CN216378243U

CN216378243U - 一种生产拟胚体的容器及设备

Info

Publication number: CN216378243U
Application number: CN202122655464.4U
Authority: CN
Inventors: 张訸; 葛文雪; 陈涛涛; 王嘉显
Original assignee: Help Stem Cell Innovations Co ltd
Current assignee: Help Stem Cell Innovations Co ltd
Priority date: 2021-11-02
Filing date: 2021-11-02
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2031-11-02

Abstract

本实用新型属于生物技术领域，涉及一种生产拟胚体的容器及设备，所述容器具有环形侧面，以及布设于所述容器的中轴线上的开口；所述开口采用无菌透气滤膜盖密封；所述环形侧面用于承载待分化为拟胚体的细胞及细胞分化用培养液。本申请的技术方案不改变容器容积，实现了拟胚体的大量生产。

Description

一种生产拟胚体的容器及设备

技术领域

本实用新型涉及生物技术领域，涉及一种生产拟胚体的容器及设备。

背景技术

拟胚体是胚胎干细胞(ES)或诱导多能干细胞(iPS)在体外一定的培养条件下形成的，具有内、中、外三胚层结构，形态学上与哺乳动物早期的胚胎发育阶段有着很高相似度的一种球状结构，称为拟胚体(Embryoidbodies，EB， EBs)。目前很多分化系统都是基于拟胚体分化体系建立的，如造血干细胞，自然杀伤细胞，神经干细胞，心肌细胞等，其分化策略都是先制备出EB，然后用不同的措施定向诱导分化为目的细胞。之所以经EB途径，目的是模拟体内胚胎发育过程，EB中内中外三胚层的细胞互相支持，互相提供分化生长的微环境。

目前制备拟胚体工艺采用6孔板、T25等小型细胞培养容器缓速震荡培养制备。将干细胞制备为分散的单细胞后，通过缓速流动使其形成直径80-180μm 的多细胞球状结构，生产设备通常为三维摇床或水平摇床，制备体积在5-15mL，拟胚体制备量在2000-10000个。制备过程中对流速要求较严格，偏大流速会导致无法形成紧密球状结构，过小流速会导致拟胚体过大且容易粘连，不利于后期分化。由于其适合流速较缓(三维摇床5-15rpm，水平摇床40-80rpm)，且拟胚体沉降速率较高，扩大容器规格会难以平衡流速缓和及充分滚动的问题，因此很难通过单一扩大培养容器的方法实行大规模制备。这对下游大规模分化工艺造成了很大制约。

实用新型内容

本实用新型目的在于提供一种生产拟胚体的容器及设备，其不改变容器容积并实现拟胚体的大量生产。

为达成上述目的，本实用新型提出如下技术方案，一种生产拟胚体的容器，所述容器具有环形侧面，以及布设于所述容器的中轴线上的开口；所述开口采用无菌透气滤膜盖密封；所述环形侧面用于承载待分化为拟胚体的细胞及细胞分化用培养液。

在一些实施方案中，所述容器在自身中轴线的两端分别具有一开口，其中一开口配置无菌透气滤膜盖，另一开口配置带有弹性橡胶口的无菌透气滤膜盖；所述弹性橡胶口在自然状态下密封，在外力挤压下具有一开口。

在一些实施方案中，所述容器的本体的材料PETG、聚苯乙烯或聚碳酸酯。

在一些实施方案中，所述容器的底面为平面。

本申请的另一目的是提供一种用于生产拟胚体的设备，用于夹持所述的容器，包括：第一夹持件、第二夹持件、支架以及驱动电机；

所述第一夹持件与所述第二夹持件同轴设置，并且所述第一夹持件与所述第二夹持件之间形成有一夹持所述容器的夹持区域；所述第一夹持件与所述第二夹持件在外力作用下能发生相对运动，以调节所述夹持区域的尺寸；

所述支架用于支持所述第一夹持件与所述第二夹持件，所述第一夹持件与所述第二夹持件能分别发生相对于所述支架的同轴、同向与同速的转动；

所述驱动电机用于传动连接所述第一夹持件或所述第二夹持件，并驱动所述第一夹持件或所述第二夹持件转动。

在一些实施方案中，还包括布设于所述夹持区域下方的制动单元；所述制动单元包括带有凹槽的制动块与电机；所述带有凹槽的制动块具有匹配于所述容器的环形侧面的凹槽；所述电机用于驱动所述凹槽发生向上或向下运动。

