CN219129570U - 组织消化用的离心装置 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及组织消化分离技术领域，具体公开了一种组织消化用的离心装置，其包括离心管，以及用于分离组织和过滤的细胞滤网，其中，细胞滤网的安装侧设置在离心管内壁上，而所述细胞滤网与该安装侧对应的边缘侧与所述离心管内壁之间形成一便于进行实验操作的操作窗口。

Description

组织消化用的离心装置

优先权申请

本申请将作为后续专利申请(包括，但不限于，中国发明专利申请、中国实用新型申请、PCT申请、基于巴黎公约的国外申请)的优先权基础。

技术领域

本实用新型涉及组织消化、离心装置技术领域，尤其涉及一种组织消化用的离心装置。

背景技术

组织中富含生命活性物质和各种细胞，建立规模化从大量个体的少量、甚至是微量组织中消化、提取或萃取所需物质的方法在医学、畜牧和其他相关领域具有重要应用价值。例如，组织消化是原代组织细胞培养过程中的重要实验操作，通过消化酶和/或机械处理的方式，将器官组织解离成单细胞或细胞簇，进一步富集所需细胞，置于合适的培养环境下进行培养，使原代细胞得以生存、生长和繁殖。

对组织进行酶消化处理时，由于样本在管底尖部聚集易于收集的原因，利用不同规格的尖底离心管成为重要选择，而影响组织消化处理效果的因素主要有温度、组织粒度、消化液组分和组织块承受的剪切力等因素。

目前，对组织进行消化分离的方法是：首先，将组织剪碎后转移至无菌器皿中(一般使用离心管I)，用适量消化液(即胰蛋白酶、胶原酶等消化酶制剂溶液)进行消化，且消化过程中，利用移液器/移液枪反复吹打以加速消化，从而除去细胞间质，使细胞相互分离，形成细胞悬液；然后，将固定滤孔直径的细胞滤网放置到一个新的离心管II管口，再将无菌器皿(如离心管I)中的细胞悬液倾倒入该细胞滤网，以通过该细胞滤网除去残余组织和杂质，从而在该新离心管II内得到大小均一的细胞悬液；最后将滤过后的细胞悬液离心、洗涤，最终得到可用于培养的细胞。然而，这种组织消化方式一方面操作繁琐，消化分离过程中涉及多个实验器皿，大大增加了细胞污染几率，而且消化过程中频繁地利用显微镜来观察组织消化情况，大大延长了消化时间；另一方面，由于消化时间延长，并且不易掌控组织的消化程度，因此，大大增加了过度消化的几率，而过度消化将严重影响细胞活性，从而造成原代细胞培养成功率低，培养效果不佳的问题。

实用新型内容

本实用新型的目的在于提供一种组织消化用的离心装置，部分地解决或缓解现有技术中的上述不足，其使得组织消化分离过程操作简单，避免污染等问题。

为了部分地解决上述所提到的技术问题，本实用新型具体采用以下技术方案：

本实用新型提供了一种组织消化用的离心装置，其包括：离心管，以及用于分离组织和过滤的细胞滤网，其中，所述细胞滤网的安装侧设置在所述离心管内壁上，而所述细胞滤网上与所述安装侧对应的边缘侧与所述离心管内壁之间形成一便于进行实验操作的操作窗口。

在本实用新型的一些实施例中，所述细胞滤网所在平面与所述离心管的横截面所在平面之间的夹角为0-30°。

在本实用新型的一些实施例中，所述细胞滤网投射在水平面的阴影面积为所述离心管的横截面表面面积的1/2-1/3，使得所述细胞滤网的边缘与所述离心管内壁形成所述操作窗口。

在本实用新型的一些实施例中，当所述细胞滤网所在平面与所述离心管的横截面所在平面之间的夹角为0°时，所述细胞滤网投射在所述水平面的阴影面积为所述离心管的横截面表面积的1/3。

在本实用新型的一些实施例中，当所述细胞滤网所在平面与所述离心管的横截面所在平面之间的夹角为30°时，所述细胞滤网投射在所述水平面的阴影面积为所述离心管的横截面表面积的1/2。

