobné (viz patent.GB 1 343 247). Indikační zčna těchto proužků obsahujících uvedené diazoniové soli, sestává z nosiče, například filtračního papíru nebo rouna zo syntetických vláken, který byl napojen roztokem vhodné silné kyseliny jako například kyseliny šFavelová, eulfosalicylová, metafosforečná e podobně a roztokem diazoniové soli a vysušen; diazoniové sůl ee při tom může použit již jako takové ve stabilizované formě tetrafluoroborátu, p-toluensulfonátu, tetrachlorozlnečnanu a podobně (viz patenty GB 1 343 247, 1 389 366 a 1 389 368) nebo se k impregnaci nosiče použije roztok výchozího substituovaného aromatického aminu a dusitanu, takže k vytvořeni diazoniové soli dojde teprve v tomto impregnačním roztoku (viz US patenty 1 298 762 a 1 300 311 a GB patenty 1 343 248 a 1 3B9 368), čel. autorské osvědčení č. 164 557 pak popisuje možnost vytvořeni této diazoniové soli přímo ns nosiči z příslušného triazenu a vhodné kyseliny.

Ve všech těchto případech hotové proužky obsahuji vedle silné kyseliny, potřebné pro průběh azokopulační reakce, diszoniovou sůl, která, je však i ve sv,é stabilizované formě nestálá a rychle se rozkládá, jeou-li proužky vystaveny působeni vzdušné vlhkosti nebo světla. Proužky obsahující vysoce reaktivní diazoniové soli, jako jsou například soli odvozené od halogenových aromatických amidů, dávají navld reakce 1 s řadou. Jiných součásti vyšetřovaného biologického materiálu. Tak například proužky určené ke stanoveni bilirubinu v moči ee barvi v některých močích poměrně intensivně žlutě až oranžově; při visuálnlm hodnoceni takto nespecificky zbarvených proužků pak může dojit k tomu, že ee slabě růžový až fialový odstín skutečně positivní reakce na bilirubin bu3 nepostihne, nebo? je překryt silnějším oranžovým nespecifickým zbarvením, nebo naopak Jestoto nespecifická zabarveni považováno za skutečně positivní reakci.

Nyni však bylo 8 přokvapenim zjištěno, že všechny tyto nedostatky lze do značné míry odstranit, použiji-li ee k důkazu a stanoveni azokopulovatelných látek, zejména bilirubinu a urobilinogenu, v biologických kapalinách diagnostické proužky dle tohoto vynálezu, jejichž indikační zSna, sestávající z nasákavého nosiče, obsahuje kysele reagující látku, například kyselinu citrónovou, šfavelovou, amidoeulfonovou, mstafosforečnou, kyselý eiren draselný nebo arylsulfonovou kyselinu o počtu atomů uhlíku 6 až 12 a s 1 až 3 sulfonovými skupinami nebo jejich směs a triazen obecného vzorce (I),

20G 564 v němž substituenty X, Y a 2 znáči stejné nebo rozdílné atomy nebo skupiny, například vodík, halogen, nltroskupinu, alkylový nebo alkoxylový zbytek 3 l.až 3 atomy uhlíku, nebo aralkoxylový zbytek so 7 až 8 atomy uhlíku, skupinu hydroxylovou, nebo aminoskupinu popřípadě dálo ocetylovanou nebo benzoylovanou, nebo skupiny -COR nebo -SO^R, v nichž R značí hydroxylový zbytek, alkylovou nebo aminoskupinu s 1 až 2 atomy uhlíku a symboly R^ a R₂ značí nezávisle na sobě vodík, alkylový zbytek, hydroxyalkylový zbytek, karboxyalkylový zbytek nebo sulfoalkylový zbytek o 1 až 4 atomy uhlíku nebo jeden ze symbolů R^ nebo Rg představuje aromatický zbytek obočného vzorce (II),

v němž substituenty X, Y a 2 mají shora uvedený význam, přičemž alespoň jeden z nich je karboxylová nebo sulfoskupina. Tyto triazeny mohou být při tom v indikační zóně proužku obsaženy bučí volné nebo s výhodou ve formě soli s ionty alkalických kovů nebo alkalických zemin, například s ionty lithia, draslíku, sodíku, vápníku, barya nebo stroncia a podobně.

