CN85107547A - 微化学发光检测系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于测定热化学发光的组合物。该组合物包括血红素蛋白，发光体(如鲁米诺)和血清清蛋白。该组合物在热化学发光中可用作特殊结合配对的配位体，组合物与疑为含有特殊结合配对的抗配位体的液体样品接触，随即定量确定发光反应。特殊结合配对，例如，可以是一种酶，其基质是特殊的，或者是一种抗体，其抗原是特殊的。调整组合物及被测样品可以检测电离辐射，过氧化物对细胞的损伤，热或者特殊的细胞类型。

Description

这是在1981年4月7日申请的编号为251.694申请书的一个继续部分。

本发明是关于应用发光反应检测热、电离辐射或特殊分析物（如细胞型、抗原/抗体，或酶或它的酶作用物）的存在和/或数量，更详细地，本发明是关于一种血清清蛋白和发光体形成的复合物应用的方法;这种复合物在热、电离辐射或特殊分析物的存在下将发射光，并在量上与热，电离辐射或分析物存在量成比例。

本发明是与“不溶解交联胞毒氧化酶-过氧化物酶方法”（在下文中用缩略语“Iccoos”特指，即在1981年4月7日申请的编号为251，694的申请书）共同悬而未决的申请书为基础的。那个发明指出了一种包含两个交联酶成分，一个氧化酶和另一个过氧化物酶及此成分在控制肿瘤生成及免除疾病方面的应用。那个发明最佳实施方案是在戊二醛中交联过氧化物酶与氧化酶，和使用牛血清清蛋白作为不溶载体用于酶的交联。这个成分看来似乎起氧化目标细胞的细胞组分的作用。

已经知道包含发光氧化过氧化物酶反应的一些工艺（参看，如美国专利第3，099，605号，3，564，588号，3，880，934号，4，353，984号，和4，391，904号）。这些已知的发光氧化反应激励申请人在发光反应中使用Iccops方法，在此发光反应中，发光体被氧化而不是细胞组分，此细胞组分根据那个共同悬而未决的申请用Iccops氧化。在发光反应中的这个Iccops的应用需要氧化酶催化过氧化氢的生成，接着氧化发光体。此发光体的氧化是用过氧化酶来催化。

本发明的微量化学发光的试验方法（在下文中用缩略语“MCLAS”特指）是基于这样的发现上，即氨基苯二酰一肼，氨基苯二酰一肼衍生物，和其它的芳香的或疏水的发光化合物将以非共价键形式结合血清清蛋白，消去催化剂，例如，用Iccops维持它们高效率的发光特性将需要过氧化物酶，和氧化酶。事实上，不仅这些化合物将维持它们的发光特性，而且血清清蛋白真正显示了其所起的作为氧化物酶，过氧化物酶以及催化剂增加发光反应的效率的作用。

氨基苯二酰一肼，氨基苯二酰一肼衍生物，或芳香的或疏水的发光化合物与蛋白质的化合是不新鲜的。例如美国专利第4，104，029号公开了氨基苯二酰一肼和其它的氨基苯二酰一肼衍生物通过氨基苯二酰一肼或氨基苯二酰一肼衍生物的氨基与各种蛋白质结合成共价键。特别是，那个专利公开了戊二醛作为偶合剂通过氨基苯二酰一肼的氨基与胰岛素结合成氨基苯二酰一肼的共价键。然而，戊二醛是不能促进血清清蛋白与氨基苯二酰一肼或氨基苯二酰一肼衍生物的键合，并且那份专利也没指出一种合适的实施方法。

英国专利第2，008，247号公开了用一个抗体通过肽键合（存在的红血细胞出现时）的发光反应形成氨基苯二酰一肼的共价键。红血细胞的血红蛋白催化过氧化氢的形成，然后氧化氨基苯二酰一肼。这份参考文献还建议化学发光反应能通过改变PH值，温度，溶剂极性或通过入射电离辐射来引发。但所提文献并没有指出如何完成这些结果或该方法可能的利用。

进一步地，那里看来好象已没有理由设法在血清清蛋白和氨基苯二酰一肼或氨基苯二酰一肼衍生物之间形成复合物，因为血清清蛋白作为抑止剂作用于发光反应是已知工艺技术。例如，schroeder，H.R.等人（“监测蛋白质结合反应用化学发光”57酶学方法424，和424和439中（1978）和其中的一些参考文献，注意烷基与氨基苯二酰一肼的氨基连接导致了作为发光体的氨基苯二酰一肼效能实质性降低。其它应该注意的是，在氨基苯二酰一肼和异氨基苯二酰一肼上的氨基共价键可能减少发光到原来程度的百分之一。zellner，C.N.等人59    J.美国化学协会2580（1937）和Branchini，B.R.等人分析生物化学87（1981）。因此，所期待的将是，既使血清清蛋白与氨基苯二酰一肼连接，也将使发光反应熄灭。

在过去，曾有过血清清蛋白的催化作用的报道。例如，在LovrienR.等人，6生物化学2281（1967）中曾报道牛血清清蛋白是一个很好的催化剂，并具有催化光致变色偶氮苯化合物顺-反反应的能力，在一个与发光反应没有联系的方法中，Taylor，R.等人，95    J.美国化学协会5819（1973），再参见Sturgill，等人，485生物化学生物物理学报236（1977），曾报道过对于推动Meisenheimer络合物的分解，牛血清清蛋白是一个很好的催化剂，但人的血清清蛋白则是惰性的。在prichard    P.M.等人的31生物化学，生物物理研究委员会131（1968）中还曾报道过向一种含氨基苯二酰一肼的溶液中加一种结晶的牛血清清蛋白，其结果氨基苯二酰一肼荧光极化强度升高15倍。

早先的技术还公开了各种发光反应作为检验特殊分析物的一部分。这些方法中还常常依靠有过氧化氢（H₂O₂）存在，目的是氧化氨苯二酰一肼。因此，人们偶联一个通过氧化酶与过氧化物酶-催化的氧化/还原反应来偶联催化反应。这些反应已经在许多文献中叙述过，集中发表在Seitz.W.R.“酶分生过氧化物的化学发光检测”酶学方法445（1978）。

当发光为非共价键时，血清清蛋白在发光反应中起催化剂作用，这一发现产生了许多使用这种复合物的可能性。如对于检测热，电离辐射，和许多特殊分析物的发光试验中使用这种复合物，所有上述这些都需要一种触发光反应的手段。就本发明的血清清蛋白-氨基苯二酰一肼复合物来说，所需要的触发血清清蛋白或血清清蛋白衍生复合物的发光反应触发器是一种附加碱。如果血清清蛋白-发光体复合物是与血红素蛋白偶联的话，这样就需要附加热来作为发光反应的触发器，如果血素蛋白-血清清蛋白-发光体结合是由氧化酶来偶联的，则发光反应所需的触发器是一种存在的底物特异的氧化酶。

这些方法中的各种组分的简明性和现成可得性说明本发明的一些性质其表现的优点超过以前的试验方法。例如，多年来，用发光方法去检验葡萄糖在某些人体液中的存在已是习惯做法，见已出版发行的美国专利第3，099，605号，在那份专利文献之后的其它专利中对上述那项技术已进行改良。这个方法的相对低灵敏性，以及用这项方法来确实葡萄糖存在的数量的困难事实限制影响了这项方法的应用。用本发明则可以克服这些局限性。

其它常用的分析方法是一个通常用放射免疫测定方法（RIA）表示的方法。放射免疫测定法的特点在于其真相使用放射化学。这些化学的放射现象产生了这些反应试剂的加工、贮藏和处理的问题。本发明提出RIA特殊性在于没有附带如费用和限制可得反应试剂的问题。反应试剂的加工、贮藏和处理问题，及分离和转移具有特殊性RIA的必要步骤。

相同的RIA，生物发光试验非常敏感，并且具有不需要这方面高水平的操作者的优点和不会带来加工、贮藏、处理方面问题。然而，有非常少量的工作要由人们来完成，并且此时没有标准方法和类似方法，从一步方法到下一步方法还未做过。

连接酶免疫吸附试验（ELISA）是高度敏感的，操作是相对快的，自动操纵可以使许多样品能够同时做出化验，而且使用的反应试剂量也相当少。然而，连接酶免疫吸附剂试验（ELISA）的特点在于从同一样品再现结果是困难的。并且需要这方面专业技术高水平的操作者。而且，对酶-抗体共轭物标准化和偶联反应效率确定只是做了很少努力。荧光抗体试验也是非常敏感的，并且只需少量的反应试剂。然而，许多的控制装置和时间的耗费仍需要这方面专业高技术水平的操作者，而且，它们最好也不过是半定量，并有时只是性质上是定性的。

人们还知道对于抗体的化学发光试验中使用氨基苯二酰一肼-标记被分析物。例如，Hersh，C.S.等人的“人类免疫球蛋白G的氨基苯二酰一肼参加竞争性结合的免疫试验”（酶学方法S.P.Colowick和N.O.Kaplan，Eds，卷73免疫化学技术（1981）第608-615页）中，叙述了一个沉淀素反应，其中沉淀物是用化学发光来检验，和在非沉淀抗体-抗原复合物中采用第二个抗体或是分离剂的改良方法，更详细地，这个方法包括了氨基苯二酰一肼和免疫环蛋白G形成共价键并用一个抗免疫蛋白G抗原与氨基苯二酰一肼免疫球蛋白G共轭物混合形成沉淀，然后用高铁血红素和过氧化氢（H₂O₂）与沉淀接触使之发光。

前文中Hersh等人描述的方法已被用于氨基苯二酰一肼和其它免疫球蛋白以及人类绒毛膜促性腺激素（HCG）的偶联，和重氮化了的氢基苯二酰一肼与牛血清清蛋白和人类绒毛膜促性腺激素的偶联，后一偶联是用Simpon，J.S.A.等人279性质（伦敦）646（1979）中中所叙述的改良方法来完成的。根据包含大约十个氨基苯二酰一肼分子与每一个人类绒毛膜促性腺激素（HCG）分子以共价键连接的改良方法形成氨基苯二酰一肼-人类绒毛膜促性腺激素。这些共轭物化学发光光效率与氨基苯二酰一肼-免疫球蛋白G共轭物效率相比较是降低的。至于氨基苯二酰一肼-重氮-人类绒毛膜促性腺激素共轭物，其发光反应的效率是含有氨基苯二酰一肼-免疫球蛋白G反应效率的0.5-4%。

参照本发明的优点，如反应物的敏感性，屈曲性，廉价性和只需低技术水平的操作者。这些优点在以前这方面任何试验方法中都不存在，例如，血清清蛋白是比较便宜的，并且易获得，而且对许多生物化学化合物是惰性的。其敏感性的一个例子是这样的一个事实：按照本发明，试验处理包含在红血细胞上的植物凝血素-血清清蛋白-氨基苯二酰一肼复合物在约80渺摩尔（0.08毫沙摩尔）的被碱（如氢氧化钠）激活后反应物的限制下有一个敏感性。用通常的试验方法例如过氧化氢-微过氧化物酶或过氧化氢-高铁血红素过氧化物酶方法来获得最好敏感性是在1沙摩尔浓度时150渺摩尔（0.15毫沙摩尔）。氨基苯二酰一肼也是廉价且易得的。血清清蛋白与氨基苯二酰一肼在加工贮藏上均不会产生重要的问题。本发明适应性是很强的，具有适合于检测各种各样生物制品包括许多不是抗原的生物制品的应用。另外，本发明第一次为中间的细胞免疫性快速试验应用作了准备。现行用于超敏性的试验方法包括把氚化了胸（腺嘧啶脱氧核）苷并入淋巴细胞脱氧核糖核酸（DNA）测量，以前曾用抗原或促细胞分裂剂模拟DNA进行过试验。氘化了的胸（腺嘧啶脱氧核）苷试验需要三天的潜伏期并需使用放射性材料。使用本发明的方法，则不需要放射性材料，试验时间只需1小时。用本发明所获得的结果物是可连续再生的并能达到快速以及不需要完全受过训练的操作者。

本发明提出了一种用血清清蛋白-发光体复合物检测电离辐射，热和细胞过氧化物损份的方法。

本发明还叙述了用于发光试验中包括血红素蛋白、血清清蛋白和发光体的一个共轭物，血红素蛋白与血清清蛋白结合，发光体与血清清蛋白是非共价键结合，血红素蛋白-血清清蛋白-发光体共轭物还能够作为一种成分来使用并用于检测热的方法中。可以制作一种并合血红素蛋白-血清清蛋白-发光体共轭物的装置，用以检测热或电离辐射。

本发明还指出了一种成分和一个方法，用于对特殊键对的配位体进行定量检测，所说的特殊键对是由配位体和抗配位体组成。抗配位体包括由一个配位体与血清清蛋白结合，血红素蛋白与所说的血清清蛋白的结合，以及发光体与血清清蛋白非共价键结合所形成的复合物。并使用这个复合物去结合特殊键对的抗配位体。

本发明还叙述了一种成分和一个方法，用于检测由于刺激引起的细胞可能损伤，刺激是由细胞成分的过氧化反应引起的。

因此，本发明的目的之一在于提供一种用于定量检测热或电离辐射的方法和成分。

本发明目的之二，是提供一种定量检测细胞过氧化物损伤的方法和成分。

本发明的目的之三是提供一种用于定量检测热和电离辐射的装置。

本发明的目的之四是提供了一种成分和一个方法，用该方法定量检测特殊分析物，这里特殊分析物是特殊键对的一部分。

本发明的目的之五是提供一种定量检测特殊分析物的装置，这里特殊分析物是特殊键对的一部分。

本发明的目的之六，在于提供一种方法和成分，使用该方法定量检测特殊细胞型。

本发明的目的之七，在于提供一种定量检测特殊细胞型的装置。

本发明的目的之八，在于提供一种化学发光试验，能够用于定量检测存在于含有复细胞型流体或半固体中特殊细胞型，或能够用于定量检测存在于流体或半固体中特殊分析物，这里特殊分析物是特殊键对的一部分。

本发明的目的之九，是提供一个用于检测特殊配位体的可靠的高敏感性的简单方法，和用于该方法的一个成分。这里配位体是特殊键对的一部分，且用于检测各种配位体是廉价的，且易于适应。

本发明的目的之十，在于提供一种用于化学发光免疫测定的成分，该成分制备廉价，并能用于各种各样的抗体/抗原对。

本发明的这些目的和其它目的通过上述这些公开是明显的，并能按照下面的详细描述来完成。

附图的简要说明

图1是用曲线表示交联的血红蛋白-牛血清清蛋白（BSA）氨基苯二酰一肼凝胶的热化学发光。结果是取1毫升的凝胶悬凝液在水浴中加热并立即放在贝克曼（Beckman）LS230闪烁计数器中，其结果用在与信号波型符合的输出端输出。