在一些实施方案中，所述凹槽向上运动过程中与所述容器接触的部分具有缓冲层，所述缓冲层采用橡胶材质、海绵材质或硅胶材质。

在一些实施方案中，所述第一夹持件与所述第二夹持件在用于夹持所述容器的面均设有若干个透气孔。

在一些实施方案中，所述第一夹持件或所述第二夹持件上设有一通孔。

有益效果：

由以上技术方案可知，本实用新型采用容器的环形侧面去承载细胞，控制容器的中轴线转动以保证容器的环形侧面均具有均一的线速度，很好的平衡了制备过程中流速平缓和充分滚动间的矛盾，可放大生产的同时，还具备更大规模制备的潜力。同时单向流动比传统的涡旋流动相比，内部流体剪切力减小，对细胞成团过程中受剪切力不匀导致细胞团不够紧密、形状不规则有很好的改善。

本申请进一步的还提供了促使容器发生沿其中心轴转动的外力装置(用于生产拟胚体的装置)，外力装置布设有紧急制动机构，所述紧急制动机构能够更好的匹配本申请的容器，并通过面与面的接触摩擦降低容器的转动线速度，最终实现容器的停止转动，并避免容器内的细胞不会受到较大剪切力。

应当理解，前述构思以及在下面更加详细地描述的额外构思的所有组合只要在这样的构思不相互矛盾的情况下都可以被视为本公开的实用新型主题的一部分。

结合附图从下面的描述中可以更加全面地理解本实用新型教导的前述和其他方面、实施例和特征。本实用新型的其他附加方面例如示例性实施方式的特征和/或有益效果将在下面的描述中显见，或通过根据本实用新型教导的具体实施方式的实践中得知。

附图说明

附图不意在按比例绘制。在附图中，在各个图中示出的每个相同或近似相同的组成部分可以用相同的标号表示。为了清晰起见，在每个图中，并非每个组成部分均被标记。现在，将通过例子并参考附图来描述本实用新型的各个方面的实施例，其中：

图1绘示本申请的容器结构示意图；

图2绘示本申请用于生产拟胚体的装置的结构示意图；

图3绘示本申请图2紧急制动状态下示意图；

图4绘示本申请凹槽结构示意图；

图5绘示本申请的带有弹性橡胶口的无菌透气滤膜盖；

图1-4中，1、容器；2、容器的中轴线；3、含有细胞的培养液；4、驱动电机；5、带有凹槽的制动块；6、第一夹持件；7、支架；8、无菌透气滤膜盖； 9、弹性橡胶口；图中，箭头方向代表容器的中轴线转动方向。

图6对比例1获得的细胞在10倍镜检测拟胚体情况。

图7对比例2获得的细胞在10倍镜检测拟胚体情况。

图8对比例3获得的细胞在10倍镜检测拟胚体情况。

图9应用例1获得的细胞在10倍镜检测拟胚体情况。

图10应用例2获得的细胞在10倍镜检测拟胚体情况。

具体实施方式

为使本实用新型实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本实用新型实施例的附图,对本实用新型实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例是本实用新型的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于所描述的本实用新型的实施例,本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本实用新型保护的范围。除非另作定义, 此处使用的技术术语或者科学术语应当为本实用新型所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

在细胞治疗发展过程中，制备规模一直是其产量受限、成本居高不下的重要因素。而且制备规模受限的重要因素是科研级别的实验容器1难以符合生产级别的规模，改良细胞培养方式，使其具备放大规模的潜力是将科研成果转化为生产的有效方式。

本实用新型的技术方案提供了用于生产拟胚体的容器1，所述容器1具有一环形侧面。使用过程中，向所述容器1中加入待培养的细胞与用于培养细胞的培养液；外力驱动所述容器1绕自身中心轴线转动，使得细胞在所述容器1的环形侧面被培养，以保证所述容器1中的含有细胞的培养液3具有相近的线速度。本申请是通过设计具有环形侧面的容器1，如横向放置的圆柱形容器，控制容器1的水平中轴进行转动，使其为容器1中的培养液提供平稳流速的同时，避免细胞沉降在底部造成粘连。使用过程中，容器1为生物安全性良好的材料制成，瓶盖为无菌透气滤膜盖，可隔绝污染物并透气。

本申请采用环形侧面培养细胞相对于现有技术的摇床利用容器1的底面进行细胞培养，在变化容器1直径时，还具有更好的培养面积。具体为摇床上容器1的底面承载面积为πr²，本申请容器1的环形侧面积为2πrh，其中π代表圆周率，r代表容器1的半径、h代表容器1的高度，在改变r值的情况下，容器1的环形侧面积变化幅度大于容器1底面的面积变化幅度。故，本申请改变细胞培养用的面后仅用较小直径的变化即能实现较大细胞培养用面积，且在生产过程中细胞受到的线速度均一，细胞的代谢流分配也最为合理。