在本实用新型的一些实施例中，所述细胞滤网呈半圆形或弓形，其弧形侧为所述安装侧，其弦的一侧为所述边缘侧。

在本实用新型的一些实施例中，所述细胞滤网距离所述离心管管底的高度H为2cm-7cm。

在本实用新型的一些实施例中，所述细胞滤网的滤孔直径为50μm-200μm。

在本实用新型的一些实施例中，所述细胞滤网由尼龙材料或不锈钢丝制成。

在本实用新型的一些实施例中，所述细胞滤网通过安装座固定在所述离心管内壁上，且所述安装座与所述离心管一体成型。

有益效果：本实用新型通过提供一种离心管与细胞滤网一体化的离心装置，使得可通过该装置同时实现组织消化、过滤和收集，不仅简化了操作步骤，也无需频繁更换实验器皿，降低了操作污染的风险，进一步地使得已被解离出来的细胞/细胞簇能够即时被收集，从而提高组织细胞活性和得率，增加原代细胞培养成功率。

附图说明

为了更清楚地说明本实用新型实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。显而易见地，下面描述中的附图是本实用新型的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本实用新型一示例性实施例的组织消化用的离心装置的结构示意图；

图2为反映本实用新型一示例性实施例的组织消化用的离心装置中细胞滤网所在平面与离心管横截面所在平面之间夹角的示意图；

图3为反映本实用新型一示例性实施例的组织消化用的离心装置在组织消化过程中倾斜的示意图；

图4为反映本实用新型一示例性实施例的组织消化用的离心装置中细胞滤网的表面积与离心管横截面表面积之间关系的示意图；

图5为本实用新型一示例性实施例的组织消化用的离心装置的使用方法的流程图；

图6a为通过光镜观察到的佐证实验1中得到的细胞悬液中细胞状态图；

图6b为通过光镜观察到的对比实验1中得到的细胞悬液中细胞状态图；

图7a为通过光镜观察到的佐证实验2中得到的细胞悬液中隐窝状态图；

图7b为通过光镜观察到的对比实验2中得到的细胞悬液中隐窝状态图。

附图标记：1-离心管；2-密封盖；3-细胞滤网；4-安装座，41-侧壁，42-底板。

具体实施方式

为使本实用新型实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。本文中，使用用于表示元件的诸如“模块”、“部件”或“单元”的后缀仅为了有利于本实用新型的说明，其本身没有特定的意义。因此，“模块”、“部件”或“单元”可以混合地使用。本文中，术语“上”、“下”、“内”、“外”“前”、“后”、“一端”、“另一端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本实用新型和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本实用新型的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。本文中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本实用新型中的具体含义。本文中“和/或”包括任何和所有一个或多个列出的相关项的组合。本文中“多个”意指两个或两个以上，即其包含两个、三个、四个、五个等。需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围1～6的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。

名词释义：吹打混匀：本文中“吹打混匀”是指通过移液装置，例如，移液器或移液枪吹打，其原理是通过手动按压一定速度的液流使粘连的细胞分开，最终成为单细胞悬液，这是细胞处理时重悬细胞最经典有效的方法。

传统的组织消化分离方法，组织消化过程和过滤过程中需要使用到两个离心管，一个用于组织消化，一个用于收集过滤后的细胞悬液，并且还需要一个单独的细胞滤网放置到用于收集细胞悬液的离心管管口，从而进行过滤，这就使得整个组织消化分离过程操作繁琐(例如，需要针对收集用的离心管选择适配其口径大小，并且符合细胞过滤要求的细胞滤网，然而，通常市面所售或实验室所备的细胞滤网与该离心管并不匹配，因此，不仅需要手持该细胞滤网以将其放置到相应的离心管管口，再将另一个离心管中的细胞悬液导入该细胞滤网中进行过滤，才得到最终的细胞悬液，而由于滤网与离心管口径并不匹配，因此，在过滤过程中都需要一直手持该细胞滤网，以防止滤液外流)，因此，非常容易因操作不慎而引起污染。另一方面，传统的方式中，通过移液装置反复吹打消化液来加速消化作用有限，因此，仅通过反复吹打进行消耗组织使得消化时间较长，并且，由于消化一定时间后，组织消化液中同时存在已经解离的细胞/细胞簇和未消化的组织块，若消化时间过长对已经从组织中解离出来的细胞/细胞簇造成过度消化，影响细胞活性，从而造成原代细胞培养成功率低，培养效果不佳。