图2是用曲线表示辣根过氧化物酶-牛血清清蛋白-氨基苯二酰一肼各种标记形式的红血球的热化学发光，图2中实心小黑圆点表示Landrace-Duroc杂交体猪的细胞，空心小黑圆圈表示小猪细胞，空心小方格表示Sprague-Dawley大鼠细胞，实心小方块表示人类红血细胞。实线是Landrace-Duroc数据的线性回归线。点和短线相间的线是大鼠数据的线性回归线。而短线组成的线是小猪和人类数据合并的线性回归线。

图3是用曲线表示波兰-中国（Poland-China）猪的红血细胞（RBC_S）的热化学发光。图3中，空心小圆圈表示用氨基苯二酰一肼，牛血清清蛋白（BSA）和辣根过氧化物酶（HRP）标记的红血细胞（RBC_S），图中实心小圆点表示用牛血清清蛋白（BSA）和辣根过氧化物酶（HRP）标记的红血细胞（RBC_S），并且图中空心小方格表示用戊二醛精制过的红血细胞（RBC_S）。

图4是用曲线表示氨基苯二酰一肼-牛血清清蛋白-辣根过氧化物酶标记的人类红血细胞（RBC_S）的热化学发光。图中实心小方块表示正常人类红血细胞（RBC_S）的数据，空心小圆圈表示正常红血细胞（RBC_S）对氟烷的曝光数据，实心小圆点表示用1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）处理过的红血细胞（RBC_S），且小方格表示用1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）处理过的红血细胞（RBC_S）对于氟烷的曝光。

图5是用曲线表示氟烷在用氨基苯二酰一肼和辣根过氧化物标记的Landrace-Duroc杂交体猪红血细胞的热化学反应的曝光效果。图中空心小圆圈表示未处理猪的红血细胞数据，实心小方块表示对于氟烷曝光的猪的红血细胞数据。

图6是用曲线表示2ml的交联伴刀豆球蛋白A（ConA）的溶液和含有吸收氨基苯二酰-肼的牛血清清蛋白装载着一个G-25交联葡聚糖（Sephadex）柱中馏分的化学发光。通过添加100mg的甘氨酸停止交联。

图7是用曲线表示预先用抗原活化的小鼠的鼠脾细胞的化学发光。图中实心小方块表示对照物组的数据，空心小圆圈表示细胞被活化后两天所检测的数据。而小方格表示细胞活化后四天所检测的数据。

本发明的详细描述

本发明是关于某些化合物，从种属上特指发光体，在氧化作用时的化学发光。最普通的发光体之一是氨基苯二酰一肼（5-氨基-2，3-二氢二氮杂萘-1，4-二酮），在加入强碱，氧化剂和催化剂时氨基苯二酰一肼将发光。有许多氨基苯二酰一肼的衍生物也能作为发光体，其中包括异氨基苯二酰一肼和二乙基异氨基苯二酰一肼，它们是两种比较普通的氨基苯二酰一肼衍生物。术语“氨基苯二酰一肼衍生物”指的是氨基苯二酰一肼和那些通过连在氨基苯二酰一肼的氨基邻苯二甲酰一肼上各种各样的取代基（R）取代作用所形成的化合物。那些作为最有活性的发光体的氨基苯二酰-肼衍生物是那些取代基被烷基桥键基连在异氨基苯二酰一肼的氨基上。这些衍生物包括下面这些，但不只限定这些衍生物（见下页）。

制备这些氨基苯二酰-肼衍生物的方法被概括在Schroeder，H.R.等人，57酶学方法425-445（1978）中，因此结合参考文献。使用本发明中起发光体作用的其它化合物，包括酚丙酮酸酯，吲哚-3-丙酮酸酯，色氨酸，N-乙酰色氨酸或其它色氨酸衍生物，吲哚丙酸和吲哚乙酸，但并不只限定这些。氧化发光体时所发射的光能够用发光计或闪烁计数器测量。例如：由科学应用有限公司制造的3000型积分光度计或由贝克曼仪表公司生产的LS230型贝塔（Beta）液体闪烁计数器。

各种氨基苯二酰一肼的衍生物在它们的化学活性中表现出很大的不同;例如：氨基萘基酰肼和甲状腺素-萘基酰肼的共轭物（见下表中1X）与氨基苯二酰一肼的衍生物氨基萘基酰肼相比在较低水平时就能够被检测。Schroeder，等人的上述文章第440页。下表中列出的能够起发光体作用的非氨基苯二酰一肼衍生物也表现出各种各样的发光特性。

另外，发射光反应是取绝于PH值，特别是氨基苯二酰一肼对PH值的改变是非常敏感的。在PH值约为10时能够进行其最有效率的化学发光，而在PH值小于8时其在水中只能进行少量溶解，发光反应的PH值

相关性和氨基苯二酰一肼的可溶性是具有限制化学发光技术（如在前面的试验中）实用的因素。

血清清蛋白是很丰富的血浆蛋白质，其功能之一是能运输许多微量可溶的代谢产物。血清清蛋白的三级结构是由分子的一边所形成的一个口袋。正是这个口袋帮助清蛋白起它的运输作用，因为这个口袋对于芳香的和/或疏水性的分子具有很大的亲合力。氨基苯二酰一肼和许多它的衍生物是芳香的和/或疏水的，如上表所列出能够起发光体作用的许多其它分子。本发明是根据这样一个发现为基础的，即氨基苯二酰一肼和氨基苯二酰一肼衍生物基于在这个口袋中血清清蛋白与发光体用非共价键连接的非氨基苯二酰一肼，而且这个不熄灭发光反应非共价键将导致清蛋白起到一个非常有效的发光反应催化剂作用。进一步地，就是这样一个不同于氨基苯二酰一肼的有效催化剂（上表所列的化合物）当它们用这种方式与血清清蛋白形成非共价键时还可能作发光体使用。

这里的术语“血清清蛋白”是指蛋白质的分子量（MW）＝68，000-69，000，并且其主要是血浆蛋白质成分。尽管本发明的方法和成分都指牛血清清蛋白（BSA），但是通过具有公开好处的那些专业技术应该明白，人类或从其它来源得到的血清清蛋白也应该使用这个优点。实际上，有些资料指出，血清清蛋白有能力起到催化剂的作用，根据其来源变化，如本发明中表面上看来象是这样做的，例如Taylor等人，6生物化学2281（1967）曾报道过牛血清清蛋白在人血清清蛋白是惰性时的某些应用中显示出的催化活性。

这里所用的术语“双功能交联剂”是指一种能够有效的聚合本发明试验方法中蛋白质成分的试剂。例如，下面各实施例所述的方法全部公开了戊二醛或N-琥珀酰亚胺基-3（2-吡啶基联硫基）-丙酸酯作为用以凝胶反应交联剂的应用。能被同样利用的其它双功能交联剂包括碳化二亚胺类，如：1-乙基-3-（3-二甲基-氨丙基）碳化二亚胺，琥珀酰酐，并且这些在Brown，G.B.44酶学方法，263-280（1970）中斜述时，请结合参考文献。

这里所用的术语“血红素蛋白”是指能够在参与一种催化氧化剂的生产和利用氧化剂反应的生物分子。例如：发光体的氧化反应中的过氧化物和氧化物。应用本发明所包括的血红素蛋白是有利的，但并不只限于血红蛋白，肌红蛋白，过氧化氢酶和过氧化物酶。过氧化物酶可能是辣根过氧化物酶，乳过氧化物酶，微过氧化物酶或其它过氧化物酶。术语“血红素蛋白”还指一种红血细胞的物质，这种红血细胞含有血红蛋白，并且按照本发明的指导方法，在凝胶中交联时起到血红素蛋白的作用。

这里所用术语“聚氨基化合物”是指可获得的具有两个或更多个氨基的生物分子，即可以用特殊配位醛的部分与血清清蛋白-发光体复合物的清蛋白部分共轭连接。使用本发明所包括的聚氨基化合物是有利的，但并不限定于2，6-二氨基乙酸，乙烯二胺，N-（3-氨基丙基）-1，4-丁二胺，1，2-乙二胺和腐胺（1，4-丁二胺）。

本发明的发光反应还能够适合能量传递凝胶（ETG）方法应用。能量传递凝胶（ETG）方法是在一种凝胶基质中半合成或合成酶的合成方法，这种凝胶具有将电磁能（在热紫外线电离辐射的范围内）转换成化学能或其它能级的电磁辐射（即改变了波长）的能力。能量传递凝胶是由聚合的酶，基质蛋白质或合成的酶，基质蛋白质或合成聚合物，残存的酶作用物，以及残存的（结合）溶剂所合成。在某些简单形式中，聚合基质还可以起催化剂作用。

通过溶剂和聚合基质之间的相互作用来维持凝胶状态。例如，基质可能量是带阴电荷的，而溶剂不是非质子传递溶剂（例如二甲基亚砜或丙酮）就是质子溶剂（如水）或两者的化合。完全溶胀的阴性的凝胶能用氢离子压来维持（T.Tanaka，Gels，科学美国人，Jan1981，第124-138页）。这个压力是由带阴电荷基质聚合物分子通过给定温度时的氢离子的粒子辐射所产生的力。聚合的质子的疏水键和氢离子压是两个维持凝胶状态的对峙力。通过降低刻胶的温度，或用电化学方法中和常负电（荷）基质减少氢离子含量能够使凝胶塌陷。

如果高浓度的氢离子存在于基质中，在较低的温度或使凝胶经静电场处理则将使凝胶以连续指数方式塌陷。如果用非质子溶剂取代一些质子溶剂，使氢离子浓度降低到临界水平，然后，一个极小的能量输入或输出变化将引起凝胶体积的突变。这些条件产生了一个真正的相变。T.Tanaka，I.Nishio，S-T    Sun，和S.Ueno-Nishio，电场中凝胶的坍塌，218科学467-469（1982）。这种几小时以后出现的体积上较大的物理变化证明了这种变化。

带阴电荷的基质还可以被中和交联，并用二价阳离子如钙或镁离子从基质中拆除氢离子，其结果相同，凝胶塌陷。

如果凝胶被导致到变化的边缘，即不是物理相变就是化学活性变化，都可以通过一个热障（烩变）来防止，这样，能量的输入或输出将有一个陡变的结果。如果一个化学反应用这种方式来激发或加速，就应该是一个起促进作用的动力。

氨基苯二酰一肼与牛血清清蛋白（BSA）形成的复合物形成了一个碱性的结构单元（或高分子链节），按照本发明的指导改进的碱性结构单元（或高分子链节）可以应用于能量传递凝胶（ETG）方法中。例如：能用于能量传递凝胶（ETG），方法中的牛血清清蛋白（BSA）-发光体复合物作为检验恶性体温过热的一个试验用品。这个试验用品能够用氧合血红蛋白经过在红血细胞（RBC_S）上自发的自动氧化作用的事实来制备，产生一个过氧化物，以及，过氧化氢（H₂O₂）和过氧化脂类。在红血细胞（RBC_S）上通过各种各样的内生酶（如：过氧化岐化酶，过氧化氢酶和谷光甘肽过氧化物酶）使自动氧化达到最低程度。这些内生酶可以促进这些氧化物的分解。这些酶的不足之处在于能够被制备的凝胶检测。这里凝胶是由病人的红血细胞（RBC_S）与双功能交联剂混合，然后加入血清清蛋白，血红素蛋白和发光体。加热凝胶并随着温度的增加，加热凝胶的热化学发光的指数增加大约是一个正值。表明病人忍受了从一个或多个与恶性体温过高有联系的不足之处。化学发光反应活化作用的热

可以通过在凝胶中加入碱来减少。

该方法可以由牛血清清蛋白（BSA）-发光体复合物与植物凝血素共轭来简化。植物凝血素是在某些细胞型表面发现的某些碳水化合物有特别亲合力的蛋白质或糖蛋白，特别是红血细胞（RBC_S），白血细胞和肿瘤细胞。多数是从植物中离析，但有一些是从动物例如葡萄圆蜗牛（Hetrix圆螺属）中离析。植物凝血素与血清清蛋白-发光复合体的共轭，通过增加对红血球有亲合力的血清清蛋白-发光体复合物促进了能量传递凝胶（ETG）中的交联。高温下这个制剂热化学发光的增加是恶性体温过高的一个显示器。

伴万豆球蛋白A是对红血细胞（RBC_S）和T淋巴细胞具有特殊亲合力的植物凝血素，并有利于发明中的应用。其它植物凝血素能否被使用，取决于试验中所使用的细胞型，包括大豆植物凝血素，小麦胚牙植物植物凝血素（凝集素），螺施圆口螺属植物凝血素和小扁豆植物凝血素，但并不限定这些。

用不同的植物凝血素与血清清蛋白-发光体复合物化合，与检测恶性体温高热不同，一个试验应能通过试验中应用来设计。例如：一个热化学发光试验可以通过测量热敏感性遗传缺陷、营养缺乏，或毒化合物的暴露或可以自动氧化的药物来设计，所有这些表明它们自身在过氧化氢酶、过氧化物岐化酶、葡萄糖-6-磷酸脂脱氢酶，谷光甘肽和谷光甘肽还原酶的活性方面表现为各种缺乏。或缺乏维生素E，维生素A或维生素C。这样一个试验通过用一个植物凝血素-血清清蛋白-发光体共轭物在红血细胞（RBC_S）涂层来实施，或加热涂层的红血细胞（RBC_S）。过量的热化学发光是一个由于自动氧化化学曝光引起的缺乏或损伤的可靠指示器。这样一个试验具有特殊实用性。如：借助存在一种药物试验的实施来检测自氧化药物的敏感性，用于检测敏感性的这些药物中可以实施的药物是：

