CN207591891U - 一种用于诊断骨代谢疾病的联合检测微流控芯片 - Google Patents
一种用于诊断骨代谢疾病的联合检测微流控芯片 Download PDFInfo
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Abstract
本实用新型涉及一种用于诊断骨代谢疾病的联合检测微流控芯片，包括：芯片基板及盖合于所述芯片基板上方的上层盖片，所述芯片基板上设有依次通过毛细管微通道连通的加样区、抗体包被区、微混合区、第一检测区、第二检测区、质控区及废液收集区；所述上层盖片上设有加样孔、第一检测窗口、第二检测窗口、第三检测窗口、第四检测窗口、质控窗口、通气孔，并且与所述加样区、第一检测区、第二检测区、第三检测区、第四检测区、质控区、废液收集区的位置依次对应。本实用新型能够实现25‑OH‑D、25‑OH‑D3、PTH和N‑MID OT项目的联合检测，对能够全面准确地诊断骨代谢疾病有着极大的临床诊断价值。
Description
技术领域
本实用新型属于体外诊断领域，具体涉及一种用于诊断骨代谢疾病的联合检测微流控芯片。
背景技术
维生素D的两个最重要的形式是维生素D3(胆钙化甾醇)和维生素D2(麦角钙化甾醇)。在人体内，维生素D3和D2与血浆中维生素D结合蛋白结合，并转运到肝脏，两者经25羟基化成为羟基维生素D，血清中检测出来的95％以上的羟基维生素D为羟基维生素D3，维生素D缺乏是继发性甲状旁腺机能亢进症的常见病因。提高甲状旁腺激素含量，特别是提高缺乏维生素D的老年人的甲状旁腺激素含量会导致骨软化症，增加了骨转化，降低了骨质量，并有骨折的危险。
甲状旁腺激素(PTH)是在甲状旁腺内合成，并分泌到血液中。完整甲状旁腺激素的选择性测定可直接用于判定甲状旁腺的分泌能力。PTH联合维生素D和降钙素动员骨骼系统的钙和磷，促进小肠对钙的吸收和增加肾脏对磷的排泄。PTH和降钙素的相互作用确保血钙浓度的稳定。高血钙浓度抑制PTH分泌，低血钙浓度则促进PTH分泌。甲状旁腺功能障碍影响PTH分泌，会导致血钙浓度升高或降低。
N-MID OT是骨基质中一种重要的非胶原蛋白，在骨形成过程中由成骨细胞生成，此过程依赖于把维生素K，同时维生素D3有促进骨钙素生成的作用。成骨细胞产生的骨钙素一部分被吸收成为骨基质的组成部分，一部分被释放进入外周血循环。血液中的骨钙素含量与骨转换率有关，因此骨钙素的测定对于诊断骨质疏松、高钙血症等骨代谢疾病具有非常重要的意义。
综上所述，联合检测25-OH-D、25-OH-D3、PTH和N-MID OT对骨代谢疾病的诊断具有非常大的临床诊断价值。然而，目前临床上对骨代谢疾病诊断主要是对单个项目进行检测，导致在疾病诊断方面存在一定的局限性。或者为了获得准确的检测结果，临床上采用对不同项目的试剂盒进行联合检测，样本用量多，检测周期长，工作量大，效率低。
实用新型内容
有鉴于此，本实用新型的目的在于提供一种用于诊断骨代谢疾病的联合检测微流控芯片及其制备方法和用途。
为了达到上述的目的，本实用新型提供了一种用于诊断骨代谢疾病的联合检测微流控芯片，包括：芯片基板及盖合于所述芯片基板上方的上层盖片，
所述芯片基板上设有依次通过毛细管微通道连通的加样区、抗体包被区、微混合区、第一检测区、第二检测区、第三检测区、第四检测区、质控区及废液收集区；
所述上层盖片上设有加样孔、第一检测窗口、第二检测窗口、第三检测窗口、第四检测窗口、质控窗口、通气孔，并且与所述加样区、第一检测区、第二检测区、第三检测区、第四检测区、质控区、废液收集区的位置依次对应；
其中，所述抗体包被区预存储有荧光微球标记的一株鼠抗人25-OH-D单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人25-OH-D3单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人PTH单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人N-MID OT单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG的混合物；
