CN2464731Y

CN2464731Y - 核酸扩增仪

Info

Publication number: CN2464731Y
Application number: CN 01210870
Authority: CN
Inventors: 邢军芬
Original assignee: Shanghai Baio Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Baio Technology Co ltd
Priority date: 2001-02-28
Filing date: 2001-02-28
Publication date: 2001-12-12
Anticipated expiration: 2011-02-28

Abstract

一种PCR扩增仪,它包括:缠绕于圆截面柱芯上的n匝毛细管,n取决于所需的PCR循环次数;加热单元,所述加热单元由m块或m对相互独立的弧形恒温块组成闭合圆,m取决于特定PCR需要经历的温度段数,m≥2,各恒温块的弧长之比等于对应温度段的反应时间之比,并在圆周上按反应阶段依次排列,彼此之间设有隔热隙;流速控制单元,该单元将毛细管与样品源相连;温度控制单元,该单元与加热单元连接;其中的加热单元与毛细管线圈接触,加热单元在长度上大于等于毛细管线圈的长度。

Description

核酸扩增仪

本实用新型涉及核酸的体外扩增设备。

经典的PCR仪是将待扩增的样品加入一微量离心管中，再加入扩增用混合试剂，然后将微量离心管插入PCR仪温控台的插孔中，通过控制温控台的温度使插入微量离心管中的样品反复经历高温(通常为93℃-98℃)变性，低温(通常为50℃-70℃)复性，中温(60℃-75℃)延伸的过程，从而实现DNA的体外扩增(参见文献)。由于盛有扩增混合物的微量离心管热平衡很慢，扩增时间通常需2-4小时。为缩短扩增时间，人们发展了毛细管扩增仪和微池PCR扩增仪(PhilipBelgtader等(1999)，“7分钟内细菌的PCR检测”，科学，第284卷，449-450；和M.Alien Northrup Bill Benett等(1998)，“基于微刻硅反应池的核酸微缩分析仪”，分析化学70：918-922)。由于采用一段毛细管或在硅片上刻蚀的微池来盛放扩增混合物，因体积小，热交换面积增加，因此热平衡速度大大加快，扩增时间很短(20-40min)，但由于扩增产物的量很小，结果分析主要采用在线荧光分析系统(Philip Belgtader等(1999)，同上)。从使用上看，由于扩增容器体积很小，给样品、试剂等加入扩增容器增加了困难，另外由于扩增产物的量很小，使其在测序、克隆等需用较大量扩增产物方面的应用受到限制。1998年，Kopp等人发表了一片有关连续流动PCR扩增芯片的研究论文，他们通过用光刻腐蚀然后玻璃健合的方法在小片玻璃上制作弯弯曲曲的微管道，然后将玻片置于包含三个温度的加热块上，扩增混合物在微管道中流过三个温区，从而实现了DNA的扩增(Martin U.Kopp等(1998)，“化学扩增：芯片上的连续流动PCR”，科学280：5366)。虽然报道的系统即可用于快速PCR分析检测，也可用于快速制备PCR扩增产物，但存在以下不足：由于微管道很长(2m多)，在玻璃片上的加工面积较大，给加工制作带来困难，成品率较低；用于多个样品同时扩增时存在很大困难；系统对流速控制精度要求很高；整个系统距实际应用还有很大距离。

本实用新型的目的就是要提出一套克服上述不足的简单实用的连续流动式高效PCR扩增仪，该设备即可用于快速PCR分析，也可用于PCR产物制备。

本实用新型的以上目的是通过以下技术方案实现的。

本实用新型提供了一种PCR扩增仪，它包括：

缠绕于圆截面柱芯上的n匝毛细管，n取决于所需的PCR循环次数；

加热单元，所述加热单元由m块或m对相互独立的弧形恒温块组成闭合圆，m取决于特定PCR需要经历的温度段数，m≥2，各恒温块的弧长之比等于对应温度段的反应时间之比，并在圆周上按反应阶段依次排列，彼此之间设有隔热隙；