参见图1，为本实用新型一示例性实施例的组织消化用的离心装置的结构示意图。具体地，该组织消化用的离心装置包括离心管1，用于密封离心管1的密封盖2，以及用于分离组织和筛选过滤的细胞滤网3，其中，该细胞滤网3的安装侧设置在该离心管1内壁上，而其边缘侧与该离心管内壁之间形成一个便于进行实验操作的操作窗口5(例如，移液装置便于从该操作窗口5伸入离心管1底部吸取组织块和消化液的混合物，或者，通过该操作窗口5伸入离心管1底部吸取过滤后的细胞悬液)，从而使得可通过该离心装置即可完成组织消化、细胞悬液过滤、细胞收集工作。

在一些实施例中，该细胞滤网3通过一安装座4安装在该离心管1内壁，且该细胞滤网3距离该离心管1管底的高度H为2cm-7cm。具体地，该安装座4与离心管1一体成型。其中，该安装座4包括用于防止沿离心管1内壁漏液的侧壁41(该侧壁41的形状适应于离心管1内壁的形状，例如，呈弧形)，以及与细胞滤网3对接的底板42，该侧壁41与底板42一体成型(其横截面呈L字形)。

在一些实施例中，该细胞滤网3采用尼龙材料或不锈钢丝制成。其通过加压工艺固定在安装座的底板42上。

当然，在另一些实施例中，也可在该离心管内壁上设置一个或多个卡扣，在该安装座的侧壁41上设置卡扣槽，从而将预先安装有细胞滤网的安装座卡扣安装在该离心管内壁上，也即将该细胞滤网作为该离心管的附件，使得可以根据实际需要替换不同滤孔的细胞滤网即可，无需更换整个离心管，节省资源。

进一步地，为了防止细胞滤网3上富集的残留组织块掉落，该细胞滤网3所在平面与离心管1的横截面所在平面(或水平面)之间的夹角α为0°-30°，也即该细胞滤网可轻微向上倾斜设置。优选地，该夹角为15°或30°。

进一步地，参见图3和图4，在一些实施例中，该细胞滤网3投射在水平面的阴影面积为该离心管1的横截面面积的1/2-1/3，从而使得该细胞滤网的边缘侧与该离心管内壁之间形成上述的操作窗口(也即该操作窗口的面积为该离心管1的横截面面积的1/2-2/3)，进而使得可在该离心装置内完成组织消化、细胞悬液过滤、细胞收集工作。本实用新型中，一方面为了预留足够的操作空间，另一方面因为后续过程中将通过移液器/移液枪将混合物/细胞悬液在细胞滤网上进行吹打或过滤，因此，无需将该细胞滤网的表面积设置的过大，进一步节省了资源。

在一些实施例中，该细胞滤网呈弓形或半圆形，其弧形侧贴合于离心管内壁(该弧形的半径与底座半径之和即为该离心管内壁的半径)，弦的一侧与离心管内壁(即未与弧形侧贴合的部分内壁)之间形成上述操作窗口。

在一些实施例中，参见图2，当该细胞滤网3所在平面与离心管1的横截面所在平面之间的夹角α为0°，也即该细胞滤网水平设置时，该细胞滤网投射在水平面的阴影面积(也即该细胞滤网的表面积)为该离心管横截面面积的1/3(也即此时，该细胞滤网呈劣弧弓状，即其弧形一侧贴合在离心管内壁，而弦的一侧，也即边缘测朝向离心管的中心轴，并与离心管的另一侧内壁之间形成上述操作窗口)。

在另一些实施例中，参加图2，当该细胞滤网3所在平面与离心管的横截面所在平面之间的夹角α为30°时，该细胞滤网投射在水平面的阴影面积为该离心管横截面面积的1/2。

在一些实施例中，细胞滤网的滤孔直径为50μm-200μm，优选地，70μm-100μm。由于不同实验需求不同，其对细胞大小的要求不同，因此，可根据不同的实际需要，在不同的离心管中配置不同的直径大小的细胞滤网，从而使得可根据实际需要自行选择自带相应孔径大小的细胞滤网的离心管。