毒素：

百草枯

麻醉剂：

氟烷

止痛剂：

乙酰苯胺

乙酰对氨苯乙醚

乙酰水扬酰

醋氨酚

抗惊劂药

苯妥英

苯乙酰脲

苯巴比妥

酰胺咪嗪

美芬妥英

减食欲药

氯苯丁胺

磺胺和砜

磺胺

磺胺吡啶

间苯基砜

噻唑砜

N-乙酰氨苯磺胺

水扬酰偶氮磺胺吡啶

磺乙酰胺

磺胺甲氨嗪（Kynex）

抗疟药

伯氨喹

扑疟喹啉

五喹啉

Quinocide

奎纳克林（阿的平）

非-氨苯磺胺抗菌剂

呋喃唑酮

呋喃它酮

呋喃妥英（硝基呋喃妥英）

哨基呋喃腙

氯霉素

氨基苷抗菌素

也就是：链霉素，庆大霉素，托伯拉霉素

灭滴灵

混杂的

萘

三硝基甲苯

美蓝（亚甲蓝）

萘啶酮酸

苯肼

奎宁

奎尼丁

抗坏血酸

硝咪唑

能量传递凝胶（ETG）方法能被设计成用植物凝血素-血清清蛋白-发光体共轭物识别和/或定量选择细胞型，所有这些是必要的。用对于存在所希望靶细胞表面的碳水化合物具有特殊亲合力的植物凝血素去选择。例如：血细胞含伴刀豆球蛋白A的其轭物，伴刀豆球蛋白A对红血细胞和T淋巴细胞有特殊亲合力。用一个可能被怀疑有这些细胞型的样品能将血清清蛋白与发光体交联。标记细胞（在有碱存在时将发光）其化学发光量与这些细胞型的细胞数量成正比。如果只需定量检验这些红血细胞，则化学发光反应用加热能够触发。为了检验T细胞的数量或存在或T细胞与红血细胞二者的数量与存在，植物凝血素-血清清蛋白-发光体共轭物用能量传递凝胶（ETG）方法将血红素蛋白进行交联。因此，热化学发光的敏感性将与细胞存在的数量成比例。

含有交联的血红素蛋白的能量传递凝胶（ETG）和化学发光体-血清清蛋白复合物还能当做热辐射剂量计使用。凝胶能应用于不溶解的载体基质或被包容在试管或小玻玻璃瓶中。激发发光反应需要一个热源，并且发光量与使凝胶露出的热量成正比。

血清清蛋白-发光体复合物也能直接用于定量检测细胞的过氧化反应损伤的数量。过氧化反应损伤可以由易发生的电离辐射、高温、自动氧化的化合物或过氧化反应和氧化反应酶的存在，暂时的局部缺血或炎症引起。暴露在这样的刺激物下的结果，醛基在细胞的表面形成作为糖蛋白和不饱和脂肪酸过氧化反应的产品。可溶的血清清蛋白-发光体共轭物的血清清蛋白用席夫碱反应可以连接到醛基上。过量的可溶的不与细胞结合的共轭物被洗去，当与碱接触时，结合的细胞发光体用清蛋白氧化。结果发光与暴露到过氧化反应刺激物期间形成的表面醛基的量成正比。如果血清清蛋白-发光体复合物与血红素蛋白质和聚氨基化合物耦合且共轭物被接到损坏细胞表面的醛基上，那发光反应用热来触发。为了便于进行此试验，细胞可以被连接到不溶载体基质上。例如，悬浮在适当溶剂中的红血细胞能在玻璃板上或放在小球上或塔中的其它载体上进行空气干燥，且加入共轭物和还原剂对席夫碱反应是必需的。未结合的共轭物用加入更多的溶剂来洗除，发光反应用加入碱或加热来触发，视情况不同而定。

这个方法可以改良用于测定除红血细胞（特别是巨噬细胞、单核细胞、粒细胞、肿瘤细胞、和最初建立的细胞培养株）之外细胞型的过氧化反应的损伤，它也可以被改良以便对依赖氧的抗肿瘤药能确定肿瘤和正常细胞的细胞膜的感光性，抗肿瘤药物象博菜霉素和在共同悬而未决的编号为251，694的申请中描述的Iccops系统。

抗原、抗体，或其它的蛋白质分子也可以共轭到血清清蛋白发光体复合物的血清清蛋白上。这样一个共轭物能用于定量检验特殊分析物，或配位体的数量，试验中，当特殊分析物是含有配位体和它的抗配位体的特殊键对的一部分时。这个键对可能是一种酶作用物和对此酶作用物具有专一性的酶或可能是一种抗原和对此抗原有专一性的抗体。一种特殊酶通过用一种双功能交联剂共轭到血清清蛋白-发光体复合物上，且将怀疑有使那种酶变形的酶作用物的一种溶液与酶-血清清蛋白-发光体共轭物混合。这种酶转变减少了来自酶作用物到氧的当量，产生过氧化物，和氧化发光体的过氧化物和羟基自由基。在基本条件下产生的发光的数量将直接与溶液中存在的特殊酶作用物的数量成正比。当然，血清清蛋白-发光体复合物能与酶作用物结合而不是酶。

这种方法当与脱氢酶一起使用时具有特殊实用性。例如，如果想确定血液中存在的乳酸的量，则使用乳酸脱氢酶（LDH）。可氧化的核苷酸辅助因子也是需要的。此辅助因子在乳酸脱氢酶（LDH）存在下可能是烟酰胺腺嘌吟二核苷酸（NAD），或烟酰胺腺嘌吟二核苷酸磷酸（NADP），黄素腺嘌吟二核苷酸（FAD）或黄素单核苷酸（FMN），取决于所使用的特殊脱氢酶。

发光反应也能用热来触发，如果酶（或酶作用物）与血红素蛋白质-血清清蛋白-发光体共轭物结合。当血红素蛋白质被使用时，酶转变直接减少了氧以及血红素蛋白质的当量。血清清蛋白-发光体复合物还能与抗原或抗体共轭。在有抗原/抗体键对相当的部分，交联剂和碱的存在情况下，此抗原或抗体将发光。象乙型肝炎抗原或细菌抗原这样的病毒抗原，可以通过共轭对应的抗原与它的对应抗体-血清清蛋白-发光体共轭物来测定。血红素蛋白质能与抗体/抗原-血清清蛋白-发光体共轭物共价结合且此发光反应用热而不是加碱来触发。

血清清蛋白-发光体复合物也能与蛋白质A共轭从而形成一种“通用试剂”在依靠抗体-抗原交联反应的许多试验中应用。蛋白质A从金黄色葡萄球菌的细胞壁中分离出来，且显示与几个免疫球蛋白的FC范围特殊的交联，在没有抑制抗原-抗体交联的情况下，由于蛋白质A交联到这样大数量的免疫球蛋白的能力，所以蛋白质A-血清清蛋白-发光体共轭物能够作为与抗体形成共轭物的通用试剂使用，这种抗体能用在上面已描述的现存的特殊抗原的化学发光免疫试验中，例如，细菌或乙型肝炎抗原。此抗体-蛋白质A-血清清蛋白-发光体共轭物也能与血红素蛋白质结合，这样此反应能用热而不是碱来触发。

蛋白质A-血清清蛋白-发光体共轭物能够用来检验食物样品中的细菌例如沙门氏菌标本，食物样品是一种通过把食物涂到玻璃板上或一支试管或小玻璃瓶内，然后保温用对适当细菌含有免疫球蛋白G的抗血清涂层的样品不溶载体。然后加入蛋白质A-血清清蛋白-发光体共轭物，将未结合的共轭物洗掉，且用碱触发此化学发光反应。在有细菌的情况中，例如沙门氏菌newport，S.anatum或S.typhimurium，对适当沙门氏菌H抗原（也就是对S.typhimurium的i，相1，或对S.newport或S.anatum的e，h，相1）含有抗血清的免疫球蛋白G被使用在样品用福尔马林固定到不溶物载体上。由于加热，酸，和酒精破坏了H抗原，用揭示O抗原的这些试剂中的一个固定此样品，而O抗原能用适当的抗血清来检验。

含有适当抗原的沙门氏菌细胞的可靠控制被使用。使用与上面相同的技术，这些细胞也能用来测定对H和O抗原的未知血清中的特殊抗体。当对几个抗原含有抗体的异种抗血清被使用时，适当的H或O抗原能够随着扼住抗体的抗血清一起加入从而能够识别试样中特殊抗原的存在。除沙门氏菌标本外的细菌和对鞭毛抗原，菌体抗原，荚膜抗原或膜抗原的适当抗血清或单克隆抗体可以被代入上面的对许多其它细菌设计的特殊免疫试验方法中。竞争结合试验也能使用这些方法实施。

对抗原例如乙型肝炎抗原适宜的试验也能使用蛋白质A-血清清蛋白-发光体共轭物来实施，滤纸，或乙酸纤维素圆片，用蛋白质A和血清清蛋白浸透，交联，然后涂上对乙型肝炎抗原特殊的抗体，并用冰冻干燥贮藏。当这个试验将要进行的时候，血清或血浆与蛋白质A-血清清蛋白-发光体共轭物一起被加入到滤纸或乙酸纤维素圆片上，没结合的抗血清和蛋白质A-血清清蛋白-发光体被洗去。根据加入的碱产生的化学发光量将与存在的乙型肝炎抗原量成正比。

在任何包含一个配位体键联到一个抗配位体的试验中，或是配位体或是抗配位体是由配位体/抗配位体血清清蛋白-发光体组成的共轭物的一部分，主要的是只有键联到配位体/抗配位体的共轭物才希望用其发光检验。用键联共轭物发光的简便方法是实施这个试验，以便当配位体与抗配位体的键联出现的时候包含一个相的转变。这个相的转变可以通过键联的配位体-抗配位体复合物的沉淀或凝集或者配位体及抗配位体的固定来完成。例如，在上面曾描述的免疫学试验的情况中，一个用琼脂糖A（一种附着蛋白质A的聚糖）珠粒（Pharmacia）和装载一个希望被检测确定抗原的特殊抗体装填的柱，此抗体被键联到珠粒上（也就是，是一个固定配位体），加入含有抗原（抗配位体）的液体试样，此抗配位体就键联到那个固定的抗体上了。然后把一个抗体-蛋白质A-血清清蛋白-发光体共轭物加入到这个柱里，抗体共轭物是用具有另一个确定键合抗原的特性来选择，如与键合抗原结合的共轭物、没结合的共轭物通过这个柱洗涤，馏分被洗脱且发光反应被触发。这个试验也可以通过固定抗原来实施，也就是使它与大量的蛋白质混合，且在凝胶中使其交联。相同的技术也能用于固定酶（或对于这个酶作用物）或细胞型（或优先结合到此细胞型的植物凝血素）。

本发明的化学发光反应也用于检测某些免疫兴奋剂的感光性。从患者身上选择外部的淋巴细胞和其它的单核细胞的晶胞。抗原和血清清蛋白-发光体复合物共轭，把没键联的共轭物洗掉，加入碱触发的化学发光反应加入到洗过的晶胞中，以便计算共轭物的受纳体。在现有的共轭物中晶胞的自动发光用于确定这些免疫反应晶胞的代谢物反应。此化学发光反应的大小与晶胞的细胞免疫反应成比例。

植物凝血素，抗原的蛋白质（例如象免疫球蛋白的血清清蛋白），细菌产物（象金色葡萄糖菌属，分枝杆菌蛋白质，或脂多糖中来的蛋白质A），病毒的抗原（狂犬病、麻疹、肝炎、疱疹、犬温热和猫温热的细小病毒，或人类T细胞白血病病毒），或真菌的抗原（组织胞浆菌属胶囊（Capsulatum），球孢子菌属immitis，芽生菌属，或隐球菌属新型细球菌）可以共轭到血清清蛋白-发光体复合物，以便产生特殊的化学发光的细胞的免疫刺激物。

通过各种方法完成的共轭作用取决于将要共轭到血清清蛋白-发光体复合物的分子性质。用戊二醛把血清清蛋白-发光体复合物联接到包含有一部分可接受氨基的免疫刺激物上。对于象糖蛋白或脂多糖这样的物质，共轭作用是通过氧化含有部分高碘酸盐的碳水化合物来完成其结合。蛋白质A和其它的蛋白质也能用N-琥珀酰亚胺基-3-（2-吡啶基联硫基）丙酸完成与血清清蛋白-发光体复合物的共轭结合。

血清清蛋白-发光体复合物在免疫试验的范围内的别一个应用是测量在器官移植中对同种异基因移植排斥的可能性。全部的血液是从输血者和接受者中收集的，且分离白细胞。输血者细胞的样品用一种试剂处理，从而阻止细胞的增殖。输血者的淋巴细胞在包含氚化的胸（腺嘧啶脱氧核）苷介质中与完整的接受者的淋巴细胞混合。如果接受者的细胞正在合成脱氧核糖核酸（DNA），则氚化的胸（腺嘧啶脱氧核）苷将在新近合成的脱氧核糖核酸中结合。然后这些细胞被收集到过滤纸上，且与双功能交联试剂一起加入血清清蛋白-发光体复合物。输血者细胞不能发光，而接受者细胞却能发光，因为它们是能与放射性的胸（腺嘧啶脱氧核）苷结合的唯一的细胞，且发光的数量将与由接受者细胞溶解的（³H）-胸（腺嘧啶脱氧核）苷的数量成正比。发射的光的数量将与接受者细胞对输血者细胞的免疫反应成正比。

这个试验的结果借助于氚化的细胞将发荧光（甚至没有液体闪烁混合剂）和化学发光的事实来增强。不仅发射光的数量由于它是荧光和化学发光的加和而增强，而且由于没有液体闪烁混合剂是必需的，试验的所有的组分保持最接近滤纸，所以与只有发荧光比较增加了发射光反应的效率。相似的放射性同位素示踪标记、收获和计数技术被用于把细胞组分标以¹⁴C，²⁴Na，³²P，³⁵S，⁴⁰K，和⁴⁵Ca。

血清清蛋白-发光体共轭物也能用下面方法进行自动射线照相放大。氚化的脾脏细胞以均匀的，薄层固定在一玻璃板上然后用血清清蛋白-发光体复合物和一个双功能交联试剂接触。这个玻璃板用照相软片乳剂涂层且与适当的控制板一道允许连续曝光一个时期。结果自动射线照相将在一般的自动射线照相上放大，因为照相底片容易受到一般离子辐射直接照射影响而曝光。进一步地，发光体和氨基邻苯二甲酸盐之间传递的共振能（由于在疏水键位的这些分子）导致了交联血清清蛋白，结果增加了总产量。传递效率取绝于凝胶的状态（塌陷的程度），此凝胶依次被溶量（非质子溶剂与质子溶剂的比率）、温度，和任何外部使用的电场控制。

这个方法可以适应于外围白血球、组织薄片，组织切片、肿瘤细胞，最初细胞株和建立细胞株的自动射线照相术，这个自动射线照相术也适应于⁵¹Cr，³⁵S，¹⁴C，³H，²⁴Na，³²P，⁴⁰K，⁴⁵Ca，¹⁸¹I或其它的放射性同位素标记的生物组分（也就是蛋白质，碳水化合物，类脂化合物，刺激素，细胞薄膜，或细胞器）。它也适用于使用射线照相底片在放射性同位素示踪标记电泳的聚丙烯酰胺工艺或固体载体放射免疫工艺中应用。自动射线照相技术可以通过计算银颗粒或通过在胶片上使用显象测密术（但不与试样接触）来定量。这后一工艺在固体载体放射免疫试验或放射性同位素示踪标记电泳的聚丙烯酰胺凝胶工艺应用。

