CN206832815U - 一种定量检测微囊藻毒素‑lr的时间分辨免疫层析试纸条及试纸卡 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种定量检测微囊藻毒素‑LR的时间分辨免疫层析试纸条及应用其的试纸卡，试纸条包括底板、吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫。其中，硝酸纤维素膜位于试纸卡的底板中间，之上间隔设有含抗MC‑LR‑人工抗原涂层的检测线和含二抗IgG抗体涂层的质控线，所述检测线靠近所述结合垫，所述质控线靠近所述吸水纸；所述结合垫处喷涂有标记有抗MC‑LR抗体的含铕元素的高分子纳米微球涂层；所述吸水纸、所述硝酸纤维素膜、所述结合垫和所述样品垫之间，依次且仅与相邻部位相接触且部分重叠。本实用新型所述试纸条操作简便，可实现快速、准确、定量、单样本检测，解决了现有试剂检测速度慢、无法定量等技术问题。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种定量检测微囊藻毒素-LR的时间分辨免疫层析试纸条及试纸卡，属于生物工程技术领域。
背景技术
微囊藻毒素(MC)是一种环状七肽物质，由古老的原核生物蓝藻代谢释放产物，有多种异构体，对动物和人有强烈的肝毒性。其中最常见、水体含量高、毒性最大的是MC-LR，能诱发肝癌，近期研究还发现低剂量的MC-LR即能损伤神经细胞、生殖细胞。在淡水水体富营养化的今天，蓝藻爆发事件时有发生，MC污染对人类的健康造成了严重威胁，而此毒素在水体中自然降解缓慢，使用现行自来水处理工艺难以去除。鉴于此，我国制定标准《GB5749-2006》要求对饮用水、湖泊水、河水和地表水的MC-LR含量进行监测。
因此，检测手段的便利程度和准确程度，关系到各环境监测单位和水厂，关系到对蓝藻水华的控制、对水环境的综合治理，关系到居民饮用水安全和经济发展，意义重大。因此，建立快速、准确符合国情、的MC-LR检测方法，必要而且迫切，具有良好的应用前景和推广价值。
目前已有的MC-LR检测方法包括：(1)物理化学法，如：高效液相色谱法、高效液相-串联质谱法、气相色谱法、毛细管电泳法等；(2)生物化学方法有：蛋白磷酸酶分析法、组织细胞培养法、2-甲基-3-甲氧基-4-苯基丁酸法；(3)分子生物学方法(PCR法)；(4)免疫分析法：酶联免疫法，时间分辨免疫法，胶体金免疫层析法等。而这些方法都有各自的特点及局限性：常用的物理化学方法，测定结果准确，但采用的仪器昂贵、操作繁琐、成本高；免疫分析方法价格低、操作相对简单，但存在或仅能定性、准确度欠佳，或不能单样本检测等缺点，因此这些方法尚不能准确、快速、定量测定MC-LR。
实用新型内容
本实用新型要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种定量检测微囊藻毒素-LR的时间分辨免疫层析试纸条，其能够解决现有时间分辨荧光免疫技术无法实现单样本、小批量检测的问题，以及胶体金免疫层析法只能定性不能定量检测的问题。
为了解决上述技术问题，本实用新型提供了如下的技术方案：
本实用新型一种定量检测微囊藻毒素-LR的时间分辨免疫层析试纸条，其包括底板以及沿所述底板的长度方向顺次粘覆于所述底板上的吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫；所述吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫分别依次与且仅与相邻部件相接触；其中，
所述硝酸纤维素膜上设置有相间隔的由抗MC-LR-人工抗原涂层形成的检测线和由二抗IgG抗体涂层形成的质控线；且所述检测线靠近所述结合垫，所述质控线靠近所述吸水纸；
所述结合垫上喷涂有标记了抗MC-LR抗体的含稀土离子的高分子纳米微球涂层。
优选地，所述吸水纸、所述硝酸纤维素膜、所述结合垫以及所述样品垫分别依次与且仅与相邻部件部分重叠。
优选地，所述质控线与所述检测线平行设置，且所述质控线与所述检测线之间的距离为0.3cm-1.0cm。
优选地，所述稀土离子为铕。
优选地，所述高分子纳米微球涂层中纳米微球的直径为10-500nm。
优选地，所述吸水纸位于所述硝酸纤维素膜的上方，且所述吸水纸与所述硝酸纤维素膜相重叠的部分沿所述底板长度方向的长度为2mm。
优选地，所述结合垫位于所述硝酸纤维素膜的上方，且所述结合垫与所述硝酸纤维素膜相重叠的部分沿所述底板长度方向的长度为2mm。
