CN214668100U - 冷冻芯片、冷冻系统及样品测试系统 - Google Patents

冷冻芯片、冷冻系统及样品测试系统 Download PDF

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Abstract

本公开实施例公开了一种冷冻芯片、冷冻系统及样品测试系统，所述冷冻芯片包括芯片基底；样品放置层，其表面划分为不少于一个局部温控区域，所述局部温控区域用于放置样品；若干个控温单元，用于调整局部温控区域的温度；其中，所述芯片基底具有支撑面，用于支撑所述样品放置层的顶面或底面的部分区域形成第一接触面；所述第一接触面的区域与所述局部温控区域在同一平面的投影不完全重叠。该技术能够在对样品进行原位观察与表征的过程中选择特定时间进行冷冻和解冻，通过界面热阻设计获得高于105℃/s的冷冻与加热速度，保证样品不受破坏。这对于生物样品冷冻、解冻与原位显微观察等相关操作是一项重大改进，具有重大意义和广泛应用前景。

Description

冷冻芯片、冷冻系统及样品测试系统
技术领域
本公开涉及生物医学技术领域，具体涉及一种冷冻芯片、冷冻系统及样品测试系统。
背景技术
生物样品的快速冷冻与加热技术在生物医学领域有很多重要的应用，例如细胞冷冻储存与复活，蛋白质冷冻固定表征等。
目前的生物冷冻技术，主要有插入式冷冻、喷射式冷冻以及高压冷冻。插入式冷冻(plunge freeze)是目前行业内最为常用的制样方法。插入式冷冻通常将负载生物样品的样品台(微栅)固定在样品杆前端，由机械控制将样品快速插入低温液体，例如液态乙烷，或液氮等，从而完成对生物样品的冷冻。喷射式冷冻(jetting freeze)，通常将负载生物样品的样品台通过样品杆传送至冷冻腔特定位置，然后采用高压液氮蒸汽对样品进行高速喷射，从而完成对生物样品的冷冻。高压冷冻(high pressure freeze)与插入式冷冻原理相似，采用低温液体冷冻样品，但在冷冻的同时在样品腔内施加2000个大气压左右的高压，降低水的结冰温度，同时抑制冰结晶过程中产生的体积膨胀，从而避免冰结晶对生物样品结构的破坏，制备质量较高的冷冻生物样品。
但是，插入式冷冻存在如下缺陷：由于需要将样品整体插入低温液体，因此在冷冻过程中，无法针对样品特定区域进行选择性冷冻，在冷冻过程中也无法原位进行实时显微观察。喷射式冷冻在插入式冷冻的基础上，用液氮蒸汽代替低温液体，提高了传热效率。高压冷冻与上述两种冷冻方式的原理相似，由于高压抑制冰结晶，冷冻效果较好，样品质量较高。但喷射式冷冻和高压冷冻同样具有不能够实时显微观察和局部选区冷冻的缺陷。这些缺陷限制了人们对冷冻生物样品更进一步的深入研究。
现有技术中还提出一种快速冷冻样品的装置，该装置包括：一个样品容器以及位于容器侧面支撑该样品容器的加热支撑装置，样品容器放置在底座上，通过控制该加热支撑装置的开关，实现样品的快速冷冻。该装置由于样品是设置在封闭的样品承载结构中，样品承载装置的壁将样品与加热支撑装置分隔，产生额外的热阻，从而导致冷冻样品的冷冻速度不够理想。此外，在加热恢复冷冻生物样品方面，目前常规方法加热速度较慢，通常需要在样品中加入DMSO等辅助介质才能保证在加热过程中不破坏生物样品，这对于生物样品的活性有影响，无法表达生物样品如细胞等，在正常环境中的真实表现。
实用新型内容
为了解决相关技术中的问题，本公开实施例提供一种冷冻芯片、冷冻系统及样品测试系统。
第一方面，本公开实施例提供了一种冷冻芯片。
具体地，所述冷冻芯片与低温冷源接触，用以冷冻样品，所述冷冻芯片包括：样品放置层，其表面划分为至少一个局部温控区域，所述局部温控区域用于放置样品；若干个温控单元，用调整所述局部温控区域的温度；其中，所述温控单元为导电材料；芯片基底，支撑所述样品放置层的顶面或者底面形成第一接触面；所述第一接触面与所述局部温控区域在同一平面的投影不重叠或者部分重叠。
可选地，所述芯片基底支撑于样品放置层的中心区域外的周边区域，所述中心区域划分为至少一个局部温控区域；或者所述芯片基底支撑于所述样品放置层的中心区域，所述中心区域外的周边区域划分为至少一个局部温控区域；或者所述芯片基底支撑于所述局部温控区域的间隔位置处。
可选地，所述芯片基底支撑所述样品放置层的顶面形成所述第一接触面时，所述芯片基底上还具有第二接触面，用于与所述低温冷源接触；其中，所述第一接触面与所述第二接触面位于所述芯片基底的同一侧面。
可选地，所述温控单元与所述样品放置层为一体化结构。
可选地，所述温控单元采用芯片微纳加工工艺设置于所述样品放置层，利用所述温控单元划分所述局部温控区域。
可选地，所述样品放置层为导热层；所述温控单元设置在所述导热层上，以在所述导热层上划分所述局部温控区域；或者
所述样品放置层包括：导热层和采用芯片微纳加工工艺制作于所述导热层上的第一隔离层；其中，所述温控单元设置在所述第一隔离层上，以在所述第一隔离层上划分所述局部温控区域；或者
所述样品放置层包括：导热层、采用芯片微纳加工工艺制作于所述导热层上的第一隔离层和采用芯片微纳加工工艺制作于所述第一隔离层上的第二隔离层；其中，所述温控单元设置在所述第一隔离层上，以在所述第二隔离层上划分所述局部温控区域；或者
所述样品放置层包括：第三隔离层、采用芯片微纳加工工艺制作于所述第三隔离层上的导热层、采用芯片微纳加工工艺制作于所述导热层上的第一隔离层和采用芯片微纳加工工艺制作于所述第一隔离层上的第二隔离层；其中，所述温控单元设置在所述第一隔离层上，以在所述第二隔离层上划分所述局部温控区域；或者
所述样品放置层包括：第三隔离层、采用芯片微纳加工工艺制作于所述第三隔离层上的第一隔离层、采用芯片微纳加工工艺制作于所述第一隔离层上的导热层和采用芯片微纳加工工艺制作于所述导热层上的第二隔离层；其中，所述温控单元设置在所述第三隔离层上，以在所述第二隔离层上划分所述局部温控区域。
可选地，所述样品放置层包括：分体设置的至少一个样品层、加热层、第四隔离层、导热层以及第五隔离层；其中，所述样品层表面划分为至少一个局部温控区域；所述温控单元设置在所述加热层上。