所述第一检测区、第二检测区、第三检测区或第四检测区中分别预存储有磁性微球标记的一株25-OH-D完全抗原、磁性微球标记的一株25-OH-D3完全抗原、磁性微球标记的另一株鼠抗人PTH单克隆抗体、磁性微球标记的另一株鼠抗人N-MID OT单克隆抗体中的一种且四者所预存储的物质各不相同。
进一步地，其中所述第一检测区、第二检测区、第三检测区、第四检测区和质控区的下侧设有由永磁铁或电磁铁提供的磁场区域。
进一步地，其中所述荧光微球标记的一株鼠抗人25-OH-D单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人25-OH-D3单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人PTH单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人N-MID OT单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG的摩尔比为1：1：1：1：(0.1～4)。
进一步地，其中所述第一检测区、第二检测区、第三检测区或第四检测区中磁性微球与一株25-OH-D完全抗原的质量比为10：0.05～2；所述第一检测区、第二检测区第三检测区或第四检测区中磁性微球与磁性微球标记的一株25-OH-D3完全抗原的质量比为10：(0.05～2)；所述第一检测区、第二检测区、第三检测区或第四检测区中磁性微球与另一株鼠抗人PTH单克隆抗体的质量比为10：(0.05～2)；所述第一检测区、第二检测区、第三检测区或第四检测区中磁性微球与另一株鼠抗人N-MID OT单克隆抗体的质量比为10：(0.05～2)。
进一步地，其中所述质控区预存储有磁性微球标记的羊抗兔多克隆抗体。
进一步地，其中所述第一检测区、第二检测区、第三检测区、第四检测区和质控区的表面设置为粗糙结构，所述粗糙结构为向下凹的半圆结构、锯齿形结构或凹凸的矩形结构；
所述微混合区为棱形、圆形、方形或矩形，并且其内部设有n个交错设置的矩形、棱形、方形或圆形的柱体；或者所述微混合区为至少一个矩形串联结构，并且每个矩形中设有一个矩形柱体；或者所述微混合区为锯齿形结构；或者所述微混合区为至少一个正三角形或倒三角形串联结构，并且每个三角形中设置有一个相应正三角或者倒三角形柱体；或者所述微混合区为至少一个棱形结构串联，并且棱形结构中设置有一个棱形或圆形柱体；或者所述微混合区为至少一个圆形结构串联，并且圆形结构中设置有一个圆形柱体。
本实用新型的有益效果在于：
1.本实用新型设置的微混合区便于待测物质与相应抗原或抗体之间进行充分结合，提高检测的灵敏度；
2.本实用新型在检测区和质控区中分别设有免疫磁微球，在检测区和质控区的下方设置了磁场区域，便于将待测物质固定到相应检测区内，并且检测区和质控区表面设置成粗糙结构，用于增大摩擦力，防止磁珠滚动；降低非特异性造成的干扰，提高检测灵敏度；
3.本实用新型在免疫反应前将免疫磁珠平铺固定到检测区或质控区表面，免疫反应后使荧光微球均置于免疫磁珠的上表面，避免了磁性微球遮挡荧光微球而对荧光信号造成干扰；
4.本实用新型能够实现25-OH-D、25-OH-D3、PTH和N-MID OT项目的联合检测联合检测，对能够全面准确的诊断骨代谢疾病有着极大的临床诊断价值，并且本微流控芯片检测时、检测周期短、检测效率高。
附图说明
图1A为本实用新型的用于诊断骨代谢疾病的联合检测微流控芯片中芯片基板的结构示意图；
图1B为本实用新型的用于诊断骨代谢疾病的联合检测微流控芯片中上层盖片的结构示意图；
图2为本实用新型的免疫磁性微球与检测区或质控区的粗糙表面的接触示意图，其中，(1)免疫磁性微珠与向下凹的半圆结构的粗糙表面接触；(2)免疫磁性微珠与锯齿形结构的粗糙表面接触；(3)免疫磁性微珠与凹凸的矩形结构的粗糙表面接触；