优选地，所述样品垫位于所述结合垫的上方，且所述样品垫与所述结合垫相重叠的部分沿所述底板长度方向的长度为2mm；所述结合垫沿所述底板长度方向的长度大于4mm。
进一步地，所述含铕元素的高分子纳米微球的直径为100-300nm。
本实用新型的另一个方面公开了一种时间分辨免疫层析试纸条制作的试纸卡，其包括外壳，所述外壳包覆在所述试纸条外部；所述外壳包括底座和卡盖，所述卡盖上设置有观察口和加样口；所述加样口开口于所述样品垫上部，以露出部分或全部所述样品垫区域；所述观察口开口于所述硝酸纤维素膜上部，以露出全部所述检测线和所述质控线。
本实用新型所达到的有益效果是：
(1)本实用新型所述定量检测MC-LR的时间分辨免疫层析试纸条将时间分辨荧光免疫技术、竞争法测抗原与具体试纸结构相结合，形成了一种可用于单次、定量检测MC-LR含量的试纸条，解决了现有技术中MC-LR试剂盒不适合单样本、小批量检测的问题。采用本实用新型所述试纸条检测MC-LR灵敏度高，批内、批间差小，为应用提供了极大便利。
(2)本实用新型所述定量检测MC-LR的时间分辨免疫层析试纸条中，所述结合垫上喷涂有标记了抗MC-LR抗体的铕元素微球涂层，解决了将抗MC-LR抗体的直接标记于荧光元素进行检测时，荧光信号微弱造成检测不准确的问题，含有铕元素的高分子纳米微球减少了铕元素在样品溶液中的猝灭，提高了铕元素发出的荧光强度，进而提高了检测的精确度。
(3)本实用新型所述定量检测MC-LR的时间分辨免疫层析试纸卡，由定量检测MC-LR的时间分辨免疫层析试纸条和塑料卡壳组成，不仅利于检测操作更利于试纸条的存放和携带。
附图说明
附图用来提供对本实用新型的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本实用新型的实施例一起用于解释本实用新型，并不构成对本实用新型的限制。在附图中：
图1为本实用新型所述试纸条的沿其长度方向的剖面结构示意图；
图2为本实用新型所述试纸条的平面结构示意图；
图3为本实用新型所述试纸卡的平面结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本实用新型的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本实用新型，并不用于限定本实用新型。
如图1和图2所示，本实用新型一种定量检测微囊藻毒素-LR的时间分辨免疫层析试纸条，其包括底板1以及沿所述底板1的长度方向顺次粘覆于所述底板1上的吸水纸3、硝酸纤维素膜2、结合垫5和样品垫4；所述吸水纸3、硝酸纤维素膜2、结合垫5和样品垫4分别依次与且仅与相邻部件相接触；其中，
所述硝酸纤维素膜2上设置有相间隔的由抗MC-LR-人工抗原涂层形成的检测线7和由二抗IgG抗体涂层形成的质控线6；且所述检测线7靠近所述结合垫5，所述质控线6靠近所述吸水纸3；
所述结合垫5上喷涂有标记了抗MC-LR抗体的含铕离子的高分子纳米微球涂层。
本实施例中，所述吸水纸3、所述硝酸纤维素膜2、所述结合垫5以及所述样品垫4分别依次与且仅与相邻部件部分重叠。
本实施例中，所述质控线6与所述检测线7平行设置，且所述质控线6与所述检测线7之间的距离为0.3cm-1.0cm。
本实施例中，所述高分子纳米微球涂层中纳米微球的直径为10-500nm。
本实施例中，所述吸水纸3位于所述硝酸纤维素膜2的上方，且所述吸水纸3与所述硝酸纤维素膜2相重叠的部分沿所述底板1长度方向的长度为2mm。
本实施例中，所述结合垫5位于所述硝酸纤维素膜2的上方，且所述结合垫5与所述硝酸纤维素膜2相重叠的部分沿所述底板1长度方向的长度为2mm。
本实施例中，所述样品垫4位于所述结合垫5的上方，且所述样品垫4与所述结合垫5相重叠的部分沿所述底板1长度方向的长度为2mm；为了保证试纸条的顺利使用，所述结合垫5沿所述底板1长度方向的长度大于4mm。也就是说，结合垫5的长度要大于样品垫与结合垫重叠部分沿所述底板1长度方向的长度和结合垫与硝酸纤维素膜重叠部分沿所述底板1长度方向的长度之和。
本实施例中，所述试纸条宽0.5cm，所述含铕元素的高分子纳米微球是直径200nm的含有铕离子的高分子纳米微球。在其它实施例中所述含铕元素的高分子纳米微球的直径可以是10、50、100、150、200、300或500nm等各种尺寸，优选为100-300nm之间的尺寸。相应重叠部分沿所述底板长度方向的长度可以是1mm、2mm、3mm、4mm、5mm等只要满足使用要求即可。