可选地，所述导热层靠近所述温控单元的部分与所述导热层端部部分的厚度大于二者之间导热层部分的厚度；和/或所述导热层靠近所述温控单元的部分与所述导热层端部部分之间的导热层部分采用图案化结构设置。
可选地，所述局部温控区域设置有至少一个容纳样品的闭口样品容纳腔和/或开口样品容纳腔。
可选地，所述温控单元还包括设置在所述闭口样品容纳腔和/或开口样品容纳腔的壁上的辅助温控单元。
可选地，所述样品放置层设置有光通路通道，以适配显微镜、光电探测器、X射线、拉曼光谱仪、红外光谱仪。
可选地，所述冷冻芯片由透光材料制成或者具有穿孔通道作为所述光通路通道。
可选地，所述冷冻芯片用芯片微纳加工工艺制成。
可选地，所述冷冻芯片的厚度控制在0.1-2mm。
第二方面，本公开实施例提供了一种样品台组件，包括第一方面任一项所述的冷冻芯片。具体地，所述样品台组件包括：与所述温控单元电连接的控制器，用于调整所述温控单元的温度。
可选地，所述样品台组件还包括：样品热沉，用于容纳所述冷冻芯片。
第三方面，本公开实施例提供了冷冻系统，包括第二方面任一项所述的样品台组件。具体地，所述冷冻系统包括：低温冷源；固定所述样品台组件的热沉底座，与所述低温冷源接触。
可选地，所述冷冻系统还包括：
冷冻介质密封盖板，所述冷冻介质密封盖板用于密封所述低温冷源。
可选地，所述冷冻系统还包括：
样品盖板，其面积至少能够密封所述热沉底座的开口。
第四方面，本公开实施例提供了一种样品测试系统，包括第三方面所述的冷冻系统。具体地，所述样品测试系统包括；
与所述冷冻系统配套使用的显微观察装置和/或探测装置。
可选地，所述显微观察装置为正置光学显微镜、倒置光学显微镜、电子显微镜中的至少一种；所述探测装置为光电探测器、X射线、拉曼光谱仪、红外光谱仪中的至少一种。
本公开实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：
(1)本公开实施例的冷冻芯片，通过设置至少一个局部温控区域，利用温控单元调整局部温控区域的温度，可以有选择地冷冻样品，对于不需要冷冻的样品，控制温控单元释放热量以维持样品与低温冷源的温度梯度，对于需要冷冻的样品，调整温控单元的电学参数，以使样品热量传导至低温冷源，从而实现了局部选区冷冻的效果。
(2)本公开实施例的冷冻芯片，温控单元与样品放置层一体化设置，当冷冻芯片与低温冷源接触时，在样品放置层内形成样品与低温冷源的温度梯度，通过调整温控单元的电学参数，样品热量能够快速沿温度梯度方向传导，从而实现样品的快速冷冻，能够为其他测试装置提供低温制样，比如显微镜、X射线装置等。
(3)本公开实施例的冷冻芯片，通过设计导热层的结构，将温度梯度限制在导热层靠近温控单元的部分与导热层端部部分之间的导热层部分，在保证传热速度的同时，减小被冷冻部分的热容，使得冷冻速度高于105℃/s，对于细胞样品来说，快速冷冻样品不会破坏细胞样品，便于更好地研究细胞生物学行为。
(4)本公开实施例的冷冻芯片，样品放置层具有光通路通道，从而可以适配测试装置对样品进行原位表征，比如显微镜、X射线装置等，从而实现冷冻样品的同时、原位实时测试样品，提高了样品测试效率。
应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本公开。
附图说明
结合附图，通过以下非限制性实施方式的详细描述，本公开的其它特征、目的和优点将变得更加明显。在附图中：
图1a示出根据本公开实施例的冷冻芯片的主视图；
图1b示出图1aDD′方向的剖面图；
图1c示出根据本公开的另一实施例的冷冻芯片的剖面图；
图1d示出根据本公开的另一实施例的冷冻芯片的剖面图；
图2a-图2e示出根据本公开的实施例的样品放置层的结构示意图；
图3示出根据本公开的实施例的样品放置层内温度梯度的示意图；
图4示出根据本公开实施例的放置样品的冷冻芯片的结构示意图；
图5示出根据本公开实施例的样品台组件的结构示意图；
图6示出根据本公开实施例的冷冻系统的结构示意图；
图7示出根据本公开实施例的冷冻样品的方法的流程示意图；
图8示出根据本公开实施例的温控单元工作的基本原理示意图；
图9示出根据本公开实施例的加热样品的方法的流程示意图；
图10示出根据本公开实施例的显微观察样品的方法的流程示意图；
图11示出芯片以及片上冷冻前后细胞样品的示意图；
图12示出根据图2a-2e的冷冻芯片的冷冻速率示意图。
具体实施方式
下文中，将参考附图详细描述本公开的示例性实施例，以使本领域技术人员可容易地实现它们。此外，为了清楚起见，在附图中省略了与描述示例性实施例无关的部分。
在本公开中，应理解，诸如“包括”或“具有”等的术语旨在指示本说明书中所公开的特征、数字、步骤、行为、部件、部分或其组合的存在，并且不欲排除一个或多个其他特征、数字、步骤、行为、部件、部分或其组合存在或被添加的可能性。
另外还需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本公开。
现有技术中，插入式冷冻存在如下缺陷：由于需要将样品整体插入低温液体，因此在冷冻过程中，无法针对样品特定区域进行选择性冷冻，在冷冻过程中也无法原位进行实时显微观察。喷射式冷冻在插入式冷冻的基础上，用液氮蒸汽代替低温液体，提高了传热效率。高压冷冻与上述两种冷冻方式的原理相似，由于高压抑制冰结晶，冷冻效果较好，样品质量较高。但喷射式冷冻和高压冷冻同样具有不能够实时显微观察和局部选区冷冻的缺陷。这些缺陷限制了人们对冷冻生物样品更进一步的深入研究。同时，目前尚未出现能够高速加热恢复冷冻样品的成熟技术。
为至少部分地解决发明人发现的现有技术中的问题而提出本公开。
本公开提供的冷冻芯片与插入式冷冻、喷射式冷冻以及高压冷冻这三种方式，在冷冻样品的原理上存在不同。其差异在于，冷冻芯片上放置的样品不与冷冻介质(比如液氮)直接接触，而是在冷冻介质冷却样品台(通常将芯片置于样品台，样品台浸入到冷冻介质中)的同时，采用外加电阻加热方式将样品保持在较高温度。在关闭电阻加热后，样品热量快速传递到低温样品台，从而实现样品的快速冷冻。
