CN207108996U - 测定defa1‑3基因拷贝数的试剂盒及系统 - Google Patents

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Abstract

本实用新型提供了一种测定DEFA1‑3基因拷贝数的试剂盒及系统，涉及生物检测技术领域，本实用新型提供的测定DEFA1‑3基因拷贝数的试剂盒，内置有用于放置试剂瓶、微滴发生卡收纳盒和枪头盒的限位孔，操作方法简便，快速。其中，设置微滴发生卡收纳盒可以避免试剂盒内的微滴发生卡因实验多次使用试剂盒而造成污染，设置移液枪枪头的枪头盒，可以避免实验前对枪头进行处理，省时省力。

Description

测定DEFA1-3基因拷贝数的试剂盒及系统
技术领域
本实用新型涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种测定DEFA1-3基因拷贝数的试剂盒及系统。
背景技术
人是2倍体生物(diploid genome)，大多数的基因只有两个拷贝，但是也有一些基因具有多个拷贝。多拷贝的基因在不同的人身上具有拷贝数的变异，如DEFB1-3基因，在高加索人身上其拷贝数的变异在2-12之间，方向明课题组发现中国人DEFA1-3基因拷贝数的变异在2-16之间。目前研究发现DEFA1-3基因拷贝数的变异与人疾病发展预后可能相关，尤其是感染性疾病。
目前经常用到的测量基因拷贝数的方法有三种即qPCR，paralog ratio test(PRT)和multiplex ligation-dependent probe amplification(MLPA)。它们在具体设计上有所不同，但是都用到的一个原理就是把DEFA1-3测得的基因数量与一个或者多个拷贝数没有变异的基因数量做比较，以此推断DEFA1-3拷贝数。前期有学者的研究比较上述三种方法，发现MLPA是这三种方法里最准确，最可靠的方法，但是它的缺点就是方法复杂，耗时长，测量一个标本的费用比较高。MLPA的原理是利用杂交探针的方法扩增DEFA1-3以及其他30基因片段，然后通过比较DEFA1-3片段与其他基因片段在扩增后产物的量来计算DEFA1-3拷贝数。
因此，开发一种方法简便、耗时短、成本低，并且准确可靠的测定DEFA1-3基因拷贝数的方法尤为重要。
有鉴于此，特提出本实用新型。
实用新型内容
本实用新型的第一个目的在于提供一种测定DEFA1-3基因拷贝数的试剂盒，本实用新型的第二个目的在于提供一种测定DEFA1-3基因拷贝数的系统，以缓解现有技术中存在的测定DEFA1-3拷贝数方法复杂，耗时长，费用高的技术问题。
本实用新型提供的一种测定DEFA1-3基因拷贝数的试剂盒，所述试剂盒包括：
盒体和盒盖；
所述盒体内设有限位垫，所述限位垫上设有用于放置试剂瓶、微滴发生卡收纳盒和枪头盒的限位孔。
进一步地，所述限位垫为弹性材料限位垫，可拆卸地固定在所述盒体内部。
进一步地，所述试剂瓶包括瓶身和瓶盖，所述瓶身上设有用于标示试剂名称、批号、生产日期、有效期的标签，所述瓶盖上也设有用于标示试剂名称的标签。
进一步地，所述试剂瓶包括：
RNase Free dH2O试剂瓶；ddPCR探针法预混液试剂瓶；探针法ddPCR微滴发生油试剂瓶；2×ddPCR探针法质控液试剂瓶；阳性对照，已知拷贝数分别为2，4，6，8，10，12，14，16的样品试剂瓶；阴性对照试剂瓶；10×CutSmart buffer试剂瓶；Msel酶试剂瓶。
进一步地，所述枪头盒包括枪头盒体和枪头盒盖，所述枪头盒体内设有用于装载移液枪枪头的枪头孔架。
进一步地，所述枪头孔架上设有96个枪头孔。
进一步地，所述枪头孔内放置有20μl的无核酸移液枪枪头。
进一步地，所述微滴发生卡收纳盒包括收纳盒体和收纳盒盖，所述收纳盒体中设有能够竖直放置微滴发生卡的插槽。
进一步地，所述盒盖内壁设有用于固定说明书的说明书固定装置。
另外，本实用新型还提供了一种测定DEFA1-3基因拷贝数的系统，应用上述的测定DEFA1-3基因拷贝数的试剂盒。
本实用新型提供的测定DEFA1-3基因拷贝数的试剂盒，内置有用于放置试剂瓶、微滴发生卡收纳盒和枪头盒的限位孔，操作方法简便，快速。其中，设置微滴发生卡收纳盒可以避免试剂盒内的微滴发生卡因实验多次使用试剂盒而造成污染，设置移液枪枪头的枪头盒，可以避免实验前对枪头进行处理，省时省力。
附图说明