参见图5，下面结合具体的组织消化分离实验步骤对上述组织消化离心装置的使用方法进行详细的说明:

S1，将预先配置好的消化液和预先剪切好的待消化组织块的混合物通过离心管的操作窗口转移至离心管。

在一些实施例中，可预先在一无菌器皿内使用手术剪刀或手术刀等工具将待消化的组织切成1mm³-3mm³的组织块；然后，再该无菌器皿内加入配置好的消化液，最后，再将该无菌器皿中组织块与消化液的混合物转移至该离心管中，且该混合物的液面高度低于该细胞滤网的高度H。

当然，在另一些实施例中，为了避免转移过程中因操作不慎而引起污染，也可预先将待消化组织剪切成1mm³-3mm³的组织块直接放置在该离心管中，也即提前打开密封盖，直接在离心管管口剪切待消化组织；然后再加入预先配置好的消化液即可。

在一些实施例中，由于不同规格的离心装置的离心管中的细胞滤网的滤孔直径不同，因此，在执行步骤S1之前，还需要根据实际想要得到的细胞大小，以及每种规格的离心装置中细胞滤网的滤孔直径，选定用于进行组织消化用的目标离心装置，然后将该目标离心装置用于上述步骤S1中盛装混合物。

S2，将离心管置于合适温度环境下孵育，且每10min-15min用移液装置上下吹打该离心管内的混合物，使组织块和消化液充分混合。

S3，通过操作窗口将移液装置伸入离心管底部，以吸取充分混合后的混合物，然后通过该操作窗口将移液装置移动至细胞滤网上方(包括正上方或斜方向)，并将移液装置中的混合物吹打在细胞滤网上，使得组织块在细胞滤网的作用下分解，并通过细胞滤网的滤孔，得到细胞悬液。

当然，在另一些实施例中，每次过滤后，还可利用过滤后的细胞悬液冲洗细胞滤网上所残留的组织块，以通过操作窗口将残留组织块转移至细胞悬液中(即每次执行S3后再执行步骤S8)，然后重复执行步骤S2、S3、S8直至大部分组织块被消化。每次过滤后将滤网上的组织块洗脱至离心管中，不仅能够加速组织块的消化，同时也大大降低了传统方式中，因大量未消化组织块都残留在细胞滤网上而导致最终得不到所需数量的细胞，从而必须要进行二次消化以获取足够量细胞的几率。

S4，重复上述步骤S2-S3，直至大部分的组织块被消化。

在一些实施例中，可直观地观察细胞滤网上残留组织块的情况，来判断消化程度，从而降低使用显微镜的频率，进而避免频繁使用显微镜而导致延长消化时间。当然，也可结合显微镜来观察消化程度，例如根据细胞滤网上的残留组织块判断出大部分组织被消化时，再借助显微镜进行最终确认。

本实验中，通过每隔10-15min对离心管内的组织消化液进行吹打(S2)，且吹打后利用细胞滤网来加速组织块的分解(S3)，从而加速消化；如此反复操作S2-S3多次，例如10-30次后，即可通过细胞滤网上残留组织块的情况得知是否大部分组织块被消化，且当大部分组织块被消化时，即可进行过滤(执行S5)。

S5，通过操作窗口将移液装置伸入离心管底部以吸取细胞悬液，并通过该操作窗口将移液装置移动至细胞滤网上方，使得移液装置中的细胞悬液通过细胞滤网进行过滤，直至所有的残留组织块富集在细胞滤网上，得到不含残留组织块的细胞悬液。

在一些实施例中，由于该细胞滤网的滤孔直径相同，因此过滤后不含残留组织块的细胞悬液/细胞簇悬液整体均一，可直接转移至新的离心管中进行离心，然后收集细胞用于后续实验。