流速控制单元，该单元将毛细管与样品源相连；

温度控制单元，该单元与加热单元连接；

其中的加热单元与毛细管线圈接触，加热单元在长度上大于等于毛细管线圈的长度。

所述毛细管可用不同材料(玻璃、石英、塑料等)制成，其中弹性石英毛细管较为理想，毛细管直径以20-1000um为好。这样的弹性毛细管是市场上有售的。例如河北省永年锐沣色谱器件有限公司生产的弹性石英毛细管。较好的是，对毛细管内壁进行二氯二甲硅烷微量钝化处理。这样，可降低管壁与反应液的亲和力，防止反应成分的吸附。

所述柱芯应采用可耐受100℃以上温度的材料制作，这包括塑料、橡胶、木材、玻璃、金属、炭棒等。优选的是聚四氟乙烯材料。柱芯一般取圆柱形。直径不得小于毛细管的最小绕度，即弹性毛细管不断裂而能弯成的最小曲度；长度不应小于A×N×Md，其中，N为PCR扩增的循环次数，A为同时扩增的样品数即毛细管根数，Md为毛细管外径。

加热单元由m块或m对相互独立的恒温块组成。为了避免不同温区温度间的相互影响，相邻恒温块之间设有隔热隙。该隔热隙可以采用石棉、隔热橡胶、空气等，厚度/宽度以2-5mm为宜。恒温块数量m取决于特定PCR需要经历的温度段数，至少为2，更经常的是3，也可能更多。也可以将各温度段再分成多个亚单元，即使用多个独立温控器。这样，就可以通过接入不同数量的亚单元恒温块，实现各阶段反应时间的灵活改变。显然，温控器越多，使用越灵活。

各恒温块连接组装参见图5。可以拆换。实施方式之一中，它们组成包围毛细管线圈的可开合加热腔。此时，可用不锈钢或合金等材料制成夹套样外壁组件14，并将各恒温块嵌入大小对应的外壁组件的夹套层中。然后，各外壁组件通过活动连接机构12活动连接。闭合后，则形成密闭的加热腔。或者，在另一实施方式中，它们组成通过毛细管线圈的加热棒；与毛细管紧密接触。此时，各恒温块之间可通过螺丝等机械方式固定连接。当然，如果是非开合式的加热腔，其恒温块的组装方式也可参照所示中空加热棒的固定组合方式。

若是腔式加热单元，腔内径约等于2×Md＋Cd；其中Md是毛细管的外径，Cd是柱芯的外径。若是加热棒，则加热棒外径与柱芯所述等同。长度上，加热单元在长度上大于等于毛细管线圈的长度。在腔式加热单元实施例中，为了便于操作，可将圆柱形腔体设计成可开合结构，可通过铰链等活动连接结构实现单开合，或双开合。

为了提高传热效率，温控器的内壁可采用良热导材料制作，如：铜、铝等金属或其他材料。这些恒温块可以通过浇铸成型，车削加工等多种机械加工手段制成所需形状。配合使用的一组恒温块具有相同的曲度，但彼此弧长之比则对应于PCR各阶段反应时间之比。然后，与流速控制单元配合，即可准确控制流经各反应段的滞留时间，亦即反应时间。

为了保证毛细管与恒温块之间良好的温度传递，应使得加热单元与毛细管紧密接触。为此，应控制加热单元截面的直径。若是腔式加热单元，m个恒温块组成的腔体的净内径应比(Md×2＋Cd)小约1-2mm，并在恒温块外表面包裹一层弹性层。弹性层厚约2-5mm，其材料可采用硅橡胶、氟橡胶(Viton)、含硼高聚物等高弹性耐热材料，本领域已知有许多此类材料可供选用。当毛细管线圈置于腔体中，并将腔体闭合时，通过弹性结构的收缩挤压，使毛细管与温控器实现紧密接触，从而实现高效的温度传递。若是加热棒，则由各恒温块和隔热共同构成的棒体直径应等于所述的Cd。