图1a示出根据本公开实施例的冷冻芯片的主视图。图1b-图1d中示出的低温冷源A并不是冷冻芯片10的一部分，本公开中低温冷源A为提供冷冻芯片10低温环境并与冷冻芯片10直接接触的装置，比如冷冻芯片10使用时，放置在样品热沉上，然后将样品热沉固定于浸入低温冷源的热沉底座，因此，样品热沉也具有低温冷源(比如液氮)的温度，可被视为低温冷源A。以上为示意性说明，本公开并不限制低温冷源A。
如图1a-图1d所示，所述冷冻芯片10包括：芯片基底11、样品放置层12和若干个温控单元13。芯片基底11与支撑样品放置层12的顶面或者底面接触，形成第一接触面14。所述样品放置层12的表面划分为至少一个局部温控区域N，所述局部温控区域N用于放置样品。所述温控单元13通常采用焦耳加热(电流通过电阻产生热量)的方式在局部产生热量，以调整局部温控区域N的温度。所述第一接触面14的区域P与所述局部温控区域N在同一平面的投影不重叠或者部分重叠。
根据本公开的实施例，所述样品放置层12的顶面用于放置样品，芯片基底11通常支撑样品放置层12的底面形成第一接触面14(如图1b所示)，芯片基底11也可以支撑样品放置层12的顶面形成第一接触面(如图1c所示)，图1d同样示出了芯片基底11支撑样品放置层12的顶面，与图1c不同的是，芯片基底11支撑样品放置层12的顶面形成所述第一接触面时，所述芯片基底11上还具有第二接触面，用于与所述低温冷源A接触；其中，所述第一接触面与所述第二接触面位于所述芯片基底的同一侧面。根据本公开的实施例，样品可以直接与样品放置层12接触，相对非直接接触，可以避免产生额外的热阻，提高冷冻速率。
上述图1b-1d所示的说明作为一种示意性说明，具体根据需要可以灵活选择，本公开并不局限于上述设置方式，在此不予赘述。
根据本公开的实施例，同一平面可以是样品放置层12所在平面。如图1b所示，第一接触面14的区域P与局部温控区域N并不重叠，局部温控区域N内样品热量沿着箭头所示方向，由局部温控区域N横向传导至区域P后，沿着芯片基底11传导至低温冷源A。图1c所示，区域P与局部温控区域N部分重叠，局部温控区域N1内样品热量沿着箭头所示方向，由局部温控区域N1横向传导至区域P1后，沿着芯片基底11传导至低温冷源A，与图1b不同的是，局部温控区域N2内样品热量沿着箭头所示方向，由局部温控区域N2纵向传导穿过温控单元13后，沿着芯片基底11传导至低温冷源A。
需要说明的是，温控单元13的导线可能会穿过样品放置层12与冷冻芯片10外的控制器连接，在调整所述局部温控区域N内样品的温度时，所述导线部分产生的热量可以忽略不计。
图1b-1d示出的冷冻芯片，样品热量能够沿横向传导、纵向传导方向传导至低温冷源A，从而冷冻样品。而且，芯片基底11的中心区域是中空的，可以适配测试装置对样品进行原位表征，比如显微镜、X射线装置等，本公开对此不做限制。
本公开提供的冷冻芯片使用时，冷冻样品前，将冷冻芯片放置于低温冷源A上，温控单元13维持样品在第一温度比如20℃至30℃，此时，样品与低温冷源A的温度梯度形成于样品放置层内。冷冻开始后，调整温控单元13的电学参数，局部温控区域N内的样品热量沿温度梯度方向传导，从而实现样品的快速冷冻，之后检测电学参数将样品温度调整至所需的第二温度，比如低温冷源A可以提供-190℃的低温时，可以将样品温度调整至-140℃。
需要说明的是，第二温度根据低温冷源A的温度确定，不低于该温度即可，本公开对此不做限制。
本公开实施例的冷冻芯片，通过设置至少一个局部温控区域，利用温控单元调整局部温控区域的温度，可以有选择地冷冻样品，对于不需要冷冻的样品，控制温控单元释放热量以维持样品与低温冷源的温度梯度，对于需要冷冻的样品，调整温控单元的电学参数，以使样品热量传导至低温冷源，从而实现了局部选区冷冻的效果。
根据本公开的实施例，所述芯片基底11支撑于所述样品放置层12的中心区域外的周边区域；所述样品放置层12的中心区域划分为至少一个局部温控区域。比如，所述芯片基底11为与所述样品放置层12的中心区域外的周边相适配的环绕结构，环绕支撑所述样品放置层12的顶面或者底面；或者芯片基底11为独立的支撑块，支撑于中心区域的一侧或两侧等等；其中，所述中心区域划分为至少一个局部温控区域N。所述中心区域的上方或者下方可以适配测试装置对样品进行原位表征，比如显微镜、X射线装置等。
作为另外一种实施方式，所述芯片基底11支撑于所述样品放置层12的中心区域；所述中心区域外的周边区域划分为至少一个局部温控区域N。比如，冷冻芯片成T型，样品放置层12水平方向设置，其被芯片基底11支撑的区域并不用于划分局部温控区域N，而在围绕着支撑区域的四周划分若干局部温控区域N。
一些情况下，芯片基底11也可以支撑于所述局部温控区域N的间隔位置处。比如，芯片基底11至少为两块独立的支撑块，分别用于支撑样品放置层12，则可以分别在支撑块之间的区域、支撑块外的周边区域划分局部温控区域N。
根据本公开的实施例，所述冷冻芯片10采用芯片微纳加工工艺制成，例如芯片领域内的薄膜沉积工艺、干法或湿法刻蚀工艺、光刻工艺等工艺，本公开在此不再赘述。
根据本公开的实施例，所述冷冻芯片10的整体厚度控制在0.1-2mm。
根据本公开的实施例，所述样品放置层12设置有光通路通道，从而可以适配测试装置对样品进行原位表征，比如显微镜、X射线装置等，从而实现冷冻样品的同时、原位实时测试样品，提高了样品测试效率。具体地，所述冷冻芯片由透光材料制成或者具有穿孔通道作为所述光通路通道，以适配正置光学显微镜、倒置光学显微镜、电子显微镜、光电探测器、X射线、拉曼光谱仪、红外光谱仪等监测仪器。
根据本公开的实施例，所述芯片基底11作为冷冻芯片10的机械载体部分，芯片基底11的厚度通常在0.1-2mm，所用材料通常为硅(比如硅片)、碳化硅。
根据本公开的实施例，温控单元13采用芯片微纳加工工艺设置于所述样品放置层12内，利用所述温控单元13划分所述局部温控区域局部温控区N。每个局部温控区域N均可以独立地由相应的温控单元13来控制加热以及停止加热，从而独立调整放置于不同局部温控区域N内的样品的温度，一些情况下，也可以联合一并调整几个局部温控区域N内的样品的温度，本公开对此不做限制。
根据本公开的实施例，所述温控单元13的厚度通常在0.1-5um，所用材料通常为导电材料，例如金属(铝、铜、铂等)、金属化合物(氮化钛，氧化铟锡等)或半导体(硅、碳化硅等)。