本申请人进行实验验证，当用于干细胞生产拟胚体时，容器1转动14-16 个小时即可形成拟胚体。经理论计算，采用本申请的培养方式，理论上可一次性制备拟胚体50000-100000个。

为了更好的说明本申请的技术方案，下面结合具体实施例，对本申请的技术方案做出仔细认真的阐述。

实施例1

如图1所示，一种容器1，所述容器1应用于所述的拟胚体的生产方式中，所述容器1具有环形侧面以承载含有细胞的培养液3；所述容器1还包括布设于所述容器的中轴线2上的开口；所述开口采用无菌透气滤膜盖密封，以保证所述容器1在培养细胞的过程中能够透气，保证所述容器1中所需气体的含量。所需气体包括但不限于空气。优选地，所述容器的开口的直径不大于所述容器的环形侧面直径的2/3。目的是保证容器侧放时所述含有细胞的培养液3不会被所述无菌透气滤膜盖污染。

在一些实施方案中，为了增强所述容器1的透气性，所述容器1在自身中轴线的两端分别具有一开口，其中一开口配置无菌透气滤膜盖，另一开口配置带有弹性橡胶口9的无菌透气滤膜盖8(如图5所示)；所述弹性橡胶口在自然状态下密封，在外力挤压下具有一开口，以方便外界通过弹性橡胶口向所述容器1中通入空气，增加细胞的代谢能力，促进拟胚体的形成。如外界的鼓风机通过橡胶软管连通于所述弹性橡胶口。而为了保证所述容器1能够顺利转动，所述橡胶软管的接头带有一个轴承结构，所述轴承采用生物材料制备而成，如PETG、聚苯乙烯或聚碳酸酯。

使用状态下，一管道挤压所述弹性橡胶口并连通所述容器1，另一端无菌透气滤膜盖能够自然透气，通过对流的方式实现容器1内所需气体的补充，提高细胞的代谢速度。在一些实施例中，所述容器1采用无菌透气滤膜盖；所述容器1的本体的材料PETG、聚苯乙烯或聚碳酸酯。容器1材料的限制能够避免细胞粘壁进而影响拟胚体质量。

在一些实施例中，所述容器1的底面为平面；也可以为锥型结构底部、半圆型结构底部、向容器1内凹陷的底部等结构。

在本实施例中所述容器1可选用底部为锥型结构底部、半圆型结构底部、向容器1内凹陷的底部等结构，目的以保证容器1卧放(容器的中轴线2平行于放置面的放置位为卧放)时容器1底部不会滞留细胞。

在本实施例中所述培养容器1可为玻璃材质，也可为塑料材质。所述玻璃材质为生物活性玻璃或镜片玻璃，上述材质主要具有好的理化性能，不会影响细胞的分化。所述塑料材质包括PS塑料或PP塑料。所述容器1的盖体中含有 0.2μm的疏水滤膜。

实施例2

如图2所示，一种用于生产拟胚体的装置，用于夹持所述的容器11，并带动所述容器1进行绕自身轴线(即容器的中轴线2)的运动。

所述容器1具有环形侧面以承载含有细胞的培养液3；所述容器1还包括布设于所述容器的中轴线2上的开口；所述开口采用无菌透气滤膜盖密封，以保证所述容器1在培养细胞的过程中能够透气，保证所述容器1中的所需气体含量。

所述用于生产拟胚体的装置包括：同轴设置的第一夹持件6、第二夹持件、支架7以及驱动电机4。所述第一夹持件6与所述第二夹持件同轴设置，并且所述第一夹持件6与所述第二夹持件之间形成有一夹持所述容器1的夹持区域；同时，所述第一夹持件6与所述第二夹持件在外力作用下能发生相对运动，以调节所述夹持区域的尺寸；所述支架7用于支持所述第一夹持件6与所述第二夹持件，所述第一夹持件6与所述第二夹持件能分别发生相对于所述支架7的同轴、同向与同速的转动；所述驱动电机4用于传动连接所述第一夹持件6或所述第二夹持件，并驱动所述第一夹持件6或所述第二夹持件转动。