图3为本实用新型的用于诊断骨代谢疾病的联合检测微流控芯片的微混合区结构示意图，其中，(1)棱型结构，并且内部设有多个交错设置的棱形柱体；(2)棱型结构，并且内部设有多个交错设置的圆形柱体；(3)棱型结构，并且内部设有多个长条形柱体；(4)两个矩形串联结构，并且每个矩形中设有一个矩形柱体；(5)三个正三角形串联结构，并且每个正三角形中设有一个正三角形柱体；(6)三个倒三角形串联结构，并且每个倒三角形中设有一个倒三角形柱体；(7)锯齿形结构；(8)三个棱型串联结构，并且每个棱型中设置一个棱型柱体；(9)三个棱型串联结构，并且每个棱型中设置一个棱型柱体；
图4为25-OH-D的标准曲线；
图5为25-OH-D3的标准曲线；
图6为PTH的标准曲线；
图7为N-MID OT的标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本实用新型作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本实用新型并能予以实施，但所举实施例不作为对本实用新型的限定。
结合图1A及图1B所示，本实用新型提供了一种用于诊断骨代谢疾病的联合检测微流控芯片，包括：芯片基板26及盖合于所述芯片基板上方的上层盖片27，所述芯片基板上设有依次通过毛细管微通道连通的加样区1、抗体包被区2、微混合区3、第一检测区4、第二检测区5、第三检测区6、第四检测区7、质控区8、废液收集区9；上层盖片上设有加样孔10、第一检测窗口11、第二检测窗口12、第三检测窗口13、第四检测窗口14、质控窗口15、通气孔16，并且与芯片基板中加样区1、第一检测区4、第二检测区5、第三检测区6、第四检测区7、质控区8、废液收集区9的位置依次对应。第一检测区4、第二检测区5、第三检测区6、第四检测区7和质控区8的下侧设有磁场区域25，磁场由永磁铁或电磁铁提供。
其中，加样区1和抗体包被区2通过第一毛细管微通道17连通，抗体包被区2和微混合区3通过第二毛细管微通道18连通，微混合区3与第一检测区4通过第三毛细管微通道19连通，第一检测区4和第二检测区5通过第四毛细管微通道20连通，第二检测区5和第三检测区6通过第五毛细管微通道21连通，第三检测区6和第四检测区7通过第六毛细管微通道22连通，第四检测区7和质控区8通过第七毛细管微通道23连通，质控区8和废液收集区9通过第八毛细管微通道24连通；
抗体包被区2预存储有荧光微球标记的一株鼠抗人25-OH-D单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人25-OH-D3单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人PTH单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人N-MID OT单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体的混合物；
第一检测区4中预存储有磁性微球标记的一株25-OH-D完全抗原，第二检测区5中预存储有磁性微球标记的一株鼠抗人25-OH-D3完全抗原，第三检测区6中预存储有磁性微球标记的另一株鼠抗人PTH单克隆抗体；第四检测区7中预存储有磁性微球标记的另一株鼠抗人N-MID OT单克隆抗体；质控区8中预存储有磁性微球标记的一株羊抗兔多克隆抗体。
所述荧光微球标记的一株鼠抗人25-OH-D单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人25-OH-D3单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人PTH单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人N-MID OT单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG的摩尔比为1：1：1：1：1。