为了更清楚地说明本实用新型具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本实用新型的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本实用新型实施例1提供的测定DEFA1-3基因拷贝数的试剂盒的限位垫结构示意图；
图2为本实用新型实施例1提供的测定DEFA1-3基因拷贝数的试剂盒的整体示意图；
图3为本实用新型实施例1提供的测定DEFA1-3基因拷贝数的试剂盒的内部构造示意图；
图4为本实用新型实施例1提供的测定DEFA1-3基因拷贝数的试剂盒的盒体示意图。
图标：1-盒体；2-盒盖；3-限位垫；4-枪头盒；41-枪头盒体；42-枪头盒盖；43-枪头孔架；5-微滴发生卡收纳盒；51-插槽；6-说明书固定装置。
具体实施方式
下面将结合附图对本实用新型的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。
在本实用新型的描述中，需要说明的是，术语“上”、“竖直”、“水平”、“内”等，其所指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本实用新型和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本实用新型的限制。
目前，经常用到的测量基因拷贝数的方法有三种即qPCR，PRT和MLPA，其中，MLPA是这三种方法里最准确，最可靠的方法，但是它的缺点就是方法复杂，耗时长，测量一个标本的费用比较高。
因此，针对上述问题，本实用新型提供了一种测定DEFA1-3基因拷贝数的试剂盒，包括：
盒体1和盒盖2；
盒体1内设有限位垫3，限位垫3上设有用于放置试剂瓶、微滴发生卡收纳盒5和枪头盒4的限位孔。
其中，盒体1与盒盖2可以是铰接的，也可以是相互独立的。
在本实用新型中，DEFA1-3基因为人DEFA1-3基因。
在本实用新型中，限位垫3为弹性材料限位垫，可拆卸地固定在盒体1内部。
限位垫3为弹性材料，可以有效缓冲本实用新型提供的试剂盒在移动的过程中产生的撞击力，降低试剂瓶破碎的风险。同时，限位垫3还能保证试剂盒内部的试剂瓶、微滴发生卡收纳盒5和枪头盒4保持位置相对固定，在避免撞击造成损坏的同时，保证试剂盒内规整。
在一个优选的实施方式中，限位垫3为海绵限位垫。
在另一个优选的实施方式中，限位垫3为泡沫限位垫。
在本实用新型中，试剂瓶包括瓶身和瓶盖，瓶身上设有用于标示试剂名称、批号、生产日期、有效期的标签，瓶盖上也设有用于标示试剂名称的标签。
在瓶身上设有用于标记内部试剂的标签，便于在试剂瓶拿出试剂盒后进行不同试剂的区分，同时，在瓶盖上也设有用于标记内部试剂的标签，在试剂瓶放置在试剂盒内时，不用取出试剂瓶即可对装有不同试剂的试剂瓶进行区分，便于操作。
在本实用新型中，试剂瓶包括：
RNase Free dH2O试剂瓶；ddPCR探针法预混液试剂瓶；探针法ddPCR微滴发生油试剂瓶；2×ddPCR探针法质控液试剂瓶；阳性对照，已知拷贝数分别为2，4，6，8，10，12，14，16的样品试剂瓶；阴性对照试剂瓶；10×CutSmart buffer试剂瓶；Msel酶试剂瓶。
其中，ddPCR探针法预混液包括：2×ddPCR Supermix for probes，上游引物(DEFA1-3-F)、下游引物(DEFA1-3-R)，特异探针，RNase Free dH2O。2×ddPCR Supermixfor probes、DEFA1-3-F、DEFA1-3-R、探针和RNase Free dH2O的体积比为60：15：15：5：25。引物和探针的浓度均为10μM。
特异性检测DEFA1-3基因的上下游引物分别为：
DEFA1-3-F：5'-CCGTCCTTCCCTCTAGACTTAGC-3'(SEQ ID NO.1)；
DEFA1-3-R：5'-GAGCAGATTGCAGCGGACAT-3'(SEQ ID NO.2)；
特异性检测DEFA1-3基因的探针为：FAM-ACTGCTAACTCCATACTC-MGB(SEQ IDNO.3)。
在本实用新型中，枪头盒4包括枪头盒体41和枪头盒盖42，枪头盒体41内设有用于装载移液枪枪头的枪头孔架43。
其中，枪头盒体41与枪头盒盖42可以是铰接的，也可以是相互独立的。枪头盒体41单独配有枪头盒盖42，在盒盖2打开的情况下，枪头盒盖42依然可以保证枪头盒4内部不被核酸污染，保证了本实用新型提供的测定DEFA1-3基因拷贝数的剂盒检测结果的准确性。
在本实用新型中，枪头孔架43上设有96个枪头孔。
在本实用新型中，枪头孔内放置有20μl的无核酸移液枪枪头。