详细地，所述第一夹持件6与所述第二夹持件在外力作用下能发生相对运动，以调节所述夹持区域的尺寸。在一些实施例中采用的是：所述第一夹持件6 与所述第二夹持件的底部均设有滑块，两个滑块的底部分设一个电机，所述支架7在用于支撑所述第一夹持件6与所述第二夹持件的面上设有供所述第一夹持件6与所述第二夹持件滑动的滑槽，所述电机则是驱动所述第一夹持件6或所述第二夹持件的滑块沿所述滑槽滑动。在一些实施方案中，所述第一夹持件6 与所述第二夹持件上在同一高度设有一螺纹孔，所述第一夹持件6与所述第二夹持件上的螺纹孔采用一丝杆连接，所述丝杆具有连接端(用于连接所述第一夹持件6与所述第二夹持件)与手柄端，且位于所述连接端与所述手柄端之间设有刻度区，所述刻度区能够显示所述第一夹持件6与所述第二夹持件之间的距离；同时所述刻度区配置有辅助元件，所述辅助元件的一端在所述丝杆调节所述第一夹持件6与所述第二夹持件之间间距时能够抵挡于所述第一夹持件6 或所述第二夹持件，另一端能够在刻度区自由滑动以显示所述第一夹持件6与所述第二夹持件之间的距离。

使用时，所述容器1中加入含有细胞的培养液3，控制添加的含有细胞的培养液3占所述容积的10％-30％；卧放所述容器1，并将所述容器1放置于所述夹持区域，并调节所述第一夹持元件与所述第二夹持元件夹紧所述容器1，采用驱动电机4驱动所述第一夹持元件与所述第二夹持元件转动，控制转速介于 1-40rpm。

也有将容器1卧放于同向转动的双辊上，以实现容器1的侧面具有均一的线速度，但该种方式对容器1的要求更高，如仅能适用于容器1用于承载培养液的环形侧面的直径大于容器1底部与顶部的直径，否则容器1内培养液会因分布不均产生震荡，故该种方案适用于一些大批量的容器1的环形侧面直径大于容器1底部与顶部的直径的情况、且该种方式需要容器1的直径与所述双辊的直径由严格的适配性，否则导致容易被所述双辊之间的缝隙锁定。实际使用时，要求双辊之间的间隙介于容器1直径的1/20-4/5。

实施例3

如图3-4所示，区别于实施例2的是，还包括布设于所述第一夹持件6与所述第二夹持件所形成夹持区域下方的制动单元；所述制动单元包括带有凹槽的制动块5与电机；所述带有凹槽的制动块5具有匹配于所述容器1的环形侧面的凹槽；所述电机用于驱动所述凹槽发生向上或向下运动。

本实施例的配置主要用于所述第一夹持件6或所述第二夹持件在驱动电机4 失效或者其他需要紧急制动有不影响拟胚体的状态的制动，具体实现方式是在需要紧急制动时，电机驱动所述凹槽缓慢向上运动，通过与所述容器1的表面进行接触，形成面摩擦，同时随着压力的增大而增大面摩擦的摩擦力，最终实现容器1的紧急制动。

实施例4

区别于实施例3的是：所述凹槽用于与所述容器1接触的面具有缓冲层，所述缓冲层采用橡胶材质、海绵材质或硅胶材质。目的在需要紧急制动时，电机带动凹槽向上运动，阻止容器1发生转动，缓冲层在紧急制动过程中有一定缓冲作用，避免因紧急制动导致的容器1内培养液发生大幅度震荡。橡胶材质、海绵材质或硅胶材质应用时，不会磨损容器1，同时兼具较大的摩擦系数。

实施例5

区别于实施例2的是，所述第一夹持件6与所述第二夹持件在用于夹持所述容器1的面均设有若干个透气孔。尤其适用于所述容器1在自身轴线方向的两端分别具有一开口，其中一开口配置无菌透气滤膜盖，另一开口配置带有弹性橡胶口的无菌透气滤膜盖，所述弹性橡胶口在自然状态下密封，在外力挤压下具有一开口的情形。

通过透气孔或者通过管道贯穿通孔后连通弹性橡胶孔实现向所述容器1中通入空气，提高培养液中的所需气体含量，加快细胞的代谢。为了避免管道与通孔之间摩擦影响容器1的线速度，所述管道与通孔之间安装有轴承，所述轴承可采用滚动轴承、深沟球轴承、圆柱滚子轴承或圆锥滚子轴承。

效果验证

一种拟胚体生产方式，包括如下步骤：1)获取具有环形侧面的前述容器1 的直径为12cm，高20cm。2)获取待培养为拟胚体的细胞；所述细胞为干细胞。所述干细胞包括诱导多能干细胞或间充质干细胞。3)向所述容器1中加入待培养的细胞与用于培养细胞的培养液；所述培养液选用市售的培养基，包括但不限于Gibco或StemCell系的培养基、太东干细胞系列培养基。4)采用本申请用于拟胚体生产的装置驱动所述容器1绕自身中心轴线转动。