图2a-图2e示出根据本公开的实施例的样品放置层的结构示意图。如图2a-图2e所示，所述样品放置层12包括：导热层121、第一隔离层122、第二隔离层123和第三隔离层124。其中，导热层121用于横向传导样品热量至低温冷源A，第一隔离层122用于隔离导热层121和温控单元13，第二隔离层123用于隔离温控单元13与其外部接触环境，起到绝缘和保护温控单元13的作用，第三隔离层124用于隔离芯片基底11和导热层121。其中，第一隔离层122、第二隔离层123以及第三隔离层124根据情况均可以省略。
其中，所述导热层121的材料可以为金属(如铝、铜、铂等)、导热陶瓷(氧化铝、氮化铝等)或其他导热材料(如硅、碳化硅、氮化硅等)。所述导热层121的厚度通常在0.1-5um。
根据本公开的实施例，所述温控单元13与所述样品放置层12为一体化结构。
如图2a所示，所述样品放置层12仅包括导热层121；所述温控单元13设置在所述导热层121上，以在所述导热层121上划分所述局部温控区域N。该实施方式中，样品放置层12仅由导热层构成，维持样品温度的功率消耗较大，但是具有较高的冷冻速度，冷冻芯片的冷冻速度可以达到105-106℃/s。
如图2b所示，所述样品放置层12包括：导热层121和采用芯片微纳加工工艺制作于所述导热层121上的第一隔离层122；其中，所述温控单元13设置在所述第一隔离层122上，以在所述第一隔离层122上划分所述局部温控区域。该实施方式中，冷冻芯片的冷冻速度相比于图2a较小，仍然可以达到105-106℃/s。
如图2c所示，所述样品放置层12包括：导热层121、采用芯片微加工工艺制作于所述导热层121上的第一隔离层122和采用芯片微加工工艺制作于所述第一隔离层上122的第二隔离层123；其中，所述温控单元13设置在所述第一隔离层122上，以在所述第二隔离层123上划分所述局部温控区域N。该实施方式中，第一隔离层122上设置有第二隔离层123，避免了温控单元13裸露于外界环境，起到延长冷冻芯片使用寿命的作用，经过测试，冷冻芯片的冷冻速度仍然可以达到105-106℃/s。
如图2d所示，所述样品放置层12包括：第三隔离层124、采用芯片微纳加工工艺制作于所述第三隔离层124上的导热层121、采用芯片微纳加工工艺制作于所述导热层121上的第一隔离层122和采用芯片微纳加工工艺制作于所述第一隔离层122上的第二隔离层123；其中，所述温控单元13设置在所述第一隔离层122上，以在所述第二隔离层123上划分所述局部温控区域N。该实施方式中，导热层121下设置有第三隔离层123，考虑到导热层121通常采用金属材料，基于加工工艺的便捷性，可以在导热层121与芯片基底11之间设置第三隔离层123，从而满足了工艺需求，经过测试，冷冻芯片的冷冻速度仍然可以达到105℃/s。
如图2e所示，所述样品放置层12包括：第三隔离层124、采用芯片微纳加工工艺制作于所述第三隔离层124上的第一隔离层122、采用芯片微纳加工工艺制作于所述第一隔离层122上的导热层121和采用芯片微纳加工工艺制作于所述导热层121上的第二隔离层123；其中，所述温控单元13设置在所述第三隔离层124上，以在所述第二隔离层123上划分所述局部温控区域。该实施方式中，与图2d中实施方式不同的是，温控单元13位于导热层121下方，更接近与芯片基底11以及低温冷源A，因此具有较大的功率消耗，经过测试，冷冻芯片的冷冻速度仍然可以达到105℃/s。
具体的，如图12所示，对于空白芯片，温度从300K(对应横轴时间点1.4ms)下降到90K(对应横轴时间点2.6ms)用时为1.2ms，冷冻速率达到约1.8×105℃/s，同样的，冷冻样品的含水芯片将样品温度从300K(对应横轴时间点1.4ms)冷冻到90K(对应横轴时间点3.6ms)也仅需2.2ms，冷冻速率达到1.0×105℃/S。在本公开中，如无特殊说明，空白芯片是指不负载样品的芯片，含水芯片是指负载液体样品的芯片。
图2a-图2e中，所述导热层121的材质优选为高热导材料，例如金属材质，以提高冷冻速度。
上述所示的具体方式作为一种示意性说明，具体根据需要可以灵活选择，本公开并不局限于上述方式，在此不予赘述。
本公开实施例的冷冻芯片，通过设计导热层的结构，将温度梯度限制在导热层靠近温控单元的部分与导热层端部部分之间的导热层部分，从而限制局部温控区域的热容，使得冷冻速度高于105℃/s，对于细胞样品来说，快速冷冻样品不会破坏细胞样品，便于更好地研究细胞生物学行为。
本领域普通技术人员可以理解，依据设计需要，上述芯片基底、样品放置层，样品放置层中的导热层、第一隔离层、第二隔离层可以是不连续的，在其中可以开洞、开槽等以调整导热率或者利于通光观测。
作为另外一种实施方式，所述样品放置层12包括：分体设置的至少一个样品层、加热层、第四隔离层、导热层以及第五隔离层；其中，所述样品层表面划分为至少一个局部温控区域；所述温控单元设置在所述加热层上。
与图2a-图2e所示的样品放置层不同的是，样品放置层12整体采用非一体化结构，使用时，依次叠加样品层、加热层、第四隔离层、导热层以及第五隔离层，并用外置夹具固定。其中的样品层与其他各层独立设置，加热层、第四隔离层、导热层以及第五隔离层可以彼此独立设置，也可以采用芯片微纳加工工艺组合其中的两层或三层等，在组合时需按照样品放置层使用时的叠加次序组合。由于样品层可以独立设置，因此根据需要可以灵活设置样品层的数量，并且当某个样品层损坏时可以及时更换。分体设置的样品放置层相较于一体化结构的样品放置层，层间会产生新的热阻，通常会影响冷冻芯片的冷冻速度。本公开实施例提供的冷冻芯片热量沿横向传导至低温冷源A时，可以减少层间热阻对冷冻速度的影响，经过测试，冷冻速度也可以实现105℃/s的数量级。
需要说明的是，样品层、加热层、第四隔离层、导热层以及第五隔离层的其他技术细节可以参照图2e-2d所示样品放置层的实施例，比如样品层对应于放置样品的隔离层；加热层对应于设置有温控单元的隔离层；第四隔离层对应于第一隔离层，用于隔离温控单元和导热层；第五隔离层对应于第三隔离层，用于隔离芯片基底和导热层，在此不予赘述。