所述第一检测区4中磁性微球与一株25-OH-D完全抗原的质量比为10：0.4；所述第二检测区5中磁性微球与磁性微球标记的一株25-OH-D3完全抗原的质量比为10：0.4；所述第三检测区6中磁性微球与另一株鼠抗人PTH单克隆抗体的质量比为10：0.4；所述第四检测区7中磁性微球与另一株鼠抗人N-MID OT单克隆抗体的质量比为10：0.4。
所述磁性微球为磁性的Fe3O4、γ-Fe2O3、Pt、Ni或Co微球，或者为磁性的Fe3O4、γ-Fe2O3、Pt、Ni或Co与无机物或有机物形成的核/壳结构或掺杂结构的微球，所述Fe3O4、γ-Fe2O3、Pt、Ni或Co与所述无机物或有机物的重量百分比为1：(0.001～1000)；所述磁性微球的粒径大小为0.05～5μm。
结合图2所示，所述第一检测区4、第二检测区5、第三检测区6、第四检测区7和质控区8的表面设置为粗糙结构。所述粗糙结构为向下凹的半圆结构、锯齿形结构、凹凸的矩形结构或其他不规则结构。
结合图3所示，所述微混合区3为棱形、圆形、方形或矩形，并且其内部设有n个交错设置的矩形、棱形、方形或圆形的柱体；或者所述微混合区3为至少一个矩形串联结构，并且每个矩形中设有一个矩形柱体；或者所述微混合区为锯齿形结构；或者所述微混合区3为至少一个正三角形或倒三角形串联结构，并且每个三角形中设置有一个相应正三角或者倒三角形柱体；或者所述微混合区3为至少一个棱形结构串联，并且棱形结构中设置有一个棱形或圆形柱体；或者所述微混合区3为至少一个圆形结构串联，并且圆形结构中设置有一个圆形柱体；
制备上述用于诊断骨代谢疾病的联合检测微流控芯片的方法，包括如下步骤：
1)在芯片基板上开设一个所述微流控检测通道；
2)将荧光微球标记的一株鼠抗人25-OH-D单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人25-OH-D3单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人PTH单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人N-MID OT单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG进行混合，将混合物预存储在抗体包被区2中，干燥；
3)将磁性微球标记的一株25-OH-D完全抗原、磁性微球标记的一株鼠抗人25-OH-D3完全抗原、磁性微球标记的另一株鼠抗人PTH单克隆抗体、磁性微球标记的另一株鼠抗人N-MID OT单克隆抗体分别相应地预存储在第一检测区4、第二检测区5、第三检测区6、第四检测区7中，干燥；
4)将磁性微球标记的羊抗兔多克隆抗体预存储在质控区8中，干燥；
5)将上层盖片27盖合于芯片基板26的上方；
6)在芯片基板25的下方对应所述微流控芯片的待第一检测区4、第二检测区5、第三检测区6、第四检测区7和质控区8设置磁场。
以下通过具体实施例对本实用新型进行进一步说明。
1.抗体包被区的处理
1.1荧光微球标记鼠抗人25-OH-D单克隆抗体
取5mL 0.01g/mL的乳胶荧光微球放入小离心管中，按照12000r/min的转速离心20min，移除上层清液后，用5mL的碳酸盐缓冲溶液进行复溶，随后加入5mg的碳二亚胺(EDC)、5mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1mL鼠抗人25-OH-D单克隆抗体在25℃下搅拌6h，继续加入2.5mg的赖氨酸在室温下搅拌20min，将混合物放入透析袋中在4℃下透析12h；透析结束后将混合溶液在12000r/min的转速下离心10min，移去上层清液，最后用20mL的LM缓冲溶液复溶，待用；
1.2荧光微球标记鼠抗人25-OH-D3单克隆抗体
取5mL 0.01g/mL的乳胶荧光微球放入小离心管中，按照12000r/min的转速离心20min，移除上层清液后，用5mL的碳酸盐缓冲溶液进行复溶，随后加入5mg的EDC、5mg的NHS和1mL鼠抗人25-OH-D3单克隆抗体在25℃下搅拌6h，继续加入2.5mg的赖氨酸在室温下搅拌20min，将混合物放入透析袋中在4℃下透析12h；透析结束后将混合溶液在12000r/min的转速下离心10min，移去上层清液，最后用20mL的LM缓冲溶液复溶，待用；