对比例1-3以及应用例1-3具有相同的容器1，区别的是线速度不同、接种密度不同以及培养液体积占比不同，参数见表1。

表1对比例1-3以及应用例1-3工艺参数验证

	线速度(cm/s)	接种密度(M/mL)	培养液占容器1容积的百分比(％)
				对比例1	0.5	1.5	5
对比例2	20	0.1	35
				对比例3	55	3.5	20
应用例1	1	0.2	10
				应用例2	20	1.5	20
应用例3	50	3	30

采用上述方案与工艺参数分别获得对应的拟胚体。

验证方法：在显微镜下看拟胚体的总数，直径和圆润度。

对比例1，细胞聚集成不规则且松散的大细胞团，未能形成拟胚体，如图6 所示，10倍镜检测细胞团情况。

对比例2，形成的细胞团圆润度较差且较松散，数量较少，共8W，约100 个/mL。瓶口处有培养基浸没痕迹，无菌透气膜有浸湿现象，如图7所示，10倍镜检测细胞团情况。

对比例3，未能形成拟胚体，只极少量小细胞聚团，如图8所示，10倍镜检测细胞团情况。

应用例1，形成拟胚体较大，约68W，约1500个/mL。圆润的较好，如图9 所示，10倍镜检测拟胚体情况。

应用例2，形成拟胚体数量正常，约1.2W，约50个/mL。圆润的较好，直径在180-220μm之间分布，如图10所示，10倍镜检测拟胚体情况。

应用例3，形成的拟胚体较小，约500W，约4000个/mL。圆润的较好，直径在40-80μm之间分布，10倍镜检测拟胚体情况。

综上，本申请的容器及装置在匹配现有的细胞生产规模时，能够有效满足更大体量的细胞规模的生产。并且规范如下参数能得到更好的生产效果，瓶体设置直径5-20cm；高度为8-40cm；优选为8-12cm，高20cm，方便常规操作；当然根据生产规模，瓶体直径可以为大于12cm，高度按需要自由设计如20cm以上或20cm以下。参考传统工艺，理论上外周线速度介于1cm/s至50cm/s能够保证细胞分化过程中能够产生拟胚体。为了匹配于现有细胞生产规模，实际应用时，容器1的转速1-40rpm。为了避免转动过程中，培养液接触瓶口，造成污染，培养液的体积占所述容器1总容积的10％-30％。当用于批量化的细胞生产时，为了实现细胞的最大效率生产。将处理成单细胞的干细胞的在培养瓶(容器1) 接种密度为0.2M/mL-3M/mL。

虽然本实用新型已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本实用新型。本实用新型所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本实用新型的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本实用新型的保护范围当视权利要求书所界定者为准。

Claims

1.一种生产拟胚体的容器，其特征在于，所述容器具有环形侧面，以及布设于所述容器的中轴线上的开口；所述开口采用无菌透气滤膜盖密封；所述环形侧面用于承载待分化为拟胚体的细胞及细胞分化用培养液。

2.根据权利要求1所述的一种生产拟胚体的容器，其特征在于，所述容器在自身中轴线的两端分别具有一开口，其中一开口配置无菌透气滤膜盖，另一开口配置带有弹性橡胶口的无菌透气滤膜盖；所述弹性橡胶口在自然状态下密封，在外力挤压下具有一开口。

3.根据权利要求1所述的一种生产拟胚体的容器，其特征在于，所述容器的本体的材料PETG、聚苯乙烯或聚碳酸酯。

4.根据权利要求1所述的一种生产拟胚体的容器，其特征在于，所述容器的底面为平面。

5.一种用于生产拟胚体的设备，用于夹持权利要求1-4任一所述一种生产拟胚体的容器，其特征在于，包括：第一夹持件、第二夹持件、支架以及驱动电机；

6.根据权利要求5所述的一种用于生产拟胚体的设备，其特征在于，还包括布设于所述夹持区域下方的制动单元；所述制动单元包括带有凹槽的制动块与电机；所述带有凹槽的制动块具有匹配于所述容器的环形侧面的凹槽；所述电机用于驱动所述凹槽发生向上或向下运动。

7.根据权利要求6所述的一种用于生产拟胚体的设备，其特征在于，所述凹槽向上运动过程中与所述容器接触的部分具有缓冲层，所述缓冲层采用橡胶材质、海绵材质或硅胶材质。

8.根据权利要求5所述的一种用于生产拟胚体的设备，其特征在于，所述第一夹持件与所述第二夹持件在用于夹持所述容器的面均设有若干个透气孔。

9.根据权利要求5所述的一种用于生产拟胚体的设备，其特征在于，所述第一夹持件或所述第二夹持件上设有一通孔。