另外，本公开提供的冷冻芯片还可以从以下几个方面改进：
a调整导热层部分的厚度，靠近温控单元的部分与导热层端部部分的厚度大于二者之间导热层部分的厚度；
b导热层靠近温控单元的部分与导热层端部部分之间的导热层部分采用图案化结构设置，比如该部分以成放射状通道方式连接靠近温控单元的部分与导热层端部部分。
具体地，图3示出根据本公开的实施例的样品放置层内温度梯度的示意图。如图3所示，低温冷源A温度为-170℃，芯片基底11底部w1点的温度近似于低温冷源A的温度例如为-160℃。样品放置层12顶部w2点的温度例如为-120℃。与w2的位置点位于同一平面上，靠近温控单元13的w3点的温度，在温控单元加热样品时例如为30℃，则温度梯度主要集中在w3点与w2点之间。以上温度数值为示意性说明，并不构成对本公开的限制。
发明人发现，冷冻速度受到局部温控区域的热容的限制。由于样品最终的冷冻温度是确定的，因此尽可能的缩小冷冻前的相对高温区域，比如使得局部温控区域的范围足够小，温控单元尽量靠近样品，从而限制局部温控区域的热容，可以提高冷冻速度。而另一方面在温控单元外，距离温控单元较近的位置，采用相对导热率较低的结构，使得温度梯度尽量集中在靠近温控单元的区域，比如将温度梯度集中在w3点与w4点之间，而不是w3点与w2点之间，以提高冷冻速度。结合上述两方面的改进，有利于提高冷冻速度。
采用上述方式a和/或方式b改进冷冻芯片，可以进一步提供冷冻芯片的冷冻速度，经过测试，冷冻速度可以实现105℃/s的数量级。
图4示出根据本公开实施例的放置样品的冷冻芯片的结构示意图。如图4所示，与图1a不同的是，所述局部温控区域设置有至少一个容纳样品的闭口样品容纳腔a和/或开口样品容纳腔b。当然，也可以在图1b-1c所示的冷冻芯片的基础上设置闭口样品容纳腔a和/或开口样品容纳腔b，本公开对此不做限制。本公开实施例的冷冻芯片的其他技术内容参见图1a-图1c所示的实施例部分，在此不予赘述。
根据本公开的实施例，所述温控单元12还包括设置在所述闭口样品容纳腔a和/或开口样品容纳腔b的壁上的辅助温控单元，用于减少放置在同一局部温控区域内多个样品之间的温差。在本实施方式的中，辅助温控单元和温控单元可以采用同样的元器件或者等同的元器件。
图5示出根据本公开实施例的样品台组件的结构示意图。如图5所示，所述样品台组件20包括：冷冻芯片10、样品热沉21和控制器22。其中，所述样品热沉21用于容纳所述冷冻芯片10。所述控制器22与所述温控单元13电连接，用于调整所述温控单元13的温度。需要说明的是，样品热沉21可以设计为通光结构，以适配显微镜观察样品。
在本公开方式中，样品台组件20中样品热沉21可以视为低温冷源A。可以理解，样品热沉21也可以省略，而直接将冷冻芯片10放置在下文所述的热沉底座32上，此时，热沉底座32可以视为低温冷源A，本公开对此不做限制。
在本公开方式中，样品台组件20还包括控制电路板(图中未示出)，控制电路板可以嵌入样品热沉21中或者环绕样品热沉21与冷冻芯片10直接接触的区域设置，以不影响二者的高效传热为准，本公开并不限制控制电路板的位置。控制器22通过控制电路板与温控单元13实现电连接，进而调整温控单元13的温度。
图6示出根据本公开实施例的冷冻系统的结构示意图。如图6所示，所述冷冻系统30包括：样品台组件20、低温冷源31和热沉底座32。所述低温冷源31可以为液氮，用于将热沉底座32冷却并保持接近在液氮温度。所述热沉底座32用于固定所述样品台组件20，并作为冷源对样品台组件20进行冷冻。
根据本公开的实施例，冷冻样品时，所述热沉底座32与样品热沉21直接接触，以使样品热沉21的温度接近液氮温度或与液氮温度相同，样品台组件20除局部温控区域N之外的其他部分也同时被冷冻。控制器22调整温控单元13的电学参数，样品被周围温度接近或等于液氮温度的芯片其他部分和样品热沉21直接冷却。
根据本公开的实施例，所述冷冻系统30还包括：冷冻介质密封盖板33，所述冷冻介质密封盖板33用于密封所述低温冷源，一些情况下也可以支撑所述热沉底座32浸入所述低温冷源中。
根据本公开的实施例，所述冷冻系统30还包括：样品盖板34，其面积至少能够密封所述热沉底座32的开口。图中所示样品盖板34的长度分别延伸至冷冻介质密封盖板33的两端，这样设置是为了确保冷冻芯片所在的低温环境中，不会有水汽进入，防止水汽冷凝形成液滴附着在样品上，进而避免液滴在低温环境下形成冰晶影响样品的显微观察或性质表征。可以理解，样品盖板34的面积足够覆盖样品热沉时，通常能够密封冷冻芯片所在的低温环境以防止水汽进入，在此基础上，可以适当增加样品盖板34的长度，本公开对此不做限制。
在本公开方式中，样品盖板34上还可以设置有观察区域或者探测区域，以在低温环境中防止水汽进入的前提下，通过观察区域显微观察样品和/或在探测区域位置利用探测装置表征样品的性质。一些情况下，可以为低温环境提供干燥气氛，以解决水汽冷凝影响样品观察或表征的缺陷，此时，可以省略样品盖板34。
本公开还提供一种样品测试系统，包括冷冻系统30以及与所述冷冻系统30配套使用的显微观察装置和/或探测装置。
根据本公开的实施例，所述显微观察装置为正置光学显微镜、倒置光学显微镜、电子显微镜中的至少一种。所述探测装置为光电探测器、X射线、拉曼光谱仪、红外光谱仪等监测仪器中的至少一种。
图7示出根据本公开实施例的冷冻样品的方法的流程示意图。如图7所示，所述方法利用冷冻系统30来冷冻样品，包括如下步骤S110-S140。
在步骤S110中，调整局部温控区域的温度至第一温度；
在本公开方式中，首先，在室温状态下，将控制电路板与控制器连接；其次，启动控制器，将温控单元加热至略高于室温的设定温度(通过实时测量电阻值确定温控单元温度，如30℃)，并恒定在此温度(通过电阻反馈调整)，由于温控单元与样品之间距离极小，热阻极低，因此可以近似认为样品温度也在设定温度(如30℃)，此时的典型电阻值范围在Rheater＝50-100ohm。
在步骤S120中，在所述局部温控区域内放置样品；