Podstata vynálezu, ve srovnáni oe současným stavem techniky, tedy spočívá v tom, že indikační část papírků dle vynálezu, neobsahuje diazonlovou sůl, ale příslušný výše definovaný triazen, ze kterého se azokopulace schopná diazoniové sůl generuje působením přítomné kysele reagující látky teprve v okamžiku použiti papírku, to znamená při namočeni do vodné biologické kapaliny. Přitom se podle účelu použití proužku volí s ohledem na substituenty X, Y ε Z takový triazon, aby z něho v okamžiku použiti vznikla diazoniové sůl, specifická pro danou azokopulovatelnou látku. Tak například proužky pro stanoveni bilirubinu obsahující s výhodou vo své indikační zóně triazen, v němž substituenty X, Y a Z tvoři elektronogativní atomy nebo skupiny, například X a 1-C1, Y = H á Z a 6-Clj naopak pro získáni proužků spocifických pro urobllinogen je výhodné použit takové triazeny, v nichž převažuji 'substituenty olektropositivní, například triazen, v němž X=Y«HaZ« 4-methoxy nebo 4-bonzyloxy skupina.

Příprava takovýchto papírků se provádí tak, že se vhodný nasákavý nosič, naimpregnuje vodným roztokem kyselin nebo jejich směsi a dokonale vysuší v proudu teplého vzduchu. Poté se na nosič nanese roztok triazenu nebo jeho soli v novodnóm rozpouštědle a nosič se opět vysuší. Oeko nevodné rozpouštědla soužící k přípravě roztoku triazenu nebo jeho soli, se při tom rozum! taková aprotické rozpouštědle, v nichž nedochází k rozkladu triazenu na příslušnou diazoniovou sůl působením H* -iontů. Typickými přiklady takovýchto rozpouštědel jsou aceton, ethylacetát, benzen, toluen, dimethylsulfoxid, dimethylformamid a jiné. Z hlediska rozpustnosti triazenů v těchto rozpouštědlech je obecně vhodnější použit směs dvou nebo více různých rozpouštědel, jako například směs dimethylsulfoxidu a acetonu nebo ethylacetátu, nebo toluenu. Takto neimpregnovaný nosič se poté rozřeše na malé ětyřúhelniky o rozměrech například 6 χ 6 mm, které se přípoji na jeden konec úzkého proužku folie z plastické hmoty, například způsobem popsaným v patentu OE 2 118 455‘<nebo patentu GB 1 073 596, Jako nasákavý nosič ja možné ve smyslu tohoto vynálezu použit jakoukoliv vhod200 564 nou a pro tento účel používanou látku, jako jo filtrační papír, rouno ze syntetických vláken, nebo konečně i tenký film porézního syntetického polymeru nebo polykondensátu. Dálo je výhodné, 1 když ne bezpodmínečné nutné, aby indikační zóna proužků podle tohoto vynálezu obsahovala ještě také některé pomocné látky, například stabilizátory, aktivátory azokopulačni reakce, takzvaná zahušfovadla a podobné. Deko 3tabilisátory, jejichž úkolem je etabilieovat diazonlovou sůl, vzniklou po namočeni proužku do vyšetřované kapaliny tak dlou ho, než zreaguje s azokopulovatelnou součásti této kapaliny se ve smyslu tohoto vynálezu rozumí známé a pro tento účel užívané sloučeniny, například kyseliny tetrefluoróborltá nebo její soli nebo kyseliny arylsulfonové, například kyseliny ρ-toluenoulfonová, kyselina 2,5-diméthýlbenzensulfonóvé, kyseliny 1,5-naftalendisulfonová a 2,7-naftalendisulfonová, kyseliny naftalentrieulfonové a podobně. 8 výhodou lze některé z těchto stabilizátorů, například kyselinu p-toluensulfonovou nebo kyseliny 1,5-naftalendieulfonovou nebo 2,7-naftelendisulfonovou, použit i jako látky, které současně vedle svého stabilisačniho účinku vytvářejí na nosiči doetatečně nizké pH, potřebné v okamžiku použiti pro přeměnu triazenu na diazonlovou sůl a pro průběh azokopulační reakce.