1.3荧光微球标记鼠抗人PTH单克隆抗体
取5mL 0.01g/mL的乳胶荧光微球放入小离心管中，按照12000r/min的转速离心20min，移除上层清液后，用5mL的碳酸盐缓冲溶液进行复溶，随后加入5mg的EDC、5mg的NHS和1mL鼠抗人PTH单克隆抗体在25℃下搅拌6h，继续加入2.5mg的赖氨酸在室温下搅拌20min，将混合物放入透析袋中在4℃下透析12h；透析结束后将混合溶液在12000r/min的转速下离心10min，移去上层清液，最后用20mL的LM缓冲溶液复溶，待用；
1.4荧光微球标记鼠抗人N-MID OT单克隆抗体
取5mL 0.01g/mL的乳胶荧光微球放入小离心管中，按照12000r/min的转速离心20min，移除上层清液后，用5mL的碳酸盐缓冲溶液进行复溶，随后加入5mg的EDC、5mg的NHS和1mL鼠抗人N-MID OT单克隆抗体在25℃下搅拌6h，继续加入2.5mg的赖氨酸在室温下搅拌20min，将混合物放入透析袋中在4℃下透析12h；透析结束后将混合溶液在12000r/min的转速下离心10min，移去上层清液，最后用20mL的LM缓冲溶液复溶，待用；
1.5荧光微球标记兔IgG
取5mL 0.01g/mL的乳胶荧光微球放入小离心管中，按照12000r/min的转速离心20min，移除上层清液后，用5mL的碳酸盐缓冲溶液进行复溶，随后加入5mg的EDC、5mg的NHS和1mL兔IgG单克隆抗体在25℃下搅拌6h，继续加入2.5mg的赖氨酸在室温下搅拌20min，将混合物放入透析袋中在4℃下透析12h；透析结束后将混合溶液在12000r/min的转速下离心10min，移去上层清液，最后用20mL的LM缓冲溶液复溶，待用；
1.6抗体包被区的处理
将上述制备的荧光微球标记鼠抗人25-OH-D单克隆抗体、荧光微球标记鼠抗人25-OH-D3单克隆抗体、荧光微球标记鼠抗人PTH单克隆抗、荧光微球标记鼠抗人N-MID OT单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG按照摩尔比为1：1：1：1：1进行混合，取3μL混合溶液滴于抗体包被区2中，在湿度<30％的环境中干燥6h；
2.检测区的处理
2.1磁性微球标记25-OH-D完全抗原
取1mg羧基功能化的磁性微球置于离心管中，用1mL的MEST缓冲溶液洗涤两次；取600μL的MES重悬磁性微球后，依次向体系中加入1mg的EDC和1mg的NHS，在37℃下置于旋转混合器上活化0.5h；磁分离后，移除上层清液，用500μL的MEST缓冲溶液洗涤两次，用PBST溶液重悬后加入40μg 25-OH-D完全抗原在4℃下搅拌12h；将偶联产物与乙醇胺(2％，V/V)在37℃下活化0.5h，最后用PBST缓冲溶液洗涤两次后加入1mL PBST重悬，取3μL磁性微球标记的25-羟基维生素D完全抗原置于第一检测区4中，在湿度<30％环境中干燥6h；
2.2磁性微球标记25-OH-D3完全抗原
取1mg羧基功能化的磁性微球置于离心管中，用1mL的MEST缓冲溶液洗涤两次；取600μL的MES重悬磁性微球后，依次向体系中加入1mg的EDC和1mg的NHS，在37℃下置于旋转混合器上活化0.5h；磁分离后，移除上层清液，用500μL的MEST缓冲溶液洗涤两次，用PBST溶液重悬后加入40μg25-OH-D3完全抗原在4℃下搅拌12h；将偶联产物与乙醇胺(2％，V/V)在37℃下活化0.5h，最后用PBST缓冲溶液洗涤两次后加入1mL PBST重悬，取3μL磁性微球标记的25-羟基维生素D3完全抗原置于第二检测区5中，在湿度<30％环境中干燥6h；
2.3磁性微球标记鼠抗人PTH单克隆抗体