在步骤S130中，调整温控单元的电学参数，以维持样品的平均温度稳定在第一温度，维持样品放置层内所述样品与低温冷源的温度梯度；
在本公开方式中，将样品台组件放置于冷冻后的热沉底座上(约-190℃)，冷冻芯片的温度开始降低，此时，控制器自动加大电流Iheater进行电阻加热，将局部温控区域N内样品的平均温度维持在第一温度(比如30℃)，此时典型电流值范围在Iheater＝50-100mA，Rheater的典型功率(Rheater*Iheater 2)约为0.3W；
在步骤S140中，检测并调整所述电学参数至第一预定范围，以调整所述样品的平均温度在第二温度，其中，所述第二温度低于所述第一温度，在所述低温冷源能够提供的最低温范围内确定所需温度值。
在本公开方式中，当需要冷冻时，通过控制器发出信号，将电流Iheater突然降低至0.1-1.0mA，局部温控区域N内样品温度会急速降低至热沉底座31的温度，Rheater也急剧减小至约为室温时Rheater的1/7，在整个降温过程中，控制电路保持较小的恒定电流(0.1-1.0mA)。冷冻结束后，控制电路保持较小电流(0.1-1.0mA)，将样品的平均温度维持在第二温度(比如为-190℃)，持续监控Rheater变化，用来作为样品温度的参考。
在本公开方式中，第二温度根据低温冷源A的温度确定，不低于该温度即可。具体地，在低温冷源A可以提供-190℃的低温时，可以将样品温度调整至所需温度，比如可以是-140℃。
需要说明的是，步骤S110以及步骤S120是在将样品台组件放入热沉底座前执行的步骤，在步骤S110中，局部温控区域的温度也可以为室温，此时无需启动控制器加热温控单元。另外，步骤S110以及步骤S120的执行顺序可以互换，本公开对此不做限制。
以下对温控单元工作的基本原理做如下说明：
图8示出根据本公开实施例的温控单元工作的基本原理示意图。参见图8所示，温控单元采用4端测量方式连接，即Force_H(I+),Sense_H(V+),Sense_L(V-),Force_L(I-)。通过I+到I-施加加热电流Iheater，此电流最大可达到50～200mA量级。同时在V+与V-两端测量电压差Vheater，此两端的端口电流很小(如虚地)，对通过温控单元的电流影响不记。通过Vheater/Iheater实时测量温控单元的电阻值Rheater，并以此评价温控单元的平均温度。
需要说明的是，本公开实施方式中，可以通过控制不同局部温控区域相应的温控单元来实现局部选区冷冻的功能，温控单元与局部温控区域可以是一一对应的关系，当然也可以根据需要采用一个温控单元调整多个局部温控区域的温度，本领域技术人员可以自由组合，均可以采用上述方式来实现快速冷冻样品的功能。本公开对此不予限制。
根据本公开的实施例，通过调整电学参数来调整样品的平均温度。其中，电学参数可以为电流、电阻或者功率参数，本公开对此不做限制。
在本公开方式中，可以利用温控单元在加热样品的同时实时测量样品温度，也可以在冷冻芯片上额外设置测温单元，利用温控单元加热样品，并同时利用测温单元实时测量样品温度。本公开对此不做限制。
在本公开方式中，可以绘制电阻随时间的变化曲线，然后根据所述电阻随时间的变化曲线评估样品冷却速度。具体地，可以保持Iheater电流不变的情况下，通过测量Vheater来计算Rheater，持续监控降温过程中Rheater随时间的变化曲线，该曲线可以作为样品冷冻速度的评估参考。
根据本公开的实施例，在预定时间段内改变所述第一温度至所述第二温度。
在本公开方式中，将第一温度降低至第二温度的预定时间段控制在10ms以内，例如1-2ms。具体地，1ms内，温度从室温降低至-140℃以下，并在后续的1-2ms内进一步降低到-180℃以下。
根据本公开的实施例，时延可以是控制系统在发出降低第一温度的电信号到冷冻芯片接收到该电信号开始冷冻样品的延迟时间。可以理解为，测试生物样品时，需要确定冷冻生物样品的时间点，以观测该时间点下的样品或者进行其他测试。时延反应了冷冻操作的延迟时间，时延越小，越可以精确地控制冷冻样品的时间点，使得冷冻后的样品状态接近冷冻操作时的样品状态，从而更好地进行样品测试。
根据本公开的实施例，通过优化温度控制单元的电路结构和控制方法，可以将时延控制在小于0.1ms。
根据本公开的实施例，所述第一温度为样品的液态温度，例如，常压下的水溶液，对于常规细胞样品而言，温度在0-40℃范围内，优选为20-30℃；对于特殊耐热细胞或细菌，温度可以提高；非常压条件下，温度范围也可能变化，以保证培养液处于液态，生物样品正常存活。
根据本公开的实施例，所述第二温度为使同一样品在同一环境下从液态直接转变为非晶固态，并持续保持非晶固态的温度，例如，对于水或者一般水溶液，温度应低于-140℃，高压或低压时，温度范围可能发生变化，以保证培养液被冷冻到非晶态稳定的温度，从而不会破坏样品结构。
图9示出根据本公开实施例的加热样品的方法的流程示意图。如图9所示，所述方法利用冷冻系统30来加热样品，包括如下步骤S210-S220。
在步骤S210中，检测并调整电学参数以使局部温控区域的平均温度至第二温度。
在本公开方式中，首先，在低温(液氮温度下)条件下，将温控单元与控制器连接；其次，启动控制电路，I_Heater设定值为0.1-1.0mA(仅供测量电阻值以评估温度，加热可忽略)，温控单元温度与热沉温度接近。
在步骤S220中，调整温控单元的电学参数至第二预定范围，之后检测并调整所述电学参数以维持所述样品的平均温度在第一温度；或者利用外部热源加热所述样品，通过测温单元确定所述样品的平均温度在第一温度；其中，所述第一温度大于所述第二温度。
在本公开方式中，温控单元温度与热沉温度接近时，突然增大IHeater，以最快速度使的Rheater加热到设定温度(如30℃)对应的Rheater值。在此过程中，由于初始Rheater为液氮温度时的电阻值，仅为室温的1/7左右，因此初始加热的电流会很达到200～300mA量级才会达到0.3W相当的功率，以达到快速加热的目的。同时，在加热过程中由于电阻值快速上升，Iheater需要快速调整(降低)至合理的范围，从而维持Rheater一直在设定值(如30℃对应的Rheater)。之后维持加热元件稳定在设定的温度(如30℃)，根据需要可以将样品移出，或者继续冷冻样品。