□ako aktivátory azokopulační reakce lze s výhodou použít například estery kyseliny fosforečné, popsané blíže v již citovaných patentech GQ l 389 366 a 1 399 366, nebo 1 vhodná smáčela, zejména anlonaktivniho typu, která obecně zvyšují rychlost proniknuti vyšetřované kapaliny do indikační zóny proužků a tím urychluji průběh přeměny triazenu na diazonlovou sůl a její reakci a azokopulovatelnou složkou vyšetřované kapaliny, navíc použitím esterů kyseliny fosforečné nebo anionaktivnich smáčedel, například laurylsulfátu, dodocylbenzensulfonátu nebo dlalkylesterů kyseliny sulfojantarové, se zyýši i intensita vzniklého zabarvení proužků při positivní reakci, čímž se docili zvýšení citlivosti použků vůči azokopulovatelné složce vyšetřované biologické kapaliny.

Vedle těchto látok může indikační zóna proužků dle tohoto vynálezu obsahovat s výhodou i některé tak zvaná zahušfovadla, což jeou filmotvorné polymerní látky přirozeného nebo syntetického původu, jako například škrob, želatina, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon a podobně. 3ejich úkolem v indikační zóně proužků jo zabránit ve fázi přípravy proužků a jejich skladování před použitím bezprostřednímu styku triazenu a kyselinami a tak zamezit předčasné přeměně triazenu na příslušnou diazonlovou sůl. Vedle této hlavni funkce však přináší jejich použiti v indikační zóně proužků i výhodu jakési egalisace, to je zvýšeni rovnoměrnosti vybarvení celé indikační plošky proužku při positivní reakci s azokopulovatelnou látkou. Tyto pomocné látky mohou být na noeič naneseny v kterékoliv z obou výše uvedených impregnaci, to je bud spolu s roztokem kysalo reagující látky, nebo jako součást roztoku triazenu v nevodném rozpouštědle. Někdy Je dokonce výhodná nanést například zahašfovsdlo ve formě samostatné třetí impregnace po naneseni kysele reagující látky pří impregnací roztokem triazenu, čímž ee docílí vo fázi výroby papírků Ještě dokonalejšího odděleni triazenu od kyeeliny e tim potlačeni jakékoliv možnooti přeměny triazenu na diazonlovou eůl dříve, Aež se proužek namočí do vyšetřované vodné kapaliny. Proti dosud známým diagnostických proužkům, které obsahuji ve své Indikační zóně diazonlovou eůl, mají proužky dle tohoto vynálezu výhodu nejen ve větší stabilitě, nebo? Jak Je obec,.4>·

200 564 ηδ znáno, Jsou triezeny - na rozdíl od diazoniových soli - látky dokonale stálé 1 za dosti nepříznivých podmínek, například působení světla, zvýšeni teploty i vzdušná vlhkosti. Navíc proužky, jejichž indikační zČna obsahuje místo dlazóniová soli shora definovaný triazen, dávají v biologických kapalinách například močí, podstatně slabší tak zvaná nespecifická reakce; v důsledku tohoto není reakce proužků dle předloženého vynálezu nepříznivá ovlivňována vznikem nespecifického, rušivého žlutého až oranžového zabarvení,

Přikladl o

Filtrační papír o plošné hmotnosti 180 g/m byl postupně nalmpregnován následujícími roztoky tak, že po každé impregnací byl dokonale vysušen v proudu vzduchu o teplotě okolo 60 °C.