取1mg羧基功能化的磁性微球置于离心管中，用1mL的MEST缓冲溶液洗涤两次；取600μL的MES重悬磁性微球后，依次向体系中加入1mg的EDC和1mg的NHS，在37℃下置于旋转混合器上活化0.5h；磁分离后，移除上层清液，用500μL的MEST缓冲溶液洗涤两次，用PBST溶液重悬后加入40μg鼠抗人PTH单克隆抗体在4℃下搅拌12h；将偶联产物与乙醇胺(2％，V/V)在37℃下活化0.5h，最后用PBST缓冲溶液洗涤两次后加入1mL PBST重悬，取3μL磁性微球标记的鼠抗人PTH单克隆抗体置于第三检测区6中，在湿度<30％环境中干燥6h；
2.4磁性微球标记鼠抗人N-MID OT单克隆抗体
取1mg羧基功能化的磁性微球置于离心管中，用1mL的MEST缓冲溶液洗涤两次；取600μL的MES重悬磁性微球后，依次向体系中加入1mg的EDC和1mg的NHS，在37℃下置于旋转混合器上活化0.5h；磁分离后，移除上层清液，用500μL的MEST缓冲溶液洗涤两次，用PBST溶液重悬后加入40μg鼠抗人N-MID OT单克隆抗体在4℃下搅拌12h；将偶联产物与乙醇胺(2％，V/V)在37℃下活化0.5h，最后用PBST缓冲溶液洗涤两次后加入1mL PBST重悬，取3μL磁性微球标记的鼠抗人N-MID OT单克隆抗体置于第四检测区7中，在湿度<30％环境中干燥6h；
3.质控区的处理
磁性微球标记羊抗兔多克隆抗体:取1mg羧基功能化的磁性微球置于离心管中，用1mL的MEST缓冲溶液洗涤两次；取600μL的MES重悬磁性微球后，依次向体系中加入1mg的EDC和1mg的NHS，在37℃下置于旋转混合器上活化0.5h；磁分离后，移除上层清液，用500μL的MEST缓冲溶液洗涤两次，用PBST溶液重悬后加入40μg羊抗兔多克隆抗体在4℃下搅拌12h；将偶联产物与乙醇胺(2％，V/V)在37℃下活化0.5h，最后用PBST缓冲溶液洗涤两次后加入1mL PBST重悬，取3μL磁性微球标记的羊抗兔多克隆抗体置于质控区8中，在湿度<30％环境中干燥6h；
4.微流控芯片联合检测
1)将微流控芯片置于配套的仪器中，启动电磁铁(若为永磁铁则不需要)，使第一检测区4、第二检测区5、第三检测区6、第四检测区7和质控区8中的免疫磁性微球平铺固定到相应区域的底面；
2)从加样孔10加入检测样本，样本通过毛细管微通道17流入抗体包被区2，复溶预储存在抗体包被区中的荧光微球标记的一株鼠抗人25-OH-D单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人25-OH-D3单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人PTH单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人N-MID OT单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG，得到混合物；
3)随后，步骤2)中得到的混合物通过毛细管微通道18流入到微混合区3，在微混合区样本中的25-OH-D与荧光微球标记的鼠抗人25-OH-D单克隆抗体进行充分反应形成荧光微球标记的25-OH-D免疫复合物，25-OH-D3与荧光微球标记的鼠抗人25-OH-D3单克隆抗体进行充分反应形成荧光微球标记的25-OH-D3免疫复合物，PTH与荧光微球标记的鼠抗人PTH单克隆抗体进行充分反应形成荧光微球标记的PTH免疫复合物，N-MID OT与荧光微球标记的鼠抗人N-MID OT单克隆抗体进行充分反应形成荧光微球标记的N-MID OT免疫复合物，且荧光微球标记的兔IgG未参加反应；
4)步骤4)中反应后形成的荧光微球标记的25-OH-D免疫复合物、荧光微球标记的25-OH-D3免疫复合物、荧光微球标记的PTH免疫复合物、荧光微球标记的N-MID OT免疫复合物、未参加反应的荧光微球标记的鼠抗人25-OH-D单克隆抗体、未参加反应的荧光微球标记的鼠抗人25-OH-D3单克隆抗体以及未参加反应的荧光微球标记的兔IgG通过毛细管微通道进入到第一检测区4、第二检测区5、第三检测区6、第四检测区7和质控区8内，未参加反应的荧光微球标记的一株25-OH-D单克隆抗体与第一检测区4中磁性微球标记的一株25-OH-D完全抗原发生免疫反应而停留在第一检测区4内，未参加反应的荧光微球标记的一株25-OH-D3单克隆抗体与第二检测区5中磁性微球标记的另一株25-OH-D3完全抗原发生免疫反应而停留在第二检测区5内，荧光微球标记的PTH免疫复合物与第三检测区6中磁性微球标记的另一株鼠抗人PTH单克隆抗体发生免疫反应而停留在第三检测区6中，荧光微球标记的N-MID