设置移液枪枪头的枪头盒，可以避免实验前对枪头进行处理，省时省力。同时，无核酸枪头能够防止实验中待测样本被核酸污染，而导致检测结果的偏差，从而使得检测结果更加准确。
在本实用新型中，微滴发生卡收纳盒5包括收纳盒体和收纳盒盖，收纳盒体中设有能够竖直放置微滴发生卡的插槽51。
其中，收纳盒体和收纳盒盖可以是铰接的，也可以是相互独立的。收纳盒体单独配有收纳盒盖，在盒盖2打开的情况下，收纳盒盖依然可以保证微滴发生卡收纳盒5内部不被污染，保证了本实用新型提供的测定DEFA1-3基因拷贝数的剂盒检测结果的准确性。同时，插槽51能够保证每张微滴发生卡单独放置，防止摩擦造成损坏，竖直放置也能够使微滴发生卡便于拿取，操作方便。
在本实用新型中，盒盖2内壁设有用于固定说明书的说明书固定装置6。
其中，说明书固定装置6为说明书插槽或透明插袋。
在实验操作人员使用本实用新型提供的测定DEFA1-3基因拷贝数的试剂盒时，将说明书放入盒盖2内壁上的说明书固定装置6内，在操作过程中方便阅读，同时，可以避免说明书易丢失的问题。
另外，本实用新型还提供了一种测定DEFA1-3基因拷贝数的系统，应用上述的测定DEFA1-3基因拷贝数的试剂盒。
为了有助于更清楚的理解本实用新型的内容，现结合具体的实施例详细介绍如下。
实施例1
一、引物及探针的设计与筛选
根据GenBank中目的基因DEFA1-3相应序列(编号：MGI:MGI:99588)，选择长度为50～150bp的保守片段、采用Primer Express 2.0软件设计特异性探针和引物，最终选择灵敏度最高、特异性强的目的基因的探针和引物进行实验。
所得到的特异性检测DEFA1-3基因的上下游引物分别为：
DEFA1-3-F：5'-CCGTCCTTCCCTCTAGACTTAGC-3'(SEQ ID NO.1)；
DEFA1-3-R：5'-GAGCAGATTGCAGCGGACAT-3'(SEQ ID NO.2)；
特异性检测DEFA1-3基因的探针为：FAM-ACTGCTAACTCCATACTC-MGB(SEQ IDNO.3)。
二、试剂盒的选择及试剂的预处理
选择本实用新型提供的测定DEFA1-3基因拷贝数的试剂盒，，包括：
盒体1和盒盖2；
所述盒体1内设有限位垫3，如图1和图2所示，限位垫3上设有用于放置试剂瓶、微滴发生卡收纳盒5和枪头盒4的限位孔，如图3所示。
其中，盒体1与盒盖2为铰接；限位垫3为海绵限位垫，可拆卸地固定在盒体1内部。
试剂瓶包括瓶身和瓶盖，所述瓶身上设有用于标示试剂名称、批号、生产日期、有效期的标签，所述瓶盖上也设有用于标示试剂名称的标签。
试剂瓶包括：
RNase Free dH2O试剂瓶，1支，1.2mL；ddPCR探针法预混液试剂瓶，一支，1.1mL；探针法ddPCR微滴发生油试剂瓶，一支，4mL；2×ddPCR探针法质控液试剂瓶，一支，2.4mL；阳性对照，已知拷贝数分别为2，4，6，8，10，12，14，16的样品试剂瓶各一支，每支40μL；阴性对照(RNase Free dH2O)试剂瓶，一支，48μL；10×CutSmart buffer试剂瓶，一支，1.2mL；Msel酶试剂瓶，一支，40单位(4μL)。
选择已知拷贝数为2，4，6，8，10，12，14，16的阳性模板，使用0.01M pH8.0的Tris-EDTA缓冲液稀释100倍后，于-80℃冷冻保存，阳性对照制剂按400μL定量分装。
ddPCR探针法预混液其1.1mL的组成为：600μL的2×ddPCR Supermix for probes，上、下游引物分别为150μL，特异探针为50μL，引物和探针的浓度均为10μM，RNase FreedH2O 250μL。
三、待测样本的提取和处理
随机选择15例危重病人和5例健康人从外周静脉中抽取2mL全血放入EDTA抗凝管中。使用DNA提取试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)提取样品总DNA，并编号。
将提取的每个总DNA配置为处理体系并反应，其中，处理体系如下：
样品 体积(μL)
ddH2O 20.3
10×CutSmart buffer 2.5
Msel酶 0.2
样本DNA 2
反应条件如下：
温度(℃) 时间(min)
37 60
65 20
四、待测样本DEFA1-3基因拷贝数的测定
利用本实施例提供的测定DEFA1-3基因拷贝数的试剂盒对待测样本DNA进行DEFA1-3基因拷贝数的测定，使用方法如下：