通过移液装置反复吹打消化的作用有限，因此，若仅仅通过反复吹打来加速消化，使得组织消化时间过长，并且，消化过程中细胞悬液中同时存在已经解离的细胞/细胞簇和未消化的组织块，因此，若消化时间过长，对于消化时间过长对已经从组织中解离出来的细胞/细胞簇造成过度消化，影响细胞活性。基于此，通过将混合物吹打在细胞滤网上，使得在细胞滤网和移液装置的联合作用下，产生较大的压力使得组织块被分解，并通过滤孔再次落入离心管底部被消化液消化，也即通过细胞滤网和该移液装置的联合作用下，加速组织块的分解，从而缩短了消化时间，提高消化的效率。

另一方面，无论是上述的步骤S3或S4，都可以直观地观察到组织块通过细胞滤网的情况，从而判断组织的消化程度，减少显微镜下观察的次数；同时，当判断出大部分组织块被消化(例如，步骤S3或S4或S5中细胞滤网上只有少量或几乎没有残留组织块富集)时，可及时的将已被分解的细胞/细胞簇，转移至新的离心管中终止消化，避免对被分解得到的细胞/细胞簇造成活性损伤。尤其是对于敏感的组织细胞，可以有效提高细胞活性。

由于不同的组织类型，需要消化的时间是不同的，长时间消化，会对已经解离释放细胞持续损伤，通常一般消化时间不超过60min，超过60min之后，就需要将已经解离的细胞分离保存起来，添加新的消化液再次消化残余的组织(也即二次消化)。另外，若细胞悬液经过细胞滤网过滤后，发现未收集到足够的细胞悬液/细胞簇悬液，或发现组织块明显未被充分消化，则需要再次从组织中解离，也即需要从细胞滤网中再次回收残留组织块，并进行二次消化。然而，从传统细胞滤网上回收组织块，操作难度大(例如，由于传统细胞滤网呈圆柱状，因此，需要借助工具将细胞滤网上粉残留组织块扣出来，然后再手动翻转细胞滤网以转移至新的无菌器皿中再次进行二次消化)，回收效率低，并且由于该回收过程需要手动拿取细胞滤网、手动收集残留组织块，以及手动翻转细胞滤网以将残留组织块转移至新的无菌器皿中，不仅需要新的无菌器皿，且操作繁琐，因此，非常容易因操作慎而导致污染。有鉴于此，基于本实用新型的该离心进行组织消化分离后，进行二次消化的步骤包括：

S6，当步骤S5中将离心管中无残留组织块的细胞悬液转移后，直接将细胞滤网上富集的残留组织块通过操作窗口重新转移至离心管内，并添加新的消化液，然后重复上述步骤S2-S3。

在一些实施例中，由于该细胞滤网的表面积只有该离心管横截面面积的1/2-1/3，因此，可直接通过移液装置的尖端或者其他工具将该细胞滤网上的残留组织块赶至该离心管。

进一步地，还包括步骤：S7，通过操作窗口将移液装置伸入离心管中，以获取上述步骤S5中得到的无残留组织块的细胞悬液，并转移至新的离心装置的离心管中，以进行离心、收集细胞，用作后续实验。

为佐证本实用新型的离心装置的优势，下面分别以3例待消化肝组织和3只6周龄小鼠小肠组织为例进行说明。

佐证实验1：基于上述离心装置进行人肝脏细胞的消化分离实验

(1)无菌条件下采集待消化的肝组织。

(2)在10cm的细胞培养皿A1中，使用手术刀将所采集的肝组织切割为质量相等(例如，均为2g)的2块，分别转移至新的10cm的细胞培养皿B1和C1中。

(3)使用手术剪刀分别将组织切成1mm³-3mm³小块。

其中，细胞培养皿B1中的组织小块用于佐证实验1，细胞培养皿C1中的组织小块用于对比实验1，参见后续对比实验1。

(4)使用7ml组织消化液，将细胞培养皿B1中剪碎的组织小块转移至离心装置I内(该离心装置I的离心管为15ml)，并利用移液器上下吹打10-30次以混合均匀，之后将离心装置I放入37℃的水浴锅中进行消化。

(4.1)每隔10分钟，将离心装置I从水浴锅中取出，用10ml的移液管上下吹打以将组织悬液混匀，并将移液管末端管口通过离心装置I内的操作窗口，伸入离心装置I底部，从而将所有组织悬液吸入离心管内。