OT免疫复合物与第四检测区7中磁性微球标记的另一株鼠抗人N-MID OT单克隆抗体发生免疫反应而停留在第四检测区7中，荧光微球标记的兔IgG与质控区8中磁性微球标记的羊抗兔多克隆抗体发生免疫反应而停留在质控区8中，剩余液体流入废液收集区9；
4)第一检测区4、第二检测区5、第三检测区6、第四检测区7和质控区8的荧光微球均显示一定的荧光信号，并且第一检测区4与质控区8的荧光信号的比值与25-OH-D的浓度具有负相关性，并且第二检测区5与质控区8的荧光信号的比值与25-OH-D3的浓度具有负相关性，并且第三检测区6与质控区8的荧光信号的比值与PTH的浓度具有正相关性，并且第四检测区7与质控区8的荧光信号的比值与N-MID OT的浓度具有正相关性，通过标准曲线计算即可得出样本中25-OH-D、25-OH-D3、PTH和N-MID OT的浓度。
5.标准曲线的建立
配置浓度为0、5、15、30、60、120ng/mL的25-OH-D校准品用于建立25-OH-D标准曲线(如图4)，检测灵敏度为5ng/mL，检测范围为5～120ng/mL；配置浓度为0、4、10、20、40、100ng/mL的25-OH-D3校准品用于建立25-OH-D3标准曲线(如图5)，检测灵敏度为4ng/mL，检测范围为4～100ng/mL；配置浓度为0、10、30、100、300、1000pg/mL的PTH校准品用于建立PTH标准曲线(如图6)，检测灵敏度为10pg/mL，检测范围为10～1000pg/mL；配置浓度为0、2、6、20、60、180ng/mL的N-MID OT校准品用于建立N-MID OT标准曲线(如图7)，N-MID OT检测灵敏度为2ng/mL，检测范围为2～180ng/mL，检测结果如表1所示。
表1
6.精密度的测定
取浓度为15ng/mL和60ng/mL的25-OH-D校准品、浓度为10ng/mL和40ng/mL的25-OH-D3校准品、浓度为30pg/mL和300pg/mL的PTH校准品、浓度为6ng/mL和60ng/mL的N-MIDOT校准品进行精密度的测定，每个样本重复测定10次，计算批间平均偏差和批内平均偏差CV％值，测定结果如表2中所示，批间差和批内差均小于15％。
表2
附：所需溶液配制
(1)碳酸钠缓冲溶液
碳酸钠 4.33g
碳酸氢钠 2.96g
纯化水定容至1000mL；
(2)柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(LM)
柠檬酸三钠 7.33g
柠檬酸 4.44g
氢氧化钠 1g
纯化水定容至1000mL；
(3)MEST缓冲溶液
纯化水定容至1000mL；
(4)MES缓冲溶液
磷酸氢二钠 6.59g
磷酸二氢钠 24.21g
2-吗啉乙磺酸(MES) 1.95g
纯化水定容至1000mL；
(5)PBST缓冲溶液
磷酸氢二钠 43.42g
磷酸二氢钠 5.24g
Tween20 0.1g
纯化水定容至1000mL。
以上所述仅为本实用新型的优选实施例，并不用于限制本实用新型，对于本领域技术人员而言，本实用新型可以有各种改动和变化。凡在本实用新型的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种用于诊断骨代谢疾病的联合检测微流控芯片，其特征在于，包括：芯片基板及盖合于所述芯片基板上方的上层盖片，
所述芯片基板上设有依次通过毛细管微通道连通的加样区、抗体包被区、微混合区、第一检测区、第二检测区、第三检测区、第四检测区、质控区及废液收集区；
所述上层盖片上设有加样孔、第一检测窗口、第二检测窗口、第三检测窗口、第四检测窗口、质控窗口、通气孔，并且与所述加样区、第一检测区、第二检测区、第三检测区、第四检测区、质控区、废液收集区的位置依次对应；