恒温和/或温控机制已是发展相当成熟的已知技术。例如，恒温块的恒温可利用温度传感器的反馈调节电路控制的加热块实现，具体方法可参阅文献(例如，Philip Belgtader等(1999)，同上；M.Alien Northrup Bill Benett等(1998)，同上；Martin U.Kopp等(1998)，同上)。

温度控制单元是本领域的已知技术，一般技术人员都能够根据情况进行组装、选用或选购。本发明实施例中的温度控制单元包括独立恒温块的控制电路、微处理机和显示器，用于调节各恒温块的温度。温度控制单元与各恒温块连接。各恒温块具有独立的温控电路，但共用一台微处理机。可通过微处理机为各恒温块设定不同的温度，然后根据各恒温块中控制电路和其上温度传感器的负反馈来使温控器达到并恒定在所需温度。

流速控制可采用泵来实现的，泵的一端连接进样管，插入样品源，另一端设置与毛细管相连。泵可采用注射泵、蠕动泵、往复泵等恒流泵来实现。流速控制技术已相当成熟，本领域技术人员应能方便地做出选择，也可参考众多的现有文献。

进行PCR扩增时，先将各独立温控器温度按要求通过控制单元分别恒定在所需的变性、复性、延伸温度，然后将PCR扩增混合溶液(与经典PCR扩增混合溶液一样含有模板DNA，DNA聚合酶、引物对，含Mg²⁺的反应缓冲液等)通过流速控制单元导入所述毛细管中，控制适当流速，当扩增混合溶液沿着毛细管绕柱芯流动一周，就会依次发生变性、复性、延伸等PCR扩增反应。根据样品扩增反应需要循环多少次，就在加热腔覆盖范围内的柱芯上单层缠绕多少匝承载该样品的毛细管。若要进行多个样品的扩增，可将多根毛细管并列地单层缠绕于所述圆柱体上，但需确保缠绕段在加热腔的覆盖范围内，同样，每根毛细管的缠绕匝数应等于扩增反应各自所需的循环次数。

该扩增仪可直接连接现有分析设备。这样，连续流出的扩增产物可直接进入下游分析系统，从而实现，连续的在线分析。

本实用新型设备加工制造方便，操作简便。能够实现连续、高速、高效的PCR扩增。而且，还能够实现多样品的平行运行。并可与下游分析系统相连，实现在线分析。

在本实用新型的附图中：

图1是本实用新型第一种实施方式；图1a是该方式中毛细管的缠绕方式。

图2是本实用新型第二种实施方式。

图3是本实用新型第三种实施方式；图3a是第二和第三种方式中毛细管的缠绕方式。

图4是本实用新型温控腔开合结构的图示。

图5是本实用新型第三种实施方式的剖面图示。其中，显示了本实用新型第一和第二种实施方式中加热单元的剖面结构。

以下结合附图，具体描述本实用新型的实施方式。

本实用新型至少有三种实施方式。

图1所示的方式之一中，将耐100℃以上高温的弹性石英毛细管1(河北省永年锐沣色谱器件有限公司，内径为100μm，外径为400μm)在一个耐100℃以上高温的圆截面柱芯2上缠绕25匝，该柱芯10cm，长25cm)。将缠有毛细管的所述柱芯置于由嵌套在外壁14中的3个独立弧形铝质恒温块3-1，3-2和3-3，隔热隙8、弹性层10(参见图5)以及温控线11组成的圆柱形温控腔内。三块恒温块的弧长之比3-1∶3-2∶3-3为1∶1∶2。该加热腔通过铰链12连接而具有双开合结构，见图4。各恒温块由不同数目的15W烙铁芯13加热至不同的预设温度。恒温块与毛细管接触的表面的温度由贴在表面的Pt100薄膜电阻检测。温度控制是由所用烙铁芯的标准PID(比例、积分和微分)数字温控单元(CAL3200)，电源和开关电路组成的控制器实现的。这些元件都可购得，其组装与连接可参见现有文献(例如：Martin U.Kopp等(1998)同上)将腔体内的温控器分别与温度控制单元4相连。结合外围由样品源9，注射泵6和接口7组成的流速控制单元5，组成一套本实用新型所述的PCR扩增仪。