根据本发明，应用血清清蛋白-发光复合物可以实施另一个试验，即测量一个试样还原了的烟酰胺腺嘌吟二核甙酸（NADH）或还原了的烟酰胺腺嘌吟磷酸二核甙（NADPH）的含量。其中，还原了的烟酰胺腺嘌吟二核甙酸（NADH）和还原了的烟酰胺腺嘌吟磷酸二核甙（NADPH）的含量能用作测量以前活细胞存在的数量，例如，在血液样品中，以前活细胞存在的数量的测量成为可能是因为还原了的烟酰胺腺嘌吟二核甙酸（NADH）与烟酰胺腺嘌吟二核甙酸（NAD）之间在给定的环境情况下保持比较稳的比率，例如在细菌细胞的情况下。在细胞死后，还原了的烟酰胺腺嘌吟二核甙酸（NADH）迅速地转变成烟酰胺腺嘌吟二核甙酸（NAD），这样存在的还原了的烟酰胺腺嘌呤二核甙酸（NADH）的量是存在样品中括细胞的数量的精确计量器。

通过使用制造能量传递凝胶（ETG）的双功能交联剂依赖高铁血红蛋的还原酶-还原了的烟酰胺腺嘌呤二核甙酸（NADH），细胞色素b₅，血红蛋白和血清清蛋白-发光体复合物，或通过添加乙二胺四乙酸（EDTA）铁代替结合的细胞色素b₅来分析还原了的烟酰胺腺嘌呤二核甙酸（NADH）含量。一条凝胶的热化学发光的标准曲线通过加热凝胶，记录各点温度的发光量和记录包含已知的还原了的烟酰胺腺嘌呤二核甙酸（NADH）数量的凝胶的相同数据来绘制，发光放射的数量上的增加与还原为了的烟酰胺腺嘌呤二核甙酸（NADH）浓缩成正比。标准曲线用于确定多批凝胶的当量。为分析还原了的烟酰胺腺嘌呤二核甙酸（NADH）的含量，通过溶解细胞来处理样品然后将样品加到能量传递凝胶（ETG）中。

预先存在试样中的活的真核细胞的数量能够通过用依靠高铁血红蛋白还原酶的还原了的烟酰胺腺嘌吟磷酸二核甙（NADPH）代替依靠高铁血红蛋白还原酶的还原了的烟酰胺腺嘌吟二核甙酸（NADH）来确定，因为还原了的烟酰胺腺嘌吟磷酸二核甙（NADPH）在活的真核细胞的细胞质中的浓度比还原了的烟酰胺腺嘌吟二核甙酸（NADH）的浓度更高。这个制剂缺少细胞色素b₅，但含有俘获在能量传递凝胶（ETG）中的黄素腺嘌吟二核甙酸（FAD）或黄素单核甙酸。在活细菌的或真核细菌的试验中，红血细胞溶血产物（有适当的蛋白质含量）能够用来代替高铁血红蛋白还原酶和血红蛋白。

本发明能通过参考下面各实施例进行更好理解，但并不只限定这些实施例。

实施例1    热辐射的检验

通过混合血红蛋白（10mg）（Sigma化学有限公司St.Louis，MO）、牛血清清蛋白（300mg）（Sigma）和在10mlPH值为6.9的磷酸盐（PBS）缓冲盐水中的氨基苯二酰一肼（Sigma）（10mg）制备ETG物系，为除去不溶解的氨基苯二酰一肼，用0.22微米细菌过滤器（Millipore）过滤此溶液。向以上所述的溶液中，加入25%的戊二醛（Sigma）100μl。在冰箱中使该溶液凝胶，并且随后在PH值为7.4凝胶∶PBS以1∶10的比例时磨细。随后，放入1ml的凝胶悬液于管形瓶中，用水浴的方法加热并且立即放入贝克曼（Beckman）LS230闪烁计数器中用与信号波型相符合的输出端输出，在附图1中给出结果。

实施例2

测定恶性过热的热化学发光试验

从具有成群的产生过热历史的Landrace-Duroc杂交猪、恶性过热近亲交配的波兰-中国猪，Sprague-Dawley大鼠和正常的人身上获得红血细胞（RBC_S）。洗涤新鲜抽取的RBC_S（含有作为阻凝剂的柠檬酸盐）以除去血浆，并且用含有戊二醛（Sigma）〔0.5%（V/V）〕的0.154 NaCl使之悬浮于PH值为6.9、0.1M的PBS中，在4℃时，同戊二醛的交联进行两小时。洗涤细胞以除去游离的戊二醛。在600×g时进行离心分离，并且再悬浮于PH值为6.9，含有1mg/ml辣根过氧化物酶〔HRP（Sigma）的Ⅳ型〕PBS和具有非共键联接的氨基苯二酰一肼的1mg/ml的BSA（Sigma）中。将以上所述的制剂在4℃时保温一夜，洗涤细胞并且将它贮存在PH值为7.4的含有D-葡萄糖（0.5%）的PBS中。

为了触发发光反应，用水浴的方法加热细胞到所希望的温度，即30℃到55℃的范围内，它们的温度误差不超过±0.2℃，并且立即使用贝克曼（BecRman）LS230液体闪烁计数器计算，并在与信号波型相符合的输出端输出。附图2给出它的结果。各个点表示了1×10⁹个细胞的三个样品的平均值。图示的标准误差为±2%。实心圆圈表示Landrace-Duroc杂交猪的细胞，空心圆圈表示小猪的细胞，空心方格Sprague-Dawley大鼠细胞并且实心方块表示人的RBC_S。实线是表示Landrace-Duroc杂交猪的细胞的线性回归线（对比系数γ＝0.979）;点划线是表示大鼠的线性回归数据（γ＝0.940）;并且虚线是表示人类和小猪合成的线性回归数据（γ＝0.959，因为他们是难以区分的，所以将他们合在一起表示）。

附图3表示由波兰-中国猪得出的RBC_S的热化学发光。空心圆圈表示了9个用氨基苯二酰一肼BSA和HRP标记过的3×10⁸个细胞的样品;实心圆点表示了9个用BSA和HRP涂层的3×10⁸个细胞的样品。并且空心方格表示了9个用戊二醛交联的3×10⁸个细胞的样品。对于使用氨基苯二酰-肼标记的由波兰-中国猪得到的RBC_S的平均标准偏差是±12.1%，分布在9.3%到17.1%的范围内;对于仅仅用戊二醛处理的细胞，它的标准偏差是±10.6%，分布在从6.6%到20.4%的范围内，并且使用BSA和HRP对细胞涂层，标准偏差是±14.7%，分布在从10.8%到18.7%的范围内。

为了用RBC_S的独立反应试剂控制发光源，加热1mgHRP/ml和具有PH为7.4的PBS的氨基苯二酰一肼的1mgBSA/ml，并且测量发光量。这些试剂的热化学发光是在水平幕上显示。

实施例3

对于缺乏谷胱甘肽的试验

用在前面实施例2中所述使用的相同方法，使用戊二醛、辣根、过氧化物酶、BSA和氨基苯二醛一肼与新鲜抽取的人类红血细胞交联。为在发光标记之前排除内生的谷胱甘肽，使用1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）预先处理人类RBC_S的多种样品。用水浴保持温度在37℃15分钟，在含有0.5mm的CDNB且PH值为6.9的PBS中完成以上所述的排除。随后，洗涤细胞并且如以上描述的那样，使用HRP、氨基苯二酰一肼和BSA标记细胞，使细胞重新悬浮于新鲜的PH值为6.9的PBS中。为检验代谢的应激物氟烷（2-溴-2氯-1∶1∶1-三氟乙烷）的效果，在热化学发光感应之前，将20μl的氟烷加入到1ml样品中去，样品为常规的和使用CDNB处理的RBC_S两种。为防止挥发性的氟烷逸出，密封闪烁管。用水浴的方法加热样品到所希望的温度，即在30℃到50℃的范围内，温度波动为±0.2℃，并且立即用贝克曼（BecRman）LS230液态闪烁计数器计算，用与信号波型符合的输出端输出，测量光辐射的数量。结果在附图4中给出。每个数据点表示三个3×10⁸细胞样品的平均值。实心方块表示正常人类RBC_S的数据，空心圆圈表示暴露在氟烷中的正常人类的RBC_S，实心圆圈表示用CDNB处理过的RBC_S，并且空心方块表示用CDNB处理过的并且暴露在氟烷中的数据。

根据从一群有恶性过热历史中得到的Land-race-Duroc的RBC_S的热化学发光，氟烷的作用也得到了试验。用如上所述的相同方法，制备细胞，并且将20μl氟烷加入到含有1×10⁹细胞1ml的细胞样品中。在附图5中给出结果。空心圈表示由没有处理的RBC_S得到的数据;实心方块表示具有氟烷加压猪的RBC_S。

实施例4

热化学发光试验作为自氧化缺乏指示器的检验

为帮助检验热化学发光试验事实上是起到自动氧化无效指示器的作用，进行了大鼠RBC_S的阻滞研究。如在上面的实施例2中和例3中描述的那样，抽取并且制备了RBC_S。随后，将过氧化歧化酶（Sigma），过氧化氢酶（Sigma）、硫酸铜（Fisher）或者亚硝酸钠（Fisher）加入到1ml细胞悬浮液中，该悬浮液是用PH值为7.4的PBS标记的大鼠RBC_S（1×10⁸个细胞）。制备五组，其中，每组为三个1ml的试样。一组三个试样放入5ug的过氧化岐化酶;一组放入60mg的过氧化氢酶;一组放入9.0μM的硫酸铜;并且一组放入33.0μM的亚硝酸钠。在热化学发光试验过程中，酶继续保持在溶液中。洗涤细胞以除去硫酸铜或者亚硝酸钠，它是通过在热化学发光试验前预先保温30分钟以离心作用或者再悬浮作用实现的。测量化学发光前，将细胞加热至50℃。下列表格表示了过氧化歧化酶、过氧化氢酶、硫酸铜和亚硝酸钠对化学发光的阻滞作用（每个数值表示三个样品的平均值）：

^＊S.D.＝标准误差;空载试管的每分钟计数为17，905±4662（N＝3）

借助于过氧化歧化酶和过氧化氢酶对化学发光反应的阻滞，分别地指出了在反应中有过氧化物、过氧化氢参与作用。硫酸铜和亚硝酸钠（它们将氧合血红蛋白转变为高铁血红蛋白，也阻滞了此反应）指出了氧合血红蛋白参与了自氧化反应。

实施例5

细胞过氧化作用损伤的测量

细胞经受过氧化作用的损伤的范围可用两种方法试验。在此试验中，1ml新鲜的从人类或其他动物得到的己肝素化的血，预先将它受到过氧化性试剂的影响，并将使之受到400×g的离心作用15分钟且在PH值为6.9、体积为十倍细胞体积的PBS中对它进行再悬浮。随后，重复以上所述的洗涤再一次对细胞施加离心作用并且使它悬浮于1ml的BSA中，该BSA用氨基苯二酰一肼饱和并且氨基苯二酰一肼是在PH值为6.9的PBS中吸收的。在4℃条件下，将细胞在以上所述的制剂中保温两个小时，随后，使用PH值为7.4的PBS洗涤三次。随后，将细胞悬浮于含有2mm氢硼化钾且PH值为7.4的PBS中，并且在冰中保温30分钟，然后，用PH值为7.4的PBS洗涤三次。

将0.1ml0.1N的NaOH加入到0.5ml的被稀释1∶20RBC_S中，并且用光度计或者闪烁计数器与信号波型符合的输出端测量辐射的光，以此来确定化学发光的数量。

在人们用牛血清清蛋白和氨基苯二酰-肼接触之前，使用氢硼化钾预处理细胞能够做出相反的调节。使用高碘酸钠过氧化细胞能够做出正的调节。用溶解在PH值为7.4的PBS中的1∶5NaIO₄处理细胞，此过程允许在冰里连续进行15分钟并且随后用PH值为7.4的PBS将细胞洗涤三次，并用在先所描述的那样，用BSA和氨基苯二酰一肼处理细胞。

该试验的第二种方法是这样实施的，用血红蛋白-BSA-氨基苯二酰一肼代替上述的BSA-氨基苯二酰一肼复合物，这个复合物是将2mg/ml具有2mg/ml    BSA的血红蛋白、1mg/ml氨基苯二酰一肼和5μl/ml在PH值为6.9的PBS中的戊二醛（25%）混合在一起制备。随后，使混合物通过0.22μ的无菌滤器（Millipore）并且在4℃时保温1小时。保温以后，通过加入100mg聚胺化合物2，6-二氨基乙酸停止交联反应。在加压条件下，将样品装入G-25Sephadex（Pharmacia）柱（48ml）。收集到4ml的馏分，将此馏分加到50℃，用热化学发光检此分馏物，并立即用光度计测量发光或用贝塔（beta）液体闪烁计数器以和信号符合的波型输出来测量发光。发光反应还可以通过加入碱，碱和过氧化氢或加热到大于42℃的任何温度来触发。

实施例6

特殊细胞型的定量识别法

被标定的红血细胞的识别如下，将0.2ml的2mg/ml植物凝血素的伴刀豆球蛋白A（ConA）、与1.6ml PH值为6.9的PBS、0.2ml的2mg/ml BSA、10μl戊二醛（25%）和2mg氨基苯二酰一肼混合起来，制备标记试剂。将以上所述的试剂通过0.22μ的微孔过滤器，并且在冰箱内保温1小时。在冰箱内保温后，加入100mg氨基乙酸停止该反应。加压条件下，将交联试样装入用PH值为7.4的PBS平衡的G-25 Sephadet（Pharmacia）柱（48ml）内，从柱中收集到4ml分馏物，并且将从4ml分馏物得到的0.5ml试样加入到1ml人类的RBC_S中，人类的RBC_S是在PH值为7.4的PBS中且RBC_S∶PBS为1∶10。在37℃条件下，上述的试剂保温15分钟。随后，细胞用PH值为7.4的PBS洗涤三次并且使之再悬浮在2mlPH值为7.4的PBS中。

将100μl0.1N的NaOH加入到0.5ml的细胞悬浮液中来触发化学发光反应，并且用光度计在6的位置计算发光反应。光度计在位置6每分钟的计数是等于贝克曼（Beckman）LS230闪烁计数器与信号波型符合的输出端的每分钟计数。结果在附图6中用曲线图表示。