在本公开方式中，可以利用外部热源通过聚焦将加热区域限定在冷冻芯片上的局部温控区域，对样品进行加热，然后通过与冷冻芯片上的反馈系统配合实现加热功率与温度的控制，比如可以在冷冻芯片上设置测温单元实时监控样品温度，进而控制外部热源的加热功率。其中，外部热源可以为微波、激光等。
需要说明的是，在使用冷冻芯片冷冻样品后，则可以省略步骤S210，直接执行步骤S220加热样品。
本公开实施例提供的加热样品的方法，利用冷冻系统30来加热样品，具体的技术细节参照图6所示的实施例，本公开实施例在此不予赘述。
根据本公开的实施例，在预定时间段内增加所述第二温度至所述第一温度。
根据本公开的实施例，所述预定时间段为10ms以内，例如1-2ms。
根据本公开的实施例，所述第一温度为样品的液态温度，例如，常压下的水溶液，对于常规细胞样品而言，温度在0-40℃范围内，优选为20-30℃；对于特殊耐热细胞或细菌，温度可以提高；非常压条件下，温度范围也可能变化，以保证培养液处于液态，生物样品正常存活。
根据本公开的实施例，所述第二温度为使同一样品在同一环境下从液态直接转变为非晶固态，并持续保持非晶固态的温度，例如，对于水或者一般水溶液，温度应低于-140℃，高压或低压时，温度范围可能发生变化，以保证培养液被冷冻到非晶态稳定的温度，从而不会破坏样品结构。
图10示出根据本公开实施例的操作样品的方法的流程示意图。如图10所示，所述方法利用样品测试系统来操作样品，包括如下步骤S310-S370。
在步骤S310中，调整温控单元的电学参数，以维持样品的平均温度在第一温度，维持样品放置层内所述样品与低温冷源的温度梯度；
在步骤S320中，检测并调整所述电学参数至第一预定范围，以调整所述样品的平均温度在第二温度，之后在所述第二温度下操作样品，其中，所述第二温度低于所述第一温度，在所述低温冷源能够提供的最低温范围内确定所需温度值；
在步骤S330中，调整温控单元的电学参数至第二预定范围以加热所述样品或者利用外部热源加热所述样品至第一温度，之后重复检测并调整所述电学参数至第一预定范围，以维持所述样品的平均温度在第二温度，然后在所述第二温度下操作所述样品；
在步骤S340中，在操作所述样品后，更换所述样品。
需要说明的是，步骤S340可以在步骤S320中加热所述样品至第一温度后执行，也就是在第二温度下一次操作样品后，加热样品至第一温度后，根据需要可以重复冷冻样品，二次操作样品后，加热样品至第一温度后再结束操作，本公开并不限制冷冻、加热、再冷冻的循环次数。可以理解，在步骤S320中结束操作后，还可以在第一温度下更换新样品，然后重复冷冻新样品进行，本公开对此不做限制。
本公开实施例提供的操作样品的方法，具体的技术细节参照图7、图9所示的实施例，本公开实施例在此不予赘述。
根据本公开的实施例，所述操作样品可以是显微观察样品、测试样品在光电探测器、X射线、拉曼光谱仪、红外光谱仪等监测仪器下的探测信号，本公开对此不做限制。
根据本公开的实施例，在步骤S310调整温控单元的电学参数，以维持样品的平均温度在第一温度，维持样品放置层内所述样品与低温冷源的温度梯度的步骤后，所述方法还包括：
在第一温度下操作样品并确定调整所述电学参数至第一预定范围的启动时刻，在所述启动时刻下，检测并调整所述电学参数至第一预定范围，以维持所述样品的平均温度在第二温度。
根据本公开的实施例，在第一预定时间段内改变所述第一温度至所述第二温度。
根据本公开的实施例，通过电子设备调整所述温控单元的电学参数。例如通过使用keithley 2612B调整所述温控单元的电学参数，可以将时延控制在2ms以内。
根据本公开的实施例，通过优化温度控制单元的电路结构和控制方法，可以将时延控制在小于0.1ms。
根据本公开的实施例，在第二预定时间段内改变所述第二温度至所述第一温度。
根据本公开的实施例，所述第二预定时间段为10ms以内，例如1-2ms。
根据本公开的实施例，所述第一温度为样品的液态温度，例如，常压下的水溶液，对于常规细胞样品而言，温度在0-40℃范围内，优选为20-30℃；对于特殊耐热细胞或细菌，温度可以提高；非常压条件下，温度范围也可能变化，以保证培养液处于液态，生物样品正常存活。
根据本公开的实施例，所述第二温度为使同一样品在同一环境下从液态直接转变为非晶固态，并持续保持非晶固态的温度，例如，对于水或者一般水溶液，温度应低于-140℃，高压或低压时，温度范围可能发生变化，以保证培养液被冷冻到非晶态稳定的温度，从而不会破坏样品结构。
本公开实施例的样品测试系统用来操作样品的方法，通过调整温控单元的参数，能够实现冷冻样品-操作样品的操作流程，或者冷冻样品-操作样品-加热复活样品-冷冻样品-操作样品-加热复活样品上述流程的循环，或者冷冻前操作样品-冷冻样品-操作样品的操作流程，或者冷冻前操作样品-冷冻样品-操作样品-加热复活样品-冷冻前操作样品-冷冻样品-操作样品-加热复活样品上述流程的循环，也可以在冷冻样品-操作样品后更换样品再重复上述流程。该技术方案通过局部温控区域，芯片基底以及低温冷源之间各个界面的热阻与换热效率设计，限制局部温控区域的热容，获得高于105℃/s的冷冻与加热速度，保证在反复冷冻与加热过程中保持样品不受破坏(或减轻破坏)，这对于生物样品冷冻，原位观察与加热解冻等操作是一种重大改进，具有重大意义和广泛应用前景。
下面具体说明利用本公开实施例提供的样品测试系统用来显微观察样品的方式。
方式一、局部温控区域放置样品-保持到第一温度-冷冻到第二温度-显微观察，这种方法适用于蛋白质样品，冷冻制样后进行高分辨显微观察；
方式二：局部温控区域放置样品-保持到第一温度-实时显微观察-在特定时间节点处开始冷冻-保持到第二温度-高分辨显微观察，这种方法适用于细胞样品，可以先实时观察样品活动，在感兴趣的特定时间点，例如细胞分裂，细胞吞噬外来物质时冷冻样品，再进行高分辨显微观察。
需要说明的是，冷冻前与冷冻后实时显微观察所使用的显微镜可以是不同的，从而实现不同分辨率的观察。例如利用常规正置光学显微镜对样品进行实时观察，冷冻后使用电子显微镜对细胞进行高分辨结构观察。