(4.2)通过操作窗口，将移液管末端管口移动至细胞滤网上方，并将组织悬液吹打至该细胞滤网上，使得组织块通过细胞滤网孔隙。

(4.3)通过操作窗口，将移液器末端管口伸入离心装置I底部吸取经过滤过后的组织消化液，并利用吸取的组织消化液将残留在该细胞滤网上的组织块洗脱至组织消化液中，混悬均匀。

(4.4)重复执行步骤4.1)-4.3)，直至大部分组织块被消化。

(5)利用移液器将离心装置I中的组织消化液混悬均匀后，通过操作窗口吸取所有组织消化液，并缓慢通过离心装置I上的过滤网，使得较大/未消化的组织残留保留在滤网上，而离心装置I底得到过滤后细胞悬液，然后，再将过滤后得到的该细胞悬液转移到新的15ml常规离心管A1中。

(6)将常规离心管A1放入4℃的离心机中，离心力300g条件下离心5min，然后弃上清液后，加入2ml红细胞裂解液，冰上孵育2min。

(7)取出常规离心管A1，并向其中加入8ml PBS缓冲液用于稀释红细胞裂解液(作用，终止红细胞裂解)，然后，将该常规离心管A1再次放入4℃的离心机，300g离心力条件下离心5min，弃上清液；

(8)使用2mlPBS缓冲液重悬细胞沉淀，吸取20ul细胞悬液至细胞培养皿D1上，光镜下观察细胞状态(参见图6a)，计数，并利用CFSE染色标记细胞活性，参见下表一。

(9)记录总消化时间，对残余组织块进行称重，记录，统计分析，参见下表一。

对比实验1：基于传统常规离心管进行消化分离实验

本实验中将上述细胞培养皿C1中组织小块转移至常规离心管I内，并利用移液器上下吹打10-30次以混合均匀，之后将常规离心管I放入37℃的水浴锅中进行消化，然后：

(4.1)每隔10分钟，将常规离心管I取出，并用10ml的移液管反复吹打组织悬液10次，之后将常规离心管I重新放入37℃的水浴锅中消化。

(4.2)重复执行步骤(4.1)，直至大部分组织块被消化。

执行步骤(4.1)-(4.2)过程中，多次使用显微镜进行观察组织块消化情况。

(5)用移液器将常规离心管I中消化得到的细胞悬液混悬均匀，并吸取混匀后的所有组织消化液；然后，手动将70μm孔径的细胞滤器放置在15ml的常规离心管A2顶部开口处，并将所吸取的组织消化液缓慢释放至该细胞滤器中进行过滤，在该常规离心管A2中得到过滤后的细胞悬液。

通常市面销售和实验室的细胞滤器匹配的是50ml常规离心管，若实验中采用50ml的离心管，由于其底部较宽，使得后续进行步骤(6)-(7)中进行离心时，不易将细胞集中在底部(尤其是细胞量较少时)，而吸取上清液体时，也容易扰动底部的沉淀，因此，为了更有效的进行离心，同时避免取上清液时扰动底部沉淀，离心管采用15ml的。然而，由于该细胞滤器与15ml的离心管并不匹配(常规离心管顶部开口小于细胞滤器底部)，因此，当将上述细胞滤器放置到15ml离心管上进行过滤时，其操作难度非常大(不仅需要手持细胞滤器，且该细胞滤器需要倾斜一定角度，以保证滤液能够顺利进入离心管内，然而实际过滤过程中，过滤液非常容易流到管外)。而佐证实验1的步骤(5)中，由于是利用移液器吸取组织消化液到离心装置I上的细胞滤网进行过滤，然后通过移液器直接转移至15ml的离心管中，操作更加简单，也无需另外的细胞滤器。

(6)将常规离心管A2放入4℃的离心机中，离心力300g条件下离心5min，然后弃上清液后，加入2ml红细胞裂解液体，冰上孵育2min。

(7)取出常规离心管A2，并向其中加入8ml PBS缓冲液用于稀释红细胞裂解液(作用，终止红细胞裂解)，再次将常规离心管A2放入4℃的离心机，并在300g离心力条件下离心5min，弃上清液；