实施例7    测量药剂的发光度

按照上述实施例6的方法，通过制备ConA-BAS-氨基苯二酰一肼共轭物测量每个确实有毒化合物的单独的敏感性。随后，通过用与实施例6中所公开的相同方法，用对于具有共轭物的化合物的各自灵敏性的估计来涂布红血细胞（RBC_S）。在此情况下，将涂布有共轭物的红血细胞（RBC_S）试样加热至25到50℃之间的温度，并且随后在缺少有毒化合物情况下测量该光。过度的发光是过量的过氧化物，过氧化氢和羟基自由基的产物的结果，这些引起了氨基苯二酰一肼的氧化，并且过度的发光也是敏感性的一个指示。

实施例8    鼠脾细胞的中间细胞回忆反应

通过悬浮3mg/ml氨基苯二酰一肼（Baker化学有限公司，Phillipsburg，N.J.），并且将3mg/ml牛血清清蛋白（BSA）（Sigma）溶解在PH值为7.4的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，来制备用于免疫的氨基苯二酰一肼混合物。通过新鲜制备的溶液以1∶5稀释来制备用于化学发光试验的氨基苯二酰一肼指示剂，新鲜的溶液由1mg/ml的氨基苯二酰一肼和1mg/ml在PH值为6.9的磷酸盐缓冲盐水中的牛血清清蛋白组成。这两种氨基苯二酰一肼混合物均在室温条件下制备，且为除去不溶的氨基苯二酰一肼，使它通过0.2μm    GelmanAorodisc过滤，并且在4℃和黑暗条件下保存直到使用为止。

将25～30g重的雄性CBA/J或者BALB/Cj田鼠（杰克逊实验室，Bar    Harbor，ME.）维持12/12的见光/黑暗循环，并且随意地供给食物和水。用0.5ml的食盐水（皮下或腹膜内部）来免疫对照动物，并且将0.2ml氨基苯二酰一肼-牛血清清蛋白抗原在皮下注入实验动物。

在免疫2到4天后，迅速地用软头的办法杀死田鼠并且拿出它们的脾。在具有20毫克分子（mm）的HEPES（LN-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙烷氨基基磺酸，Sigma）（PH值为7.4，20mg脾/ml Hamk的平衡盐溶液）的缓冲的室温Hamk的平衡盐溶液（HBSS）中将脾分开。在6×g条件下，将悬浮物离心分离3分钟以便除去组织碎片。通过除去锥虫蓝染料来确定细胞的生存性，并且将细胞的密度调节到8-12×10³个有生命的细胞/mm³。由一定染色载片得到的局部计数指出，悬浮液将是94～96%的淋巴细胞。

将培育的1毫升试样在暗适应玻璃管闪烁小瓶中且37℃活水浴中保温25分钟后，将100μl氨基苯二酰一肼-牛血清清蛋白抗原混合物加入到每一管形瓶中。加入氨基苯二酰一肼后，在贝克曼（Beckman）LS230液态闪烁计数器与信号波型相符合的输出端每5分钟测量一次化学发光（观察口0-100，每0.2分钟出现，逐渐增至350）。在两个读数间，维持细胞在37℃条件下。

在玻璃试管内对于主要和次要暴露于抗原之下的脾细胞对化学发光的响应列表如下：

化学发光总和    平均化学发光

组 （CPm×10⁸） （CPm×10⁸）

对照    169.4±68.7    24.2±25.9

2天    484.7±155.6    69.2±58.8

4天    1405.8±439.8    200.8±166.2

因为观察到田鼠两种变化反应没有区别，所以将数据合併在一起。化学发光值总和表示加入氨基苯二酰一肼后5分钟至35分钟的幕上面的每分钟计数（Cpm），并且平均化学发光值是加入氨基苯二酰一肼后5分钟至35分钟所有测量数据的平均值。在附图7中，用曲线法表示了它实际的结果。实心的方块表示从对照组得到的数据，空心小圆圈表示从2天组中得到的数据，并且小方格表示根据4天组得到的数据。对照组由4个田鼠组成，2天和4天组各由3只田鼠组成，并且对于每个田鼠测量7次。4天组的平均值不同于2天组和对照组的平均值;对于Dunean的多范围试验P＜0.01。

实施例9    移植体病例中同种异体移植电位的测量

从输血者和接受者两者收集10ml己肝素化的血，加入4ml Ficoll-脱氧甲氨基双乙酰氨基三碘苯甲酸葡糖醇到每个聚碳酸酯试管（16×105mm）内并且缓慢地加入2-6ml的血为一层以覆盖在Ficoll-脱氧甲氨基双乙酰氨基三碘苯甲酸葡糖醇上。在2000×g的条件下受离心作用20分钟。收集所有在液体中红细胞颗粒之上的白色细胞。加入10ml含有5%胎儿腓肠清蛋白（FcS）的平衡盐溶液，并且在300～350×g的条件下受离心作用15分钟。洗涤两次并且在250×g条件下受离心作用10分钟。在犁刀细胞计数器上计数细胞并且调节细胞密度至1-6×10⁷个细胞/ml。对于每毫升的平衡盐溶液中的细胞悬浮液加入25μg的丝裂霉素C（50μl的0.5mg/ml膜片过滤过的，灭菌的丝裂霉素C溶液）。在暗处，在37℃的条件下将以上所述的溶液保温20分钟。象以前一样，用平衡的含有5%胎儿腓肠清蛋白的盐溶液洗涤3次。调节未处理的响应细胞的和抑制激物的密度，并且响应细胞在每分钟转数指示器（RPMI）1640中补充介质至2×10⁶个细胞/ml，介质有L-

氨酰胺、丙铜酸钠、非必需的氨基酸和5%胎儿腓肠清蛋白。为控制繁殖，将0.5ml没有被抑制的响应细胞和0.5ml被抑制的响应细胞混合在一个12×75mm的繁殖试管中。为试验繁殖，将0.5ml未处理的响应细胞和0.5ml处理过的刺激细胞混合在一起。

将试管放置在一倾斜试管架上并且在温度为37℃，空气中具有5%二氧化碳的大气压力的调湿恒温箱中保温。脉冲振动每个具有0.1ml氚化（³H）一胸腺嘧啶脱氧核甙（1-2微居里）的培养物72～96小时。

按以下步骤收取细胞：旋转以后，为从每一培养物悬浮液中除去细胞组织物质，利用固定在真空过滤机上的微孔（0.45mm）分离过滤器过滤。将2毫升冷的平衡盐溶液加入到每一个试管中去，随后旋转它。所含成份涌到过滤器上。重复以上所述的过程。随后，在过滤器中，用10ml的三氯乙酸（10%）连续地将细胞洗涤两次。随后，用2ml95%乙醇或者无水甲醇连续地将滤器洗涤三次。

用氨基苯二酰一肼饱和30mg/ml的牛血清清蛋白溶液，来制备水溶液（在先为除去不可溶的氨基苯二酰一肼而用0.22μm的过滤器过滤溶液）并且将该溶液的PH值调至6.9。对以上所述的溶液每ml溶液中加入20μl的戊二醛（25%）。将溶液通过过滤器10分钟或者直至过滤速度至少降低50%为止。该滤液用无水甲醇再脱水，干燥并且用贝塔闪烁计数器计数。为确定计数效率和抑制，在圆片上，必须制备含有已知一定数量的放射性同位素物质（³H-标记）的样品。

实施例10    放射自显影的放大

用振荡器上的调湿细胞培养恒温箱内，37℃条件下保温大约6个小时，使用³H-胸腺嘧啶脱氧核甙（10μCi/ml繁殖培养基中）来标记脾细胞。将细胞从培养盘移入试管内并且用1毫克分子标记过的胸（腺嘧啶脱氧核）甙洗涤两次。将细胞离心过滤并且悬浮在Hank的平衡盐溶液中且密度为1-2×10⁶个细胞/ml。在涂有0.5%琼脂糖载片的中央，放置0.1ml的细胞试样。对于这个试样加0.1ml乙酸（2%）。通过在凝胶表面滚动一小的玻璃棒，将试样和乙酸同时散开成为一薄层。将载片若干次迅速通过弱火焰，以此来干燥它。干燥并且冷却后，为除去盐，在蒸馏水中使载片湿洗20次。随后，在载片上涂上蒸馏水中的牛血清清蛋白-氨基苯二酰一肼请合物1mg/ml，象上面一样，试样在弱火焰上干燥。随后，将载片上涂上戊二醛（5%）并且在4℃条件下使它固定30分钟。再一次在4℃的蒸馏水中洗涤载片。将载片加热至室温后，在安全灯条件下，利用标准工艺浸洗，将载片上涂薄膜影片乳胶（NTB-2核痕迹乳胶，Eastman Kodak）（参看J.Watson的脾细胞培养放射自显影法，它在细胞的免疫学的方法中，由B.Mishell和S.M.shiigi，Eds，San Francisco：W.H.Freeman和有限公司收集的1980年第166页-172页）。

在不超过7天时间，允许进行放射自显影谱曝光。几种对照载玻片应该是显影时间超过曝光时间，它是利用标准的方法（根据Eastman    Kodak的D-19显影液）显影，即在16℃时显影3-5分钟并且迅速地定影8-10分钟。

实施例11    对特异和非特异免疫刺激物，鼠脾细胞氧化的响应

用上面实施例8所描述方法，制备鼠脾细胞，并且它从CBA-J田鼠中得到的，该田鼠或用0.6mg的牛血清清蛋白（BSA），0.2ml的羊红血细胞溶液（RBC_S），0.2ml的完全的弗洛因德佐剂或用具有牛血清清蛋白的弗洛因德佐剂免疫过。在制备脾细胞时需要具有牛血清清蛋白，并且对于牛血清清蛋白，氨基苯二酰一肼用实施例8相同的方法被吸收。

根据这些用弗洛因德佐剂，牛血清清蛋白或未用牛血清清蛋白免疫过的田鼠细胞，记录化学发光的最大量。根据变化使用牛血清清蛋白和单红血细胞免疫田鼠脾细胞得到化学发光反应，它显示了对于牛血清清蛋白，特异和非特异的淋巴细胞氧化后响应的结合。

实施例12    对E.CoLI抗原、人类淋巴细胞

氧化的响应

通过Ficoll-脱氧甲氨基双乙酰氨基三碘苯甲酸葡糖醇方法，从10ml新鲜收集的且己肝素化的全部血液中收集外围人类淋巴细胞（和其它单核细胞）。将细胞悬浮在PH值为7.4的HEPES-平衡盐溶液中，并且密度为10⁶个细胞/ml;随后，将它暴露于E.COLi脂多糖（LPS）-牛血清清蛋白-氨基苯二酰一肼共轭物中，并且象在实施例8中描述的那样记录发光。

E.CoLi脂多糖（LPS）抗原-牛血清清蛋白-氨基苯二酰一肼共轭物的形成如下所述，将2mg/ml的E。CoLi脂多糖（LPS）溶液，从埃希氏杆菌属CoLi得到的类脂多糖在20ml的50毫克分子（mm）乙酸盐缓冲剂中稀释PH值为5.6，并且将它们同含有40毫克分子（mm）KIO₄的高碘酸盐溶液混合在一起。在25℃条件下，搅拌溶液4小时。加入0.025ml的1，2-亚乙基二醇（0.45毫克分子（mm））来终止反应的进行，并且搅动30分钟以上。相对于50mm的（PH值为5.59）乙酸盐渗析溶液，直至没有进一步的渗析物出现为止。渗析过的类脂多糖同相等体积的含有2mg/ml的牛血清清蛋白的水混合。用0.1N的NaoH调节溶液的PH值为9并且在25℃条件下搅拌1小时。随后，将溶液的PH值用0.1N盐酸调至7.0。

向上述的溶液中每毫升加入1mg氨基苯二酰一肼。搅拌混合物30分钟并且随后用0.22μ的微孔过滤器过滤。为除去游离的氨基苯二酰一肼，将滤液通过G-25    Sephadex柱。通过对在固体载体上的固相E.CoLiO抗原（脂多糖）特异的抗体的键合分析馏分，然后用碱（0.1N    NaoH）把固体载体转变成活性发光。用前面描述相同的方法，以液态闪烁计数器来测量发光。

实施例13    用于化学发光免疫试验中的

一般试剂的制备

通过改良A.Surolia和D.Pain〔卷73，免疫化学技术，J.J.Langone    and    H.Von    Vunakis，Eds，New    York：Academic    Press，第183-191（1981）〕所叙述的方法，将蛋白质A与牛血清清蛋白连接。将BSA（2.0mg）溶解在0.2mlPH值为7.5的PBS中并且将它们同0.2ml溶解于乙醇（700μg/ml）的N-琥珀酰亚胺基-3（2-吡啶二硫代）-丙酸（SPDP）混合在一起。逐滴加入SPDP并搅拌，并且此后在25℃条件下不时地搅拌溶液超过30分钟。

用已被PH值为7.5的PBS平衡的G-25    Sephadex柱进行凝胶过滤以除去过剩的试剂和低分子量反应物。将分馏物收集起来，并且通过超滤作用使它浓缩至0.3ml。用类似的方法制备蛋白质A，即利用1.42mg的蛋白质A和0.06ml的SPDP溶液，SPDP溶液为在每毫升乙醇中具有700mg的SPDP。在G-25柱上凝胶过滤后，收集分馏物并且将之浓缩至0.3ml。

在最后浓缩0.5M获得的硫醇处理的BSA产物时，用二硫代苏糖醇（DTT）来减少2-吡啶基二硫化物的组分。使用G-25凝胶过滤，以除去多余的DTT和吡啶-2-硫酮。硫醇处理的牛血清清蛋白和含有蛋白质A的2-吡啶基二硫化物在25℃条件下混合20小时。随后，每毫升共轭物加入1mg的氨基苯二酰一肼，如在上面实施例12中所描述的那样用G-25    Sephadex柱（48ml）进行凝胶过滤。

对于蛋白质A-牛血清清蛋白-氨基苯二酰一肼共轭物，通过加入0.2ml已给出的分馏物到含有与特异抗原键合的（例如，过氧化酶和抗过氧化物抗体）γ-球蛋白的固体载体中，以此来检验分馏物。在固体表面上，在25℃条件下，将分馏物保温30分钟并且用PH值为7.4的磷酸盐缓冲盐水（PBS）除去没有键合的物质。用0.1N    NaOH覆盖固体载体并且测量发光，能够确定分馏物中蛋白质A-牛血清清蛋白-氨基苯二酰一肼共轭物的存在。

实施例14    化学发光免疫测定中一般试剂的使用

通过甲醇或者固定酸（例如：2%乙酸）中的任何一种，将人类红血细胞（RBC_S）附在显微镜载片上，两种方法都是已知技术。含有在红血细胞上有特异抗原的位置的抗体的怀疑血清在涂层载片的表面上保温，时间为30分钟到2小时，温度为室温（或在4℃过夜）。随后，为除去没有固定的抗体，使用PH值为7.4的磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗载片。