进行PCR扩增时，先将各独立温控器温度按要求通过控制单元4分别恒定在所需的变性、复性、延伸温度，其中恒温块3-1的设定温度为95℃，3-2为60℃，3-3为77℃。然后将PCR扩增混合溶液(10mM TrispH8.4，0.01％Tween20，50mMKCl，0.2mM DNA Oligo，1.5mM MgCl₂，1.4μM polyvinylpyrrolidon，1μM primers5’-tgcaccggcgcctactgta-3’，5’-catcacataacgcatagc-3’，0.25U/ul Taq，10份模板拷贝)通过注射泵6以70nl/s流速导入毛细管。15分钟后取10μl扩增产物按常规方法电泳(丁振若，苏明权主编的“临床PCR基因诊断技术”，p.64，世界图书出版社)，结果阳性。

对照扩增试验按照经典PCR进行(K.B.Mullis等，PCR聚合酶链式反应，科学出版社，1997年9月出版)：取50μl加入2ml的薄壁管中，在Bio-RadThermocycler PCR扩增仪上，按以下程序扩增：94℃预变性5min；然后，94℃40s，58℃30s，72℃40s，共25轮；最后，72℃ 5min)。以相同方法分析扩增产物，20小时后获得阳性产物。

图2显示本实用新型的第二种方式。它与第一种方式类似，区别仅在于用前文所述的加热棒取代第一种实施例中的柱芯，作为加热单元，同时取代了加热腔。所述加热棒主要由独立弧形温控器3’-1，3’-2，3’-3，隔热隙8和温控线11组成。弹性毛细管直接绕在加热棒上。如图所示，加热棒可以是空心的。与第一种实施例类似，它们分别然后与相应的流速控制单元5和控制单元4组成一套PCR扩增仪。显然，第二种方式特点在于结构更为简单。

图3显示本实用新型的第三种方式。即，将第二种方式中绕在加热棒3’上的毛细管线圈放入第一种实施方式的加热腔3内。其中，温度设定相同的各独立恒温块两两相对，加热棒此段的外周弧长正好等于加热腔该段的内周弧长，构成成对的加热单元。例如，3’-1与3-1对应，3’-2与3-2对应，3’-3与3-3对应。显然，此种结构的控温更准确，热传导效率更高。

Claims

1. 一种PCR扩增仪，它包括：

流速控制单元，该单元将毛细管与样品源相连；

温度控制单元，该单元与加热单元连接；

2. 根据权利要求1所述的PCR扩增仪，m等于3。

3. 根据权利要求1所述的PCR扩增仪，其中的加热单元是包围所述n匝毛细管组成的线圈的加热腔。

4. 根据权利要求1所述的PCR扩增仪，其中的加热单元是通过所述n匝毛细管组成的线圈的加热棒。

5. 根据权利要求1所述的PCR扩增仪，其中的加热单元是权利要求4所述的加热棒和权利要求3所述的加热腔，各自同一温度段的恒温块两两相对，毛细管线圈夹在两加热亚单元之间。

6. 根据权利要求1所述的PCR扩增仪，其中加热腔的外层包有弹性层。

7. 根据权利要求1所述的PCR扩增仪，其中的流速控制单元包括泵。

8. 根据权利要求1所述的PCR扩增仪，其中的温度控制单元包括独立恒温块的控制电路、微处理机和显示器。