实验操作人员首先打开盒盖2，将试剂盒说明书固定于盒盖2内壁的说明书固定装置6上，应用试剂盒内无核酸枪头分别从相应的试剂瓶中取ddPCR探针法预混液18μL和处理过的DNA模板2μL，制备ddPCR反应液，空白对照以RNase Free dH2O代替DNA模板，同样条件下扩增；之后，从微滴发生卡收纳盒5中取微滴发生卡置于卡托中固定，应用试剂盒内无核酸枪头将20μL反应液加入微滴发生卡中间一排的8个孔内，不足8个样品时用20μL 1×ddPCR探针法质控液补足；在微滴发生卡最低下一排8个孔中各加入70μL微滴发生油，并盖胶垫密封；将以上卡托轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴；微滴生成于微滴发生卡最上面一排孔内，缓慢吸取40μL，再打入96孔板相应位置孔内；封好膜之后在96孔PCR仪内进行PCR反应，升降温速度小于2.5℃/秒；其中，PCR条件如下：
将完成PCR的96孔板放入plate holder中组装好，之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中，打开QuantaSoft软件进行检测分析。
试验结束后，将盒盖2盖合于盒体1上，如图4所示，并将本实施例提供的测定DEFA1-3基因拷贝数的试剂盒于-20℃保存。
本实施例提供的测定DEFA1-3基因拷贝数的试剂盒，操作方法简便，快速。其中，设置微滴发生卡收纳盒5可以避免试剂盒内的微滴发生卡因实验多次使用试剂盒而造成污染，设置移液枪枪头的枪头盒，可以避免实验前对枪头进行处理，省时省力。
实施例2
本实施例提供了一种测定DEFA1-3基因拷贝数的系统，包括实施例1提供的测定DEFA1-3基因拷贝数的试剂盒、微滴生成仪、PCR仪、计算机、移液枪和微滴读取仪。
使用本实施例提供的测定DEFA1-3基因拷贝数的系统测定DEFA1-3基因拷贝数，在同一实验地点即可完成DEFA1-3基因拷贝数的测定，操作方便，同时可以避免试剂及待测样本在移动过程中被污染，减少误差，提高检测的准确性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本实用新型的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本实用新型进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本实用新型各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种测定DEFA1-3基因拷贝数的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
盒体(1)和盒盖(2)；
所述盒体(1)内设有限位垫(3)，所述限位垫(3)上设有用于放置试剂瓶、微滴发生卡收纳盒(5)和枪头盒(4)的限位孔。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述限位垫(3)为弹性材料限位垫，可拆卸地固定在所述盒体(1)内部。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂瓶包括瓶身和瓶盖，所述瓶身上设有用于标示试剂名称、批号、生产日期、有效期的标签，所述瓶盖上也设有用于标示试剂名称的标签。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述枪头盒(4)包括枪头盒体(41)和枪头盒盖(42)，所述枪头盒体(41)内设有用于装载移液枪枪头的枪头孔架(43)。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述枪头孔架(43)上设有96个枪头孔。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述枪头孔内放置有20μl的无核酸移液枪枪头。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述微滴发生卡收纳盒(5)包括收纳盒体和收纳盒盖，所述收纳盒体中设有能够竖直放置微滴发生卡的插槽(51)。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述盒盖(2)内壁设有用于固定说明书的说明书固定装置(6)。
9.一种测定DEFA1-3基因拷贝数的系统，其特征在于，应用权利要求1-8任一项所述的测定DEFA1-3基因拷贝数的试剂盒。
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