按照以上实施例13描述的方法制备的蛋白质A-牛血清清蛋白-氨基苯二酰一肼共轭物，随后被加在载片表面上，该载片是在带有PH值为7.4的磷酸盐缓冲盐水溶液中。在室温条件下，（或者在4℃条件下，过夜）将载片保温30分钟至2小时并且用PH值为7.4的磷酸盐缓冲盐水洗涤去游离的试剂。使用0.1N    NaoH浸渍载片，以此来引发发光反应。

实施例15    食物中的沙门氏菌属TYPHIMNRIUM的测定

将已经均匀的或者已液化的食物试样放置在玻璃载片上或者在试管或管形瓶中。将试样干燥并且用10%缓冲PH值为7.4的甲醛水固定。将试样载片缓慢地用PH值为7.4的磷酸盐缓冲盐水洗涤，并且在空气中干燥它。随后，用1∶1000稀释的免疫球蛋白G覆盖在载片上的试样上，该免疫球蛋白G中含有用i的抗血清，S.typhimurium的抗原1H相。在37℃条件下，将试样在调湿箱中保温1小时。用含有1%BSA，PH值为7.4的PBS洗去未键合的抗体。然后，用上述实施例13的方法制备试样，用溶液涂盖该试样，该溶液每ml含有在PH值为7.6的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的蛋白质A-牛血清清蛋白（BSA）-氨基苯二酰一肼共轭物10μg，将试样在37℃条件下保温30分钟，并且为除去游离的蛋白质A-牛血清清蛋白（BSA）-氨基苯二酰一肼，用PH值为7.6的磷酸盐缓冲盐水（PBS）连续地洗涤它。将载片在空气中干燥。用0.1N    NaoH浸渍载片表面，以此使试样被活化，并且象以上描述的那样测量化学发光。

实施例16    乙型肝炎抗原的检测

为形成凝胶，将蛋白质A和具有足够浓度的用戊二醛的交联的牛血清清蛋白（BSA）在过滤纸或者醋纤维盘浸渍。在形成凝胶以前，将含有凝胶组分的溶液加力使之进入滤盘内。凝胶以后，用每ml含有100mg的氨基乙酸的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（PH值为6.9）洗涤该盘。将该盘脱水并且在-40℃条件下贮藏在冷藏箱内，直至利用为止。用抗乙型肝炎抗原抗体涂该盘，当准备利用时，将该盘在1∶1000的抗体与PBS稀释物稀释PH值为7.4在4℃条件下保温一夜。用含有1%牛血清清蛋白（BSA）PH值为7.4的磷酸盐缓冲盐水（PBS）使该盘湿透20次，以此来洗涤盘子。为延长贮藏期，应在-70℃条件下将该盘冻干或者在4℃条件下保持湿润。

为了检验乙型肝炎抗原将血清或者血浆（0.1ml）加入到该盘上，并且在37℃条件下，在调湿容器内保温1小时。随后，用PH值为7.4的PBS使它湿透20次，洗涤该盘。跟着以上所述的洗涤，再一次将具有抗乙型肝炎抗原抗体的该盘在37℃条件下，在调湿容器内保温1小时。再一次使用PH值为7.4的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤该盘。最后，将在上面实施例13中描述的那样制备的蛋白质A-牛血清清蛋白-氨基苯二酰一肼共轭物（0.1ml）加入到该盘，并且在37℃条件下保温30分钟。再一次洗涤盘了，以除去未键合的蛋白质A-牛血清清蛋白-氨基苯二酰一肼。加入0.1ml的0.1N    NaoH到盘子表面以此触发化学发光反应，并且用贝塔-闪烁计数器在与信号符合的波型输出端输出。

实施例17    乙醇含量的测定

首先偶合N⁶-〔N-（6-氨基乙基）氨基甲酰基甲基〕-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸到乙醇脱氢酶中，以便制备测定乙醇的脱氢酶发光凝胶。对于以所述的偶合的方法是M.O.Mansson，PO.Larsson和K.Mosbach描述的方法的一个改良方法〔欧州生物化学期刊第86期，第455-463页（1978）〕。简要地说，对用于乙醇脱氢酶，该方法如下：

（1）产物的偶合和净化是在4℃的条件下。

（2）将净化过的马肝乙醇脱氢酶（5mg）加入到1.3ml50mm三乙醇胺缓冲剂〔PH值为7.5，含有5mmN⁶-〔N-（6-氨基乙基）氨基甲酰基甲基〕-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸〕中去。

（3）将偶合剂1-乙基-3（3-二甲基-氨基异丙基）-碳化二亚胺氢氯化物和N-羟基琥珀酰亚胺分别增浓到50mm和25mm的最后浓度。

（4）以12小时间隔，分别加入4等份碳化二亚胺并且将N-羟基琥珀酰亚胺分为二等份在0时和12小时加入。

（5）总共偶合48小时之后，用NaoH调节PH值至7.5，将氨基乙酸缓冲剂（PH值为7.5）增浓到0.1M的最后浓度，并且允许它同剩余的碳化二亚胺或者激活后的羧酸基反应。

（6）随后，将反应溶液渗析15小时，渗析是逆着三个3-升替换在0.05M碳酸氢钠缓冲剂中的0.05M氨基乙酸，PH为7.5。

（7）随后，将反应溶液施加到Sephacryl    S-200（Pharmacia）柱（1×95Cm）中，并且该柱是用PH值为7.5的0.05M的碳酸氢盐缓冲剂平衡的。收集含有蛋白质的馏分，并且逆着4升碳酸氢盐缓冲剂渗析一夜。

将乙醇脱氢酶-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）复合物（0.3mg）同10mg辣根过氧化物（HRP）和30mg的牛血清清蛋白（BSA）-氨基苯二酰一肼复合物混合在一起。以上所述的制剂（除去用辣根过氧化物（HRP）来取代实施例1制剂中的血红蛋白外）由实施例1的方法制备。向以上所述的每毫升溶液中加入20μl的戊二醛（25%）。

将溶液吸收在过滤纸上（或者散布在塑料或酸清洁过的玻璃载片上，或者条状盖板上，或者在10×50mm试管内）。允许溶液形成凝胶，涂布在惰性载体上面，并且在4℃条件下，在调湿箱内超过一夜。在该凝胶中加入含有乙醇的试样导致化学发光反应，反应的亮度是直接与在试样中的乙醇浓度成正比例。通过制备一些已知浓度的乙醇溶液，加入到凝胶表面并且测量辐射的光，以此来绘制一标准的曲线。对于如此做法，将50μM-10mM范围剂量的乙醇加入到溶液中去，该溶液含有在PH值为8.0的0.2M磷酸钾缓冲剂中的7mM的Lactaldehyele，并且在30℃条件下，将每一种溶液都加入到凝胶表面。

实施例18    用测定NADH含量的方法测定

有生存力的细菌

使用在上面实施例13中描述方法相类似的方法，将高铁血红蛋白还原酶（1mg/ml）和细胞色素b₅（1mg/ml）与SPDP偶合。在此方法中的唯一的不同就是高铁血红蛋白还原酶代替了在实施例13描述方法中的蛋白质A。跟着进行G-25Sephadex凝胶过滤，收集含有细胞色素b₅的分馏物（根据在405nm波长时光的吸收，波长通过分光光度计测量过的）。用超滤方法将这些分馏物浓缩至1ml的蛋白质溶液。将此浓缩物加入到9ml PH值为6.9的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，磷酸盐缓冲盐水中每毫升有牛血清清蛋白-氨基苯二酰一肼30mg和血红蛋白1mg。下一步，通过搅拌，将双功能偶合试剂戊二醛（每毫升中有20μl的25%戊二醛）同该溶液混合。在25℃条件下，能够用0.5毫摩尔/毫升铁-乙二胺四鲸蜡醇酸（EDTA）混合物（里面加入了牛血清清蛋白-氨基苯二酰一肼复合物）代替细胞色素b₅。将形成的凝胶用于使过滤纸、涂布玻璃或者塑料载片饱和，或者形成独立式的凝胶。用蒸馏水通过使凝胶湿透或者使用烧结玻璃滤纸来洗涤凝胶。用细胞组织研磨机在具有10倍凝胶体积的蒸馏水中研磨此独立式的凝胶。通过悬浮和离心作用（300×g，10分钟），用蒸馏水洗涤凝胶3次。将凝胶从25℃加热至50℃并且每隔一温度记录光的辐射量，随后，以温度作为发光的函数，能够做出标准的热化学发光曲线。以上所述的过程用新鲜的凝胶在悬浮液或者涂布溶液中重复，涂布溶液由50nM到10mM浓度范围的NADH组成（在PH值为7.5的磷酸盐缓冲剂中）。在给定温度条件下，热化学发光的增加同NADH浓度成正比例。

为确定在试样中富有生命的细菌的细胞，首先利用已知的方法用洗涤物质溶解（Lgsed）细胞，并且将含有被溶解的细胞的溶液加入到凝胶中，还原了的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）释放出来的量是直接依赖于在试样中预先存在的富有生命力细胞的数量，因此，在化学发光反应期间辐射光的量是与在试样中预先存在的富有生命力细胞的数量成正比。

以上这些实施例是本发明目前最佳实施例的用途举例，但是并不用方法来限定。

勘误表

Claims (201)

1、一种测定电离辐射的装置，包括：

一种发光物；

血清清蛋白，为形成发光物-血清清蛋白复合物，所说的发光物是以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白；

一种双功能交联剂；和

一种不可溶的载体基质，将所说的发光物-血清清蛋白复合物用所说的双功能交联剂交联在所说的不可溶载体基质上。

2、权利要求1的装置，其中，所说的发光物从氨基苯二酰一肼衍生物、苯酚丙酮酸盐、吲哚丙酸、吲哚乙酸、吲哚-3-丙酮酸盐、β-吲哚基丙氨酸、N-乙酰基-β-吲哚基丙氨酸和其它的β-吲哚基丙氨酸衍生物组成的一组中选出。

3、权利要求1的装置，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼衍生物。

4、权利要求1的装置，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼。

5、权利要求1的装置，其中，所说的双功能交联剂从戊二醛、碳化二亚胺、琥珀酰酐和N-琥珀酰亚胺基-3-〔2-吡啶基二硫代〕-丙酸组成的一组中选出。

6、权利要求1的装置，其中，所说的双功能交联剂是戊二醛。

7、一种测定电离辐射的装置，包括：

由血红素蛋白、血清清蛋白和发光物构成的共轭物，所说的发光物是以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白;

一种双功能交联剂;和

一种不可溶载体基质，所说的共轭物是用所说的双功能交联剂将它交联在所说的不可溶载体基质上。

8、权利要求7的装置，其中，所说的发光物从氨基苯二酰一肼衍生物、苯酚丙酮酸盐、吲哚-3-丙酮酸盐、β-吲哚基丙氨酸、N-乙酰基-β-吲哚基丙氨酸和其它的吲哚基酸衍生物、吲哚丙酸和吲哚乙酸组成的一组中选出。

9、权利要求7的装置，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼衍生物。

10、权利要求7的装置，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼。

11、权利要求7的装置，其中，所说的血红素蛋白是从血红蛋白、肌红蛋白和过氧化酶组成的一组中选出。

12、权利要求7的装置，其中，所说的双功能交联剂从戊二醛、碳化二亚胺、琥珀酰酐和N-琥珀酰亚胺基-3-〔2-吡啶基二硫代〕-丙酸组成的一组中选出。

13、权利要求7的装置，其中，所说的双功能交联剂是戊二醛。

14、一种测定电离辐射的成份，包括一种共轭物，所说的共轭物由血红素蛋白、发光物、和血清清蛋白组成，所说的发光物是以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白，并且所说的共轭物是用双功能交联剂交联，以形成凝胶。

15、权利要求14的成份，其中，所说的发光物从氨基苯二酰一肼衍生物、苯酚丙酮酸盐、吲哚-3-丙酮酸盐、β-吲哚基丙氨酸、N-乙酰基β-吲哚基丙氨酸和其它的吲哚基酸衍生物、吲哚丙酸和吲哚乙酸组成的一组中选出。

16、权利要求14的成份，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼衍生物。

17、权利要求14的成份，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼。

18、权利要求14的成份，其中，所说的双功能交联剂从戊二醛、碳化二亚胺、琥珀酰酐和N-琥珀酰亚胺基-3-〔2-吡啶基二硫代〕-丙酸组成的一组中选出。

19、权利要求14的成份，其中，所说的双功能交联剂是戊二醛。

20、权利要求14的成份，其中，所说的血红素蛋白是从血红蛋白、肌红蛋白和过氧化酶组成的一组中选出。

21、权利要求14的成份，其中，所说的血红素蛋白是血红蛋白。

22、权利要求14的成份，其中，所说的血红素蛋白是过氧化酶。

23、一种测定电离辐射的成份，包括一种共轭物，所说的共轭物由血红蛋白、氨基苯二酰一肼和血清清蛋白组成，所说的氨基苯二酰一肼是以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白，并且所说的血红蛋白键合于所说的血清清蛋白，并且所说的共轭物是用双功能交联剂交联，以形成凝胶。

24、一种测定电离辐射的成份，包括一种共轭物，所说的共轭物由过氧化酶、氨基苯二酰一肼和血清清蛋白组成，所说的氨基苯二酰一肼是以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白，并且所说的过氧化酶键合于所说的血清清蛋白，并且所说的共轭物是用双功能交联剂交联，以形成凝胶。

25、一种测定电离辐射的方法，包括：

混合发光物、血红素蛋白和血清清蛋白，它是在加速所说的血清清蛋白以非共价键形式键于所说的发光物的条件下，以此形成血红素蛋白-血清清蛋白-发光物的共轭物;

为形成凝胶，用双功能交联剂接触所说的共轭物;和

使所说的凝胶暴露于怀疑的电离辐射源。

26、权利要求25的方法，其中，所说的发光物从氨基苯二酰一肼衍生物、苯酚丙酮酸盐、吲哚-3-丙酮酸盐、β-吲哚基丙氨酸、N-乙酰基-β-吲哚基丙氨酸和其它的吲哚基酸衍生物、吲哚丙酸和吲哚乙酸组成的一组中选出。