其中，所述抗体包被区预存储有荧光微球标记的一株鼠抗人25-OH-D单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人25-OH-D3单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人PTH单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人N-MID OT单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG的混合物；
所述第一检测区、第二检测区、第三检测区或第四检测区中分别预存储有磁性微球标记的一株25-OH-D完全抗原、磁性微球标记的一株25-OH-D3完全抗原、磁性微球标记的另一株鼠抗人PTH单克隆抗体、磁性微球标记的另一株鼠抗人N-MID OT单克隆抗体中的一种且四者所预存储的物质各不相同。
2.根据权利要求1所述的用于诊断骨代谢疾病的联合检测微流控芯片，其特征在于，所述第一检测区、第二检测区、第三检测区、第四检测区和质控区的下侧设有由永磁铁或电磁铁提供的磁场区域。
3.根据权利要求1所述的用于诊断骨代谢疾病的联合检测微流控芯片，其特征在于，所述荧光微球标记的一株鼠抗人25-OH-D单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人25-OH-D3单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人PTH单克隆抗体、荧光微球标记的一株鼠抗人N-MID OT单克隆抗体和荧光微球标记的兔IgG的摩尔比为1：1：1：1：(0.1～4)。
4.根据权利要求1所述的用于诊断骨代谢疾病的联合检测微流控芯片，其特征在于，所述第一检测区、第二检测区、第三检测区或第四检测区中磁性微球与一株25-OH-D完全抗原的质量比为10：(0.05～2)；所述第一检测区、第二检测区、第三检测区或第四检测区中磁性微球与磁性微球标记的一株25-OH-D3完全抗原的质量比为10：(0.05～2)；所述第一检测区、第二检测区、第三检测区或第四检测区中磁性微球与另一株鼠抗人PTH单克隆抗体的质量比为10：(0.05～2)；所述第一检测区、第二检测区、第三检测区或第四检测区中磁性微球与另一株鼠抗人N-MID OT单克隆抗体的质量比为10：(0.05～2)。
5.根据权利要求1所述的用于诊断骨代谢疾病的联合检测微流控芯片，其特征在于，所述质控区预存储有磁性微球标记的羊抗兔多克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的用于诊断骨代谢疾病的联合检测微流控芯片，其特征在于，所述第一检测区、第二检测区、第三检测区、第四检测区和质控区的表面设置为粗糙结构，所述粗糙结构为向下凹的半圆结构、锯齿形结构或凹凸的矩形结构；
所述微混合区为棱形、圆形、方形或矩形，并且其内部设有n个交错设置的矩形、棱形、方形或圆形的柱体；或者所述微混合区为至少一个矩形串联结构，并且每个矩形中设有一个矩形柱体；或者所述微混合区为锯齿形结构；或者所述微混合区为至少一个正三角形或倒三角形串联结构，并且每个三角形中设置有一个相应正三角或者倒三角形柱体；或者所述微混合区为至少一个棱形结构串联，并且棱形结构中设置有一个棱形或圆形柱体；或者所述微混合区为至少一个圆形结构串联，并且圆形结构中设置有一个圆形柱体。
Priority Applications (1)
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| CN201820271460.1U CN207591891U (zh) | 2018-02-26 | 2018-02-26 | 一种用于诊断骨代谢疾病的联合检测微流控芯片 |
Applications Claiming Priority (1)
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