(8)在常规离心管A2中加入2mlPBS缓冲液，以重悬细胞沉淀，吸取20ul细胞悬液至细胞培养皿E1上，光镜下观察细胞状态(参见图6)，计数，并利用CFSE染色标记细胞活性，参见下表一。

(9)记录总消化时间，对残余组织块进行称重，记录，统计分析，参见下表一。

表一 佐证实验1与对比实验1中组织消化结果对比表

	常规离心管A2	常规离心管A1
			消化时间(min)	50±10	30±7
残余组织量(g)	0.35±0.08	0.21±0.05
			细胞数量(106个)	3.51±0.35	4.71±0.27
细胞活性	75±10％	85±8％
			细胞/细胞团均一性	较差	较好

由上表一可知，针对相同质量的待消化组织块，利用本实用新型的离心装置进行消化分离所需消化时间更少：(30±7)min＜(50±10)min，并且不会达到消化时间上限值60min，而利用传统离心管和细胞滤器进行组织消化分离所需消化时间与消化时间上限值60min非常接近；残余组织量更少：(0.21±0.05)g＜(0.35±0.08)g；细胞数量更多：(4.71±0.27)×10⁶个＞(3.51±0.35)×10⁶个；细胞活性(即细胞折光性)更好：(85±8％)＞(75±10％)；细胞簇大小均一性更好，参见图6a和图6b。

佐证实验2：基于上述离心装置的小鼠小肠细胞的消化分离实验

(1)无菌条件下采集6周龄小鼠的小肠组织。

(2)在细胞培养皿A2中，将小肠组织等分为等长两段，每段小肠长度为3cm。

(3)沿肠管剪开小肠，用预冷的PBS漂洗小肠内容物。直至漂洗液体澄清。

(4)将两段小肠段分别转移至新的10cm的细胞培养皿B2和C2中，使用手术剪刀分别将组织切成1mm³-3mm³小块。

其中，细胞培养皿B2中的组织小块用于佐证实验2，细胞培养皿C2中的组织小块用于对比实验2，参见后续对比实验2。

(5)使用7ml小肠组织消化液，将细胞培养皿B2中剪碎的组的组织小块转移至离心装置II(其细胞滤网的滤孔孔径为200um)，利用移液器上下吹打10-30次以混合均匀，之后将离心装置IV放入37℃的水浴锅中消化。

(6.1)每隔5分钟，将离心管II取出，用10ml的移液管上上下吹打以将组织悬液混匀，并将移液管末端管口通过操作窗口伸入离心装置II底部，将所有组织悬液吸入移液器内。

(6.2)通过操作窗口，将移液管末端管口移动至细胞滤网上方，将组织悬液吹打至细胞滤网上，使得组织块尽可能通过细胞滤网孔隙。

(6.3)通过操作窗口，用将移液器末端管口伸入离心装置II底部，并吸取滤过后的组织消化液，将残留在滤网上的组织块洗脱至组织消化液中，混悬均匀。

(6.4)重复执行步骤(6.1)-(6.3)，直至大部分组织块被消化。本实验中，重复10次后，该离心装置中的大部分组织块被消化。

(7)利用移液器将离心装置II中的组织消化液混悬均匀后，通过操作窗口吸取所有组织消化液，并缓慢通过离心装置II上的过滤网，使得较大/未消化的组织残留保留在滤网上，而离心装置II底得到过滤后细胞悬液，然后，再将过滤后得到的该细胞悬液转移到新的15ml常规离心管A3中。

(8)向常规离心管A3中加入4ml PBS缓冲液重悬细胞沉淀，并放入4℃的离心机中，以100g的离心力进行离心3min，弃上清液。

(9)取出常规离心装置A3，并向其中加入4mlPBS缓冲液重悬细胞沉淀，吸取20ul细胞悬液至细胞培养皿D2上，光镜下观察细胞状态(参见图7a，细胞活性和均一性好)，计数，并利用CFSE染色标记细胞活性，参见下表二。

对比实验2：基于传统常规离心管的小鼠小肠细胞的消化分离实验

本实验中，使用7ml组织消化液，将细胞培养皿C2中剪碎的组织小块转移至常规离心管IV内，并利用移液器上下吹打10-30次以混合均匀，之后将常规离心管IV放入37℃的水浴锅中进行消化。