27、权利要求25的方法，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼衍生物。

28、权利要求25的方法，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼。

29、权利要求25的方法，其中，所说的血红素蛋白是从血红蛋白、肌红蛋白和过氧化酶组成的一组中选出。

30、权利要求25的方法，其中，所说的血红素蛋白是血红蛋白。

31、权利要求25的方法，其中，所说的血红素蛋白是过氧化酶。

32、权利要求25的方法，其中，将凝胶加在一种不可溶载体基质上。

33、权利要求25的方法，其中，所说的双功能交联剂从戊二醛、碳化二亚胺、琥珀酰酐和N-琥珀酰亚胺基-3-〔2-吡啶基二硫代〕-丙酸组成的一组中选出。

34、权利要求25的方法，其中，所说的双功能交联剂是戊二醛。

35、一种测定电离辐射的方法，包括：

混合氨基苯二酰一肼、过氧化酶和血清清蛋白，它是在加速所说的血清清蛋白键合于所说的过氧化酶和以非共价键形式键合所说的血清清蛋白至所说的氨基苯二酰一肼的条件下，以此形成过氧化酶-血清清蛋白-氨基苯二酰一肼共轭物;

为形成凝胶，用戊二醛接触所说的共轭物;和

使所说的凝胶暴露于所怀疑的电离辐射源。

36、一种测定电离辐射的方法，包括;

放射线标记细胞样品;

用血清清蛋白和发光物以非共价键形式键合的复合物接触所说的细胞样品。

用一种胶片感光乳剂接触所说的细胞样品。

之后，显影所说的细胞样品的照片。

37、权利要求36的方法，其中，所说的细胞用从³H、¹⁴C、²⁴Na、³²P、³⁵S、⁴⁰K、⁴⁵Ca、⁵¹Cr或者¹³¹I组成的一组中选出的放射剂标记的。

38、权利要求36的方法，其中，用³H标记细胞。

39、权利要求36的方法，其中，所说的发光物从氨基苯二酰一肼衍生物、苯酚丙酮酸盐、吲哚-3-丙酮酸盐、β-吲哚基丙氨酸、N-乙酰基β-吲哚基丙氨酸和其它的吲哚酸衍生物、吲哚丙酸和吲哚乙酸组成的一组中选出。

40、权利要求36的方法，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼衍生物。

41、权利要求36的方法，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼。

42、权利要求36的方法，其中，所说的双功能交联剂从戊二醛、碳化二亚胺、琥珀酰酐和N-琥珀酰亚胺基-3-〔2-吡啶基二硫代〕-丙酸组成的一组中选出。

43、权利要求36的方法，其中，所说的双功能交联剂是戊二醛。

44、一种测量过氧化酶对于有生命细胞损害的方法，包括：

用一种复合物接触怀疑已经受过过氧化酶损害的有生命的细胞，所说的复合物由发光物和血清清蛋白组成，所说的发光物以非共价键键合于所说的血清清蛋白;

用一种还原剂接触所说的细胞;

除去任何没有结合于所说细胞的复合物;

触发发光反应;和

测量光辐射量。

45、权利要求44的方法，其中，所说的还原剂是氢硼化钾。

46、权利要求44的方法，其中，使用碱接触所说的细胞，以此触发发光反应。

47、权利要求44的方法，其中，所说的发光物从氨基苯二酰一肼衍生物，苯酚丙酮酸盐、吲哚-3-丙酮酸盐、β-吲哚基丙氨酸、N-乙酰基-β-吲哚基丙氨酸和其它的吲哚基酸衍生物、吲哚丙酸和吲哚乙酸组成的一组中选出。

48、权利要求44的方法，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼衍生物。

49、权利要求44的方法，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼。

50、权利要求44的方法，其中，所说的共轭物是可溶于极性溶剂。

51、权利要求50的方法;其中所说的方法基本是在生理PH中实施的。

52、权利要求51的方法，其中，用所说的共轭物和所说的还原剂接触之前，将所说的细胞固定于一种不可溶载体基质上。

53、一种测量过氧化酶对于有生命细胞损害的方法，包括：

用一种共轭物接触怀疑已经受过过氧化酶损害的有生命的细胞，所说的共轭物由血红素蛋白、聚氨化合物、一种发光体和血清清蛋白组成，所说的发光物是以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白;

用一种还原剂接触所说的细胞;除去任何没有结合于所说细胞的共轭物;和

加热所说的细胞。

54、权利要求53的方法，其中，所说的共轭物可溶于极性溶剂。

55、权利要求54的方法，其中，基本上在生理PH中完成所说的方法。

56、权利要求55的方法，其中，用所说的共轭物和所说的还原剂接触之前，将所说的细胞固定于一种不可溶载体基质上。

57、权利要求53的方法，其中，所说的还原剂是氢硼化钾。

58、权利要求53的方法，其中，所说的发光物从氨基苯二酰一肼衍生物、苯酚丙酮酸盐、吲哚-3-丙酮酸盐、β-吲哚基丙氨酸、N-乙酰基-β-吲哚基丙氨酸和其他的吲哚基酸衍生物、吲哚丙酸和吲哚乙酸组成的一组中选出。

59、权利要求53的方法，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼衍生物。

60、权利要求53的方法，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼。

61、权利要求53的方法，其中，为形成可溶性共轭物，所说的共轭物是用双功能交联剂交联。

62、权利要求53的方法，其中，所说的聚胺化合物是2，6-二氨基乙酸。

63、权利要求53的方法，其中，所说的聚胺化合物从由2，6-二胺基乙酸，N-（3-氨基丙基）-1，4-丁二胺，1，4-丁二胺，乙烯二胺和1，2-乙二胺构成的一组中选出。

64、一种定性和定量测定过氧化酶对细胞损害的成份包括，一种血红素蛋白，聚胺化合物，发光物和血清清蛋白，并且为形成聚胺化合物-血红素蛋白-发光物共轭物。所说的发光物是以非共价键形式键合于所说血清清蛋白。

65、权利要求64的成份，其中，用双功能交联试剂交联所说的共轭物。

66、权利要求64的成份，其中，所说的发光物从氨基苯二酰一肼衍生物、苯酚丙酮酸盐、吲哚-3-丙酮酸盐、β-吲哚基丙氨酸、N-乙酰基-β-吲哚基丙氨酸和其他的吲哚基酸衍生物，吲哚丙酸和吲哚乙酸组成的一组中选出。

67、权利要求64的成份，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼衍生物。

68、权利要求64的成份，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼。

69、权利要求64的成份，其中，所说的血红素蛋白是从血红蛋白，肌红蛋白和过氧化酶组成的一组中选出。

70、权利要求64的成份，其中，所说的聚胺化合物从由2，6-二胺基乙酸，N-（3-氨基丙基）-1，4-丁二胺，1，4-丁二胺，乙烯二胺和1，2-乙二胺构成的一组中选出。

71、权利要求64的成份，其中，所说的聚胺化合物是2，6-二氨基乙酸。

72、一种用于热化学发光试验的成份，包括一种共轭物，所说共轭物由发光物，血红素蛋白和血清清蛋白组成，所说的发光物以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白。

73、权利要求72的成份，其中，所说的发光物从氨基苯二酰一肼衍生物、苯酚丙酮酸盐、吲哚-3-丙酮酸盐、β-吲哚基丙氨酸，N-乙酰基-β-吲哚基丙氨酸和其他的吲哚基酸衍生物，吲哚丙酸和吲哚乙酸组成的一组中选出。

74、权利要求72的成份，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼衍生物。

75、权利要求72的成份，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼。

76、权利要求72的成份，其中，所说的血红素蛋白是从血红蛋白、肌红蛋白和过氧化酶组成的一组中选出。

77、权利要求72的成份，其中，所说的血红素蛋白是血红蛋白。

78、权利要求72的成份，其中，所说的血红素蛋白是过氧化酶。

79、一种用于热化学发光试验的成份，包括：

一种复合物，所说的复合物由发光物和血清清蛋白构成，所说的发光物从氨基苯二酰一肼衍生物、苯酚丙酮酸盐、吲哚-3-丙酮酸盐、β-吲哚基丙氨酸、N-乙酰基-β-吲哚基丙氨酸和吲哚基丙氨酸衍生物、吲哚丙酸和吲哚乙酸所组成的一组中选出，所说的发光物以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白，并且血红素蛋白从血红蛋白、肌红蛋白或者过氧化酶构成的一组中选出，所说的血红素蛋白键合于所说的血清清蛋白。

80、权利要求79的成份，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼衍生物。

81、权利要求79的成份，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼。

82、权利要求79的成份，其中，所说的血红素蛋白是血红蛋白。

83、权利要求79的成份，其中，所说的血红素蛋白是过氧化酶。

84、一种用于热化学发光试验的成份，包括氨基苯二酰一肼，过氧化酶和血清清蛋白，所说氨基苯二酰一肼以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白。

85、一种用于测定热辐射的成份，包括血红素蛋白、发光物和血清清蛋白，为形成凝胶，所说的发光物是以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白，以形成共轭物。所说的共轭物用双功能交联剂交联。

86、权利要求85的成份，其中，所说的发光物从氨基苯二酰一肼衍生物、苯酚丙酮酸盐、吲哚-3-丙酮酸盐、β-吲哚基丙氨酸、N-乙酰基-β-吲哚基丙氨酸和其他的吲哚基酸衍生物、吲哚丙酸和吲哚乙酸组成的一组中选出。

87、权利要求85的成份，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼衍生物。

88、权利要求85的成份，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼。

89、权利要求85的成份，其中，所说的双官能交联剂从戊二醛、碳化二亚胺、琥珀酰酐和N-琥珀酰亚胺基-3-〔2-吡啶基二硫代〕-丙酸组成的一组中选出。

90、权利要求85的成份，其中，所说的双功能交联剂是戊二醛。

91、权利要求85的成份，其中，所说的血红素蛋白是从血红蛋白、肌红蛋白和过氧化酶组成的一组中选出。

92、权利要求85的成份，其中，所说的血红素蛋白是血红蛋白。

93、权利要求85的成份，其中，所说的血红素蛋白是过氧化酶。

94、权利要求85的成份，其中，所说的血红素蛋白键合于所说的血清清蛋白。

95、一种用于测定热辐射的成份，包括一种由血红蛋白，氨基苯二酰一肼和血清清蛋白组成的共轭物。所说的氨基苯二酰一肼是以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白，并且所说的血红蛋白键合于所说的血清清蛋白，为形成凝胶，用戊二醛交联所说的共轭物。

96、一种用于测定热辐射的成份，包括一种由过氧化酶、氨基苯二酰一肼和血清清蛋白组成的共轭物。所说的氨基苯二酰一肼是以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白，并且所说的过氧化酶键合于所说的血清清蛋白，为形成凝胶，用戊二醛交联所说的共轭物。

97、一种测定热辐射的方法包括：

混合发光物、血红素蛋白和血清清蛋白，是在加速所说的血清清蛋白以非共价键形式键合于所说的氨基苯二酰一肼的条件下，以此形成血红素蛋白质-血清清蛋白-发光物的共轭物;

为形成凝胶，用双功能交联剂接触所说的共轭物;和

将所说的凝胶暴露于所怀疑的热辐射源。

98、权利要求97的方法，其中，所说的凝胶在近似4℃和25℃之间形成。

99、权利要求97的方法，其中，所说的发光物从氨基苯二酰一肼衍生物、苯酚丙酮酸盐、吲哚-3-丙酮酸盐、β-吲哚基丙氨酸、N-乙酰基-β-吲哚基丙氨酸和其他的吲哚基酸衍生物、吲哚丙酸和吲哚乙酸组成的一组中选出。

100、权利要求97的方法，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼衍生物。

101、权利要求97的方法，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼。

102、权利要求97的方法，其中，所说的血红素蛋白是从血红蛋白、肌红蛋白和过氧化酶组成的一组中选出。

103、权利要求97的方法，其中，所说的血红素蛋白是血红蛋白。

104、权利要求97的方法，其中，所说的血红素蛋白是过氧化酶。

105、权利要求97的方法，其中，所说的双功能交联剂从戊二醛、碳化二亚胺、琥珀酰酐和N-琥珀酰亚胺氨-3-〔2-吡啶基二硫代〕-丙酸组成的一组中选出。

106、权利要求97的方法，其中，所说的双功能交联剂是戊二醛。

107、权利要求97的方法，其中，所说的双功能交联剂从戊二醛、碳化二亚胺、琥珀酰酐和N-琥珀酰亚胺基-3-〔2-吡啶基二硫代〕-丙酸组成的一组中选出。

108、一种测定热辐射的方法包括：

混合氨基苯二酰一肼、过氧化酶和血清清蛋白，是在加速所说的血清清蛋白键合于所说的过氧化酶，并且所说的血清清蛋白以非共价键形式键合于所说的氨基苯二酰一肼的条件下，以此形成过氧化物-血清清蛋白-氨基苯二酰-肼共轭物;

为形成凝胶，用戊二醛接触所说的共轭物;和

将所说的凝胶暴露于所怀疑的热辐射源。

109、一种测定热辐射的装置包括：

一种血红素蛋白质、血清清蛋白和发光物组成的共轭物，所说的发光物是以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白;

为形成凝胶，用双功能交联剂交联所说的共轭物;和

一种不可溶的载体基质，所说的凝胶凝固在所说的不可溶载体基质上。

110、权利要求109的装置，其中，所说的发光物从氨基苯二酰一肼衍生物、苯酚丙酮酸盐、吲哚-3-丙酮酸盐、β-吲哚丙基氨酸、N-乙酰基-β-吲哚基丙氨酸和其他的吲哚基酸衍生物、吲哚丙酸和吲哚乙酸组成的一组中选出。

111、权利要求109的装置，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼衍生物。

112、权利要求109的装置，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼。

113、权利要求109的装置，其中，所说的血红素蛋白是从血红蛋白、肌红蛋白和过氧化酶组成的一组中选出。

114、权利要求109的装置，其中，所说的双功能交联剂从戊二醛、碳化二亚胺、琥珀酰酐和N-琥珀酰亚胺基-3-〔2-吡啶基二硫代〕-丙酸组成的一组中选出。

115、权利要求109的装置，其中，所说的双功能交联剂是戊二醛。

116、一种液体中

位体的化学发光试验，其中，所说的

位体是由所说的配位体和它的抗

位体组成的特殊键对的一部分，包括：

混合一种发光物、一种选择的抗

位体和血清清蛋白，是在加速所说的血清清蛋白以非共价键形式键合于所说的发光物条件下，以此形成一种可溶性抗

位体-血清清蛋白-发光物的共轭物;

用怀疑含有 位体的液体接触所说的共轭物，其中，所说的

位体和抗

位体是所说的

位体和所说的抗

位体组成的特殊键对的组成部分;