Impregnační roztok 1:

1,0 g kyselina mstafosforečná 0,19 g citrónové kyselina 0,19 g šťavelová kyselino

0,33 g dvojsodná sůl neftalendisulfonové kyseliny

0,1 ml 25%niho vodného roztoku sodné soli sek-heptadecylsulfátu

0,18 g tetrafluoroboritan sodný ad 10 ml destilovaná voda.

Impregnační roztok II;

0,05 g 3-msthyl-3-eulfoethyl-l-(2,6-dichlorfenyl) trlezen 2,0 ml dimethylsulfoxid 15 ml toluen.

Po namočeni do moče obsahující alespoň 0,1 mg bilirubinu ve 100 ml se tento peplr barvi během 10 až 20 s růžově až temně karmlnově, přičemž intensita tohoto zabarveni je přímo úměrná koncentraci bilirubinu. Po namočeni do moče neobsahující bilirubin věak papír zůstane smetanově bílý a toto zbarveni ee nezmění po dobu nejméně 5 minut.

Přiklad 2

Papírky se připravuji stejným způsobem, věak s použitím těchto impregnačních roztoků:

Impregnační roztok I:

1,0 g metařosforečná kyselina 0,4 g hydrogenairan draselný

0,1 ml 25%niho vodného roztoku sodné soli sek-heptadepylsulfétu ad 10 ml HgO dest.

Impregnační roztok IX:

0,05 g 3-methyl-3-karbOxyraethyl~l~(2,4-’dlchlorfenyl) triazen 2,0 ml dimethylsulfoxid 5,0 ml aceton

200 564

10jO ml octěn ethylnatý

Vlastnosti těchto papírků jeou prakticky etejné, jako papírků připravených dle předchozího přikladu, zbarvení při positivní reakci je však fialové a v močích bez bilirubinu se berví po cca 5 min. světle žlutě. Obdobně papírky připravené s 2,4-dichlorfonyldiazonium-tetrafluoroborátem, ee za stejných podmínek barví v močích bez bilirubinu intensivně oranžově.

P ř i k 1 e d 3

Papírky připraveny s použitím následujicich impregnačních roztoků:

Impregnační roztok I:

1,0 g metef03forečné kyselina 0,2 g emidosulfonová kyselina 0,4 g citrónová kyselina

0,7 ml 25/óniho vodného roztoku sodné soli sek-heptadecylsulfétu ad 10 ml H₂0 dest.

Impregnační roztok II:

0,05 g 3-(2-kerboxy-5-sulfofenyl)-l-(2,5-dlchlorfenyl)-triazen draselné aůl 2,0 ml dimethylsulfoxid 5,0 ml octan ethylnatý 10,0 ml benzen

Takto připravené papírky dávají s bilirubinem fialově červené zabarveni e v močích bez bilirubinu se barvi jan světle žlutavě. Obdobné papírky, jejichž indikační z6na obsahuje pří slušnou diazoniovou sůl se v močích bez bilirubinu barvi téměř okamžitě sytě žlutě.

Příklad 4

Papírky připraveny s použitím těohto impregnačních roztoků:

Impregnační roztok I:

1,0 g metefoeforečné kyselina 0,4 g citrónové kyselina 0,18 g řfavelová kyselina

0,06 ml 25%niho vodnóho roztoku sodné solí esk-heptodocylsulfétu ad 10,0 ml H₂0 dest.

Impregnační roztok II:

0,05 g sodné eoli 3-methyl-3-eulfoethyl-lv(4-benzyloxyfonyl)~trlazenu 2,0 ml dimethylsulfoxid

15,0 ml toluen.

Po namočeni do moče, obsahující urobllinogen se proužky barvi karmlnově červeně, přičemž intensita tohoto zbarveni je přímo úměrná koncentraci urobilinogenu a může býtesmikvantitatlvně vyhodnocena. Ve srovnání e obdobnými proužky obsahujícími příslušnou diazoniovou eůl, jsou proužky dle vynálezu dokonale stálé za normálních podmínek e nemění evé vlast··

200 564 nosti ani po delší exposici na svčtle.