(6.1)每5分钟，将常规离心管IV取出，用10ml的移液管反复吹打组织悬液10次，之后将常规离心管IV重新放入37℃的水浴锅中消化。

(6.2)重复执行步骤6.1)，直至大部分组织块被消化。

(7)用移液器将常规离心管IV中消化得到的细胞悬液混悬均匀，并吸取混匀后的所有组织消化液；然后，手动将70um孔径的细胞滤器放置在15ml的常规离心管A4顶部开口处，并将所吸取的组织消化液缓慢释放至该细胞滤器中进行过滤，在该常规离心管A4中得到过滤后的细胞悬液；然后将常规离心管A 4放入4℃的离心机，300g离心力条件下离心5min，弃上清液。

(8)在常规离心管A4中加入4ml PBS缓冲液重悬细胞沉淀，并放入4℃的离心机，100g的离心力条件下离心3min，弃上清液。

(9)在常规离心管A4中加入4mlPBS缓冲液，以重悬细胞沉淀，吸取20ul细胞悬液至细胞培养皿E2上，光镜下观察细胞状态(参见图7b，细胞均一性和活性交差)，计数，并利用CFSE染色标记细胞活性，参见下表二。

表二 佐证实验2与对比实验2中组织消化分离结果对比表

由上表二可知，利用本实用新型的离心装置进行消化分离所需消化时间更少(30±7)min＜(40±7)min；残余组织量更少：(0.31±0.0095)g＜(0.65±0.12)g；隐窝片段数量更多：(510±35)个/ml＞(210±43)个/ml；细胞活性(即细胞折光性)更好；细胞簇大小均一性更好，参见图7a和图7b。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。

上面结合附图对本实用新型的实施例进行了描述，但是本实用新型并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本实用新型的启示下，在不脱离本实用新型宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本实用新型的保护之内。

Claims (10)

1.一种组织消化用的离心装置，其特征在于，包括离心管，以及用于分离组织和过滤的细胞滤网，其中，所述细胞滤网的安装侧设置在所述离心管内壁上，而所述细胞滤网上与所述安装侧对应的边缘侧与所述离心管内壁之间形成便于进行实验操作的操作窗口。

2.根据权利要求1所述的一种组织消化用的离心装置，其特征在于，所述细胞滤网所在平面与所述离心管的横截面所在平面之间的夹角为0-30°。

3.根据权利要求2所述的一种组织消化用的离心装置，其特征在于，所述细胞滤网投射在水平面的阴影面积为所述离心管的横截面表面面积的1/2-1/3，使得所述细胞滤网的边缘与所述离心管内壁形成所述操作窗口。

4.根据权利要求3所述的一种组织消化用的离心装置，其特征在于，当所述细胞滤网所在平面与所述离心管的横截面所在平面之间的夹角为0°时，所述细胞滤网投射在所述水平面的阴影面积为所述离心管的横截面表面积的1/3。

5.根据权利要求3所述的一种组织消化用的离心装置，其特征在于，当所述细胞滤网所在平面与所述离心管的横截面所在平面之间的夹角为30°时，所述细胞滤网投射在所述水平面的阴影面积为所述离心管的横截面表面积的1/2。

6.根据权利要求1至5中任一所述的一种组织消化用的离心装置，其特征在于，所述细胞滤网呈半圆形或弓形，其弧形侧为所述安装侧，其弦的一侧为所述边缘侧。

7.根据权利要求1至5中任一所述的一种组织消化用的离心装置，其特征在于，所述细胞滤网距离所述离心管管底的高度H为2cm-7cm。

8.根据权利要求1至5中任一所述的一种组织消化用的离心装置，其特征在于，所述细胞滤网的滤孔直径为50μm-200μm。

9.根据权利要求1至5中任一所述的一种组织消化用的离心装置，其特征在于，所述细胞滤网由尼龙材料或不锈钢丝制成。

10.根据权利要求1至5中任一所述的一种组织消化用的离心装置，其特征在于，所述细胞滤网通过安装座固定在所述离心管内壁上，且所述安装座与所述离心管一体成型。

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