除去任何没有键合的

位体;并且

触发发光反应。

117、权利要求116的试验，其中，所说的

位体是被作用的物质或者适合于选定的被作用的物质的酶两者中的一个，并且所说抗

位体是适合于所说的被作用的物质的酶或者所说的选定的被作用的物质的一个。

118、权利要求116的试验，其中，所说的 位体是抗原或者适合于选定的抗原的抗体两者中的一个，并且所说的抗

位体是适合于所说的抗原的抗体或者所说的选定的抗原的一个。

119、权利要求116的试验，其中，所说的共轭物另外由血红素蛋白组成，并且通过加热来触发所说的发光反应。

120、权利要求116的试验，其中，用碱接触已经结合了 位体的共轭物，以此触发发光反应。

121、权利要求120的试验，其中，所说的碱是氢氧化钠。

122、权利要求116的试验，其中，在同怀疑含有所说的

位体的液体接触之前，固定所说的共轭物。

123、权利要求122的试验，其中，同双功能交联剂交联来固定所说的共轭物。

124、权利要求116的试验，其中，在同怀疑含有所说的

位体的液体接触之后，固定所说的共轭物。

125、权利要求124的试验，其中，用双功能交联剂交联来固定所说的共轭物。

126、权利要求116的试验，其中，固定所说的

位体。

127、权利要求126的试验，其中，将所说的 位体凝固在一种不可溶载体基质上来固定它。

128、一种测定被作用的物质的方法，其中，使用脱氢酶催化所说的被作用的物的破裂，包括：

将发光物、对于选定的被作用的物质合适的脱氢酶和血清清蛋白混合，是在加速所说脱氢酶键合于所说血清清蛋白并且所说的发光物以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白的条件下，以此形成脱氢酶-血清清蛋白-发光物的共轭物;

为形成凝胶，用含有双功能交联剂和氧化的核苷酸协同因子的溶液接触所说的共轭物;

用怀疑含有所说已选定的被作用的物的样品接触所说的凝胶;并且

触发发光反应。

129、权利要求128的方法，其中，所说的共轭物另外由血红素蛋白组成并且通过加热来触发所说的发光反应。

130、权利要求128的方法，其中，用碱接触所说的凝胶以此来触发发光反应。

131、一种用于化学发光特殊分析物试验的成份，其中，所说的分析物是特殊的由共轭物组成键对的一部分，所说的共轭物由血红素蛋白、发光物和血清清蛋白组成，所说的发光物是以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白，用双功能交联剂交联所说的共轭物。

132、权利要求131的成份，其中，所说的发光物从氨基苯二酰一肼衍生物、苯酚丙酮酸盐，吲哚-3-丙酮酸盐、β-吲哚基丙氨酸、N-乙酰基-β-吲哚基丙氨酸和其他的吲哚基酸衍生物、吲哚丙酸和吲哚乙酸组成的一组中选出。

133、权利要求131的成份，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼衍生物。

134、权利要求131的成份，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼。

135、一种测定液体中抗原的试验，其中，所说的抗原是具体的由抗原和抗体构成键对的一部分，包括：

将抗体结合在一种不可溶载体基质上，考虑到根据抗原的基本决定因素（抗原为希望测定之物），所说的第一抗体是合适的;

用怀疑含有抗原（抗原为希望测定之物）的液体接触所说的第一抗体;

用一种共轭物接触结合于所说的第一抗体的抗原，所说共轭物由适合于第二决定因素所说的抗原的抗体、血清清蛋白和发光物组成，所说的发光物以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白，它是在加速所说的共轭物的所说的第二抗体键合于所说抗原的条件下;并且

触发发光反应。

136、权利要求135的试验，其中，所说的不可溶载体基质由一种惰性聚合物组成。

137、权利要求136的试验，其中，所说的惰性聚合物是一种被交联的蛋白。

138、权利要求135的试验，其中，将所说的第一抗体结合在蛋白A上，所说的蛋白A被结合在一种不可溶载体基质上。

139、权利要求138的试验，其中，所说的不可溶载体基质由多糖组成。

140、权利要求135的试验，其中，在触发所说的发光反应之前除去未结合的共轭物。

141、权利要求135的试验，其中，所说的发光物从氨基苯二酰一肼衍生物、苯酚丙酮酸盐、吲哚-3-丙酮酸盐、β-吲哚基丙氨酸、N-乙酰基-β-吲哚基丙氨酸和其他的吲哚基酸衍生物、吲哚丙酸和吲哚乙酸组成的一组中选出。

142、权利要求135的试验，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼衍生物。

143、权利要求135的试验，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼。

144、权利要求135的试验，其中，用碱触发所说的发光反应。

145、权利要求135的试验，其中，所说的共轭物另外由血红素蛋白组成并且通过加热来触发所说的发光反应。

146、一种测定液体中抗原的化学发光试验，其中，所说的抗原是由抗原和该抗原的抗体组成的键对的一部分，包括：

将第一抗体结合于固定在一种不可溶载体基质上的蛋白A，所说第一抗体是适合于第一决定因素的抗原（抗原为希望测定之物）;

用怀疑含有一种抗原（抗原为希望测定之物）的液体接触所说的第一抗体;

用一种共轭物接触结合于所说的第一抗体的抗原，所说共轭物由蛋白A，一种适合于第二决定因素所说的抗原的第二抗体、血清清蛋白和氨基苯二酰一肼组成，所说的氨基苯二酰一肼以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白、它是在加速所说的共轭物的所说的第二抗体键合于所说的抗原的条件下;并且触发发光反应。

147、权利要求146的试验，其中，所说的不可溶载体基质由多糖组成。

148、权利要求146的试验，其中，用碱触发所说的发光反应。

149、权利要求146的试验，其中，所说的共轭物另外由血红素蛋白组成并且通过加热来触发所说的发光反应。

150、权利要求146的试验，其中，在触发所说的发光反应之前除去未结合的共轭物。

151、一种在化学发光试剂中测定一种液体中抗原的试剂，其中，所说的抗原是由一种抗原和一种适合于那种抗原的抗体构成的具体键对的一部分，包括一种由血清清蛋白、蛋白A和发光物组成的共轭物，所说的发光物以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白。

152、权利要求151的试剂，其中，所说的发光物从氨基苯二酰一肼衍生物、苯酚丙酮酸盐、吲哚-3-丙酮酸盐、β-吲哚基丙氨酸、N-乙酰基-β-吲哚基丙氨酸和其他的吲哚基酸衍生物、吲哚丙酸和吲哚乙酸组成的一组中选出。

153、权利要求151的试剂，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼衍生物。

154、权利要求151的试剂，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼。

155、权利要求151的试剂，另外，包括血红素蛋白。

156、一种测定在选择的液体中抗体的化学发光试验，其中，所说的抗体是由一种抗原和适合于那种抗体组成的具体键对的一部分，包括：

将一种抗原结合在一种不可溶载体基质上，所说的抗原对于将要选定进行结合的抗体具有决定因素;

用怀疑含有所说的选定抗体的液体接触所说的已结合的抗原，它是在加速所说抗体键合于所说的抗原的条件下;

用一种共轭物接触所说的已结合的抗体，所说的共轭物由蛋白A、血清清蛋白和发光物组成，所说发光物以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白，这是在加速所说的共轭物的蛋白A键合于所说的已结合的抗体的条件下;并且

触发发光反应。

157、权利要求156的试验，其中，所说发光物从氨基苯二酰一肼衍生物、苯酚丙酮酸盐、吲哚-3-丙酮酸盐、β-吲哚基丙氨酸、N-乙酰基-β-吲哚基丙氨酸和其他的吲哚基酸衍生物、吲哚丙酸和吲哚乙酸组成的一组中选出。

158、权利要求156的试验，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼衍生物。

159、权利要求156的试验，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼。

160、权利要求156的试验，其中，为形成凝胶，使用双功能交联剂，将所说的抗原结合在所说的不可溶载体基质上。

161、权利要求160的试验，其中，所说的双功能交联剂从戊二醛、碳化二亚胺、琥珀酰酐和N-琥珀酰亚胺基-3-〔2-吡啶基二硫代〕-丙酸组成的一组中选出。

162、权利要求160的试验，其中，所说的双功能交联剂是戊二醛。

163、权利要求156的试验，其中，用碱触发所说的发光反应。

164、权利要求156的试验，其中，所说的共轭物另外由血红素蛋白组成并且通过加热来触发所说的发光反应。

165、权利要求164的试验，其中，所说的血红素蛋白是从血红蛋白、肌红蛋白和过氧化酶组成的一组中选出。

166、权利要求164的试验，其中，所说的血红素蛋白是血红蛋白。

167、权利要求164的试验，其中，所说的血红素蛋白是过氧化酶。

168、权利要求156的试验，其中，怀疑含有合适的抗原的液体是血清。

169、权利要求156的试验，其中，在触发所说的发光反应之前除去未结合的共轭物。

170、一种测定液体中选定的抗体的试验，其中，所说的抗体是由一种抗原和适合于那种抗体组成的具体键对的一部分，包括：

将一种抗原结合在一种不可溶载体基质上，所说的抗原对于将要选定进行结合的抗体具有决定因素;

用怀疑含有所说的选定抗体的液体接触所说的已结合的抗原，它是在加速所说抗体键合于所说的抗原的条件下：

用一种共轭物接触所说的已结合的抗体，所说的共轭物由蛋白A、血清清蛋白和氨基苯二酰一肼组成，所说氨基苯二酰一肼以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白，这是在加速所说的共轭物的蛋白A键合于所说的已结合的抗体的条件下;并且

用碱接触已结合的共轭物。

171、权利要求170的化学发光试剂，其中，怀疑含有所说的抗体的液体是血清。

172、一种测定液体中已选定的抗体的化学发光试验，其中，所说的抗体是一个具体键对的一部分，所说的键对由所说的抗体和一种具体的已同所说抗体结合的抗原组成，包括：

将一种抗原结合在一种不可溶载体基质上，所说的抗原对于选定将要进行结合的抗体具有决定因素;

用怀疑含有所说的选定抗体的液体接触所说的已结合的抗原，是在加速所说的抗体键合于所说的已结合的抗原条件下;

用一种共轭物接触所说的已结合的抗体，所说共轭物由一种血红素蛋白、蛋白A、血清清蛋白和氨基苯二酰一肼组成，所说的氨基苯二酰一肼以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白，是在加速所说的共轭物的蛋白A键合于所说的已结合的抗体条件下;和

加热所说的已结合的共轭物。

173、权利要求172的化学发光试验，其中，所说的怀疑含有所说的抗体的液体是稠化液体。

174、一种测定选定类型细胞的试验，包括：

固定怀疑含有选定类型细胞的样品;

用双功能交联剂将共轭物与所说的已固定的细胞接触，所说的共轭物由植物凝血素、血清清蛋白和一种发光物组成，选定的植物凝血素有能力优先结合于所说的已选定类型细胞，并且所说的发光物以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白，是在加速所说的共轭物的植物凝血素键合于所说的选定类型细胞的条件下;和

触发发光反应。

175、权利要求174的试验，其中，用碱接触所说的已结合的共轭物，以此触发发光反应。

176、权利要求174的试验，其中，所说的共轭物另外由血红素蛋白组成并且通过加热来触发所说的发光反应。

177、权利要求174的试验，其中，所说的怀疑含有所说的抗体的液体是稠化液体。

178、权利要求174的试验，其中，所说的发光物从氨基苯二酰一肼衍生物、苯酚丙酮酸盐、吲哚-3-丙酮酸盐、β-吲哚基丙氨酸、N-乙酰基β-吲哚基丙氨酸和其它的吲哚基酸衍生物、吲哚丙酸和吲哚乙酸组成的一组中选出。

179、权利要求174的试验，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼衍生物。

180、权利要求174的试验，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼。

181、权利要求174的试验，其中，所说的双官能交联剂从戊二醛、碳化二亚胺、琥珀酰酐和N-琥珀酰亚胺基-3-〔2-吡啶二硫代〕-丙酸组成的一组中选出。

182、权利要求174的试验，其中，所说的双功能交联剂是戊二醛。

183、权利要求174的试验，其中，所说的植物凝血素从刀豆球蛋白A、麦种凝集素和兵豆植物凝血素、大豆植物凝血素和大蜗牛园口螺属（Helix  pomatia）植物凝血素组成的一组中选出。

184、权利要求174的试验，其中，所说的植物凝血素为刀蛋球蛋白A。

185、权利要求174的试验，其中，在触发所说的发光反应之前除去未结合的共轭物。

186、一种测定选定类型细胞的成份，包括一种由血清清蛋白、植物凝血素和发光物组成的共轭物，所说的发光物以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白。

187、权利要求186的成份，其中，所说的发光物从氨基苯二酰一肼衍生物、苯酚丙酮酸盐、吲哚-3-丙酮酸盐、β-吲哚基丙氨酸、N-乙酰基β-吲哚基丙氨酸和其它的吲哚基酸衍生物、吲哚丙酸和吲哚乙酸组成的一组中选出。

188、权利要求186的成份，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼衍生物。

189、权利要求186的成份，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼

190、权利要求186的成份，其中，所说的植物凝血素从刀豆球蛋白A、麦种凝集素和兵豆植物凝血素、大豆植物凝血素和大蜗牛园口螺属（Helix  pomatia）植物凝血素组成的一组中选出。

191、权利要求186的成份，其中，所说的植物凝血素为刀豆球蛋白A。

192、权利要求186的成份，其中，另外包括一种血红素蛋白。

193、一种测定具体细胞类型的装置，包括一种由植物凝血素-血清清蛋白-发光物组成的共轭物，所说的发光物以非共价键形式键合于所说的血清清蛋白，用双功能交联剂交联所说的共轭物。

194、权利要求193的装置，其中，所说的发光物从氨基苯二酰一肼衍生物、苯酚丙酮酸盐、吲哚-3-丙酮酸盐、β-吲哚基丙氨酸、N-乙酰基β-吲哚基丙氨酸和其它的吲哚基酸衍生物、吲哚丙酸和吲哚乙酸组成的一组中选出。

195、权利要求193的装置，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼衍生物。

196、权利要求193的装置，其中，所说的发光物是氨基苯二酰一肼。

197、权利要求193的装置，其中，所说的植物凝血素从刀豆球蛋白A、麦种凝集素和兵豆植物凝血素、大豆植物凝血素和大蜗牛园口螺属（Helix  pomatia）植物凝血素组成的一组中选出。

198、权利要求193的装置，其中，所说的植物凝血素是刀豆球蛋白A。

199、权利要求193的装置，其中，所说的双功能交联剂从戊二醛、碳化二亚胺、琥珀酰酐和N-琥珀酰亚胺基-3-〔2-吡啶基二硫代〕-丙酸组成的一组中选出。

200、权利要求193的装置，其中，所说的双功能交联剂是戊二醛。

201、权利要求193的装置，其中，所说的共轭物另外包括血红蛋白。

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