Obdobné proužky, v nichž byla sodná sůl triazen nahrazena stejným hmotovým množstvím -methoxy-fenyl)-triazenu vykazovaly naprosto

3-methyl-3-sulfoethyl-1-(4-benzyloxyfenyl) vápenaté soli 3-methyl-3-karboxymethyl-l-(4· stejné funkční vlastnosti.

pRedmEt

Claims (5)

1. pRedmEt

   VYNALEZU

   1. Diagnostický proužek ke stanovení azokopulovatelných látek v biologických kapalinách, zejména v moči, vyznačený tím, že jeho indikační zóna sestávající z nasákového nosiče, obsahuje kysele reagující látku, například kyselinu citrónovou, štavelovou, amidosulfonovou, metafosforečnou, hydrogansiran draselný nebo arylsulfonovou kyselinu o počtu uhlíků 6 až 12 a ε 1 až 3 sulfonovými skupinami nebo jojich směs a triazen Obecného vzorce I (I).

   v němž sub3tltuenty X, Y a Z značí stejné nebo rozdílně atomy nobo skupiny, například vodík, halogen, nitroskupina, alkylový zbytek nebo alkoxylový zbytek s 1 až 3 atQmy uhlíku, nebo aralkoxylový zbytek se 7 až 3 atomy uhliku, hydroxylovou skupinu, nobo aminoskupinu popřípadS dálo acotylovanou nebo benzoylovanou nebo skupiny -CORnebo SOgR.v nichž R značí hydroxylovou skupinu, alkylovou skupinu s jedním až dvěma atomy uhliku hebo aminoskupinu a symboly R^ a R₂ značí nezávisle na soba vodík, alkylový zbytek o počtu atomů uhliku 1 až 4, hydroxyalkylový zbytek o počtu atomů uhliku 1 až 4, karboxyalkylový zbytek o počtu atomů uhlíku l až 4 nebo sulfoalkylový zbytek s 1 až 4 atomy uhlíku nebo jeden ze symbolů R^ nebo R₂ představuje aromatický zbytek obecného vzorce II >

   (Π).

   v němž substituenty X, Y a Z máji shora uvedený význam, přičemž alespoň Jeden z nich je karboxylová skupina nobo sulfoskupina.
2. 2. Diagnostický proužek podle bodu 1, vyznačený tim, že obsahuje triazen ve formě soli s ionty alkalických kovů nebo alkalických zemin, například s ionty lithia, draslíku, sodíku, vápníku, barya nebo stroncla.
3. 3., Diagnostický proužek podle bodu 1 a 2, vyznačený tim, že Jeho indikační zóna obsahuje stabilizátor, například kyselinu tetrafluoroboritou nebo jeji alkalická sůl, například tetraflouroboritan sodný nebo draselný nebo kyseliny arylsulfonové, například kyselinu

   200 564 p-toluonsulfonovou nebo kyselinu 1,5-naftaleňdisulfonovou nebo2,7-naftaleňdisulfonovou
4. 4. Diagnostický proužek podle bodu 1 nobo 2 nebo 3 vyznačený tim, že Jeho indikační zóna obsahuje aktivátory azokopulačni reakce, například estery kyeeliny fpeforačné, například dioktylfosfát nobo difenylfosfát nebo anionaktlvní smáčedla, například lauryleulfát, dodecylbonzensulfát nebo dioktyloster kyseliny sulfojantarové, .
5. 5. Diagnostický proužek podlo bodu 1 nebo 2 nebo 3 nebo 4 vyznačený tim, že jeho indikační zóna obsahuje organické polymerní filmotvorné látky, například škrob, želatinu, karboxymethylcelulosu, polyvinylalkohol nebo polyvinylpyrrolidon.

   Tz 66 - 5-8301 - 82

   Cena 2,40 Kčs