本公开实施例提供的显微观察样品的方法，细胞样品从20-30℃被冷冻到约-170℃，用时低于2ms，冷冻速度高于105℃/s，保证细胞样品在冷冻后保持形状基本不变，既不会破裂，也不出现明显变形。
以上描述仅为本公开的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本公开中所涉及的实用新型范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述实用新型构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本公开中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。

Claims (21)

1.一种冷冻芯片，其特征在于，所述冷冻芯片与低温冷源接触，用以冷冻样品，包括：
样品放置层，其表面划分为至少一个局部温控区域，所述局部温控区域用于放置样品；
若干个温控单元，用于调整所述局部温控区域的温度；其中，所述温控单元为导电材料；
芯片基底，支撑所述样品放置层的顶面或者底面形成第一接触面；所述第一接触面与所述局部温控区域在同一平面的投影不重叠或者部分重叠。
2.根据权利要求1所述的冷冻芯片，其特征在于，
所述芯片基底支撑于所述样品放置层的中心区域外的周边区域；所述中心区域划分为至少一个局部温控区域；或者
所述芯片基底支撑于所述样品放置层的中心区域；所述中心区域外的周边区域划分为至少一个局部温控区域；或者
所述芯片基底支撑于所述局部温控区域的间隔位置处。
3.根据权利要求1所述的冷冻芯片，其特征在于，
所述芯片基底支撑所述样品放置层的顶面形成所述第一接触面时，所述芯片基底上还具有第二接触面，用于与所述低温冷源接触；其中，所述第一接触面与所述第二接触面位于所述芯片基底的同一侧面。
4.根据权利要求1所述的冷冻芯片，其特征在于，
所述温控单元与所述样品放置层为一体化结构。
5.根据权利要求1所述的冷冻芯片，其特征在于，所述温控单元采用芯片微纳加工工艺设置于所述样品放置层，利用所述温控单元划分所述局部温控区域。
6.根据权利要求5所述的冷冻芯片，其特征在于，
所述样品放置层为导热层；所述温控单元设置在所述导热层上，以在所述导热层上划分所述局部温控区域；或者
所述样品放置层包括：导热层和采用芯片微纳加工工艺制作于所述导热层上的第一隔离层；其中，所述温控单元设置在所述第一隔离层上，以在所述第一隔离层上划分所述局部温控区域；或者
所述样品放置层包括：导热层、采用芯片微纳加工工艺制作于所述导热层上的第一隔离层和采用芯片微纳加工工艺制作于所述第一隔离层上的第二隔离层；其中，所述温控单元设置在所述第一隔离层上，以在所述第二隔离层上划分所述局部温控区域；或者
所述样品放置层包括：第三隔离层、采用芯片微纳加工工艺制作于所述第三隔离层上的导热层、采用芯片微纳加工工艺制作于所述导热层上的第一隔离层和采用芯片微纳加工工艺制作于所述第一隔离层上的第二隔离层；其中，所述温控单元设置在所述第一隔离层上，以在所述第二隔离层上划分所述局部温控区域；或者
所述样品放置层包括：第三隔离层、采用芯片微纳加工工艺制作于所述第三隔离层上的第一隔离层、采用芯片微纳加工工艺制作于所述第一隔离层上的导热层和采用芯片微纳加工工艺制作于所述导热层上的第二隔离层；其中，所述温控单元设置在所述第三隔离层上，以在所述第二隔离层上划分所述局部温控区域。
7.根据权利要求1所述的冷冻芯片，其特征在于，
所述样品放置层包括：分体设置的至少一个样品层、加热层、第四隔离层、导热层以及第五隔离层；
其中，所述样品层表面划分为至少一个局部温控区域；所述温控单元设置在所述加热层上。
8.根据权利要求6或7所述的冷冻芯片，其特征在于，所述导热层靠近所述温控单元的部分与所述导热层端部部分的厚度大于二者之间导热层部分的厚度；和/或
所述导热层靠近所述温控单元的部分与所述导热层端部部分之间的导热层部分采用图案化结构设置。
9.根据权利要求6-8任一项所述的冷冻芯片，其特征在于，所述局部温控区域设置有至少一个容纳样品的闭口样品容纳腔和/或开口样品容纳腔。
10.根据权利要求9所述的冷冻芯片，其特征在于，所述温控单元还包括设置在所述闭口样品容纳腔和/或开口样品容纳腔的壁上的辅助温控单元。
11.根据权利要求1-10任一项所述的冷冻芯片，其特征在于，所述样品放置层设置有光通路通道，以适配显微镜、光电探测器、X射线、拉曼光谱仪、红外光谱仪。
12.根据权利要求11所述的冷冻芯片，所述冷冻芯片由透光材料制成或者具有穿孔通道作为所述光通路通道。
13.根据权利要求1-12任一项所述的冷冻芯片，其特征在于，所述冷冻芯片用芯片微纳加工工艺制成。
14.根据权利要求13所述的冷冻芯片，其特征在于，所述冷冻芯片的厚度控制在0.1-2mm。
15.一种包括如权利要求1-14任一项所述的冷冻芯片的样品台组件，其特征在于，包括：
与所述温控单元电连接的控制器，用于调整所述温控单元的温度。
16.根据权利要求15所述的样品台组件，其特征在于，还包括：样品热沉，用于容纳所述冷冻芯片。
17.一种包括如权利要求15或16所述的样品台组件的冷冻系统，其特征在于，包括：
低温冷源；
固定所述样品台组件的热沉底座，与所述低温冷源接触。
18.根据权利要求17所述的冷冻系统，其特征在于，还包括：
冷冻介质密封盖板，所述冷冻介质密封盖板用于密封所述低温冷源。
19.根据权利要求17所述的冷冻系统，其特征在于，还包括：
样品盖板，其面积至少能够密封所述热沉底座的开口。
20.一种包括如权利要求17-19任一项所述的冷冻系统的样品测试系统，其特征在于，包括；
与所述冷冻系统配套使用的显微观察装置和/或探测装置。
21.根据权利要求20所述的样品测试系统，其特征在于，所述显微观察装置为正置光学显微镜、倒置光学显微镜、电子显微镜中的至少一种；
所述探测装置为光电探测器、X射线、拉曼光谱仪、红外光谱仪中的至少一种。
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