使用上述试纸条进行定量检测时，在样品垫4上加入样品液，在毛细作用下，样品液向吸水纸3泳动，当样品液中含有MC-LR时，MC-LR与含铕元素的高分子纳米微球上的抗MC-LR抗体形成抗原-抗体复合物，随着层析作用，复合物向前移动，到达MC-LR-人工抗原的检测线7(T线)处，未结合抗原的抗MC-LR抗体-含铕元素的高分子纳米微球与检测线上的人工抗原，形成抗体-抗原复合物，聚集在检测线上。未结合MC-LR-人工抗原的含铕元素的高分子纳米微球继续前移，到达质控线(C线)时，二抗IgG抗体与铕微球上的抗体结合，在C线处出现铕元素微球的聚集，整个反应在15分钟内完成，T线和C线都会产生相应的荧光信号，使用相应的荧光检测仪对上述荧光信号进行检测，并计算MC-LR的含量。
鉴于上述试纸条结构不牢固，不利于直接进行定量检测操作、且存放携带不方便的问题，将上述结构的试纸条装入塑料外壳内部以利于各组成结构的固定，从而便于存放和检测。如图3所示，其中所述外壳包括底座和卡盖8，所述卡盖8上设置有观察口10和加样口9，以露出试纸条的局部区域；所述加样口9开口于所述样品垫4上部，以露出部分或全部所述样品垫4区域；所述观察口10开口于所述硝酸纤维素膜2上部，以露出全部所述检测线7和所述质控线6，使所述硝酸纤维素膜上的质控线6和检测线7裸露于外，便于荧光信号的检测。
本实用新型定量检测MC-LR的时间分辨免疫层析试纸条的制备方法如下：
(1)抗体的预处理：选用商品化的抗MC-LR抗体用0.05mol/L，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液4℃透析过夜。
(2)含有铕元素标记的抗MC-LR抗体的高分子纳米微球涂层的制备：用直径为200nm的微球，用0.05mol/L，pH7.2-7.6的MES缓冲液洗涤微球2次，同时调节微球浓度为1％，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，终浓度为20mmol，室温反应10-20分钟，充分洗涤微球，用0.05mol/L，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液复溶后加入透析过的抗MC-LR抗体，使抗MC-LR抗体B与微球的质量比为1:50，室温反应2小时，加入终止液(含有1％-10％BSA的0.01-0.05mol/L，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液)，室温反应30分钟，洗涤微球，加入复溶液(含有0.05％-1％BSA，0.05％-0.1％T ween-20,0.01M-0.05mol/L，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液)复溶至原体积。使用定量喷金划膜仪以3ul/cm-5ul/cm量将制备好的微球喷涂于聚酯膜形成的结合垫上，避光35-38℃烘干1小时，加入干燥剂封存备用。
(3)硝酸纤维素膜的制备：使用含1％蔗糖的0.02mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液，分别将透析过的抗MC-LR-人工抗原和二抗IgG抗体稀释至1mg/ml的浓度，使用定量喷金划膜仪以1ul/cm的量将二者以0.5cm的间隔喷于硝酸纤维素膜上，35-38℃烘干1h，加入干燥剂封存备用。
(4)样品垫的处理：使用含1％BSA、0.1％Triton100的0.02mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液浸泡样品垫1小时后，35-38℃烘干3小时，备用。
(5)试纸条的组装：组装操作必须在湿度小于35％，稳定20-25℃的房间进行，在PVC底板中间先铺设硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维素膜的与质控线相临近的一端铺吸水纸，使吸水纸与硝酸纤维素膜部分重叠，然后在硝酸纤维素膜的与检测线相临近的一端铺结合垫，使硝酸纤维素膜与结合垫的一端部分重叠，随后在结合垫的另一端再部分重叠的铺设样品垫，最后切割成0.5cm宽即得试纸条。
最后应说明的是：以上所述仅为本实用新型的优选实施例而已，并不用于限制本实用新型，尽管参照前述实施例对本实用新型进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本实用新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种定量检测微囊藻毒素-LR的时间分辨免疫层析试纸条，其特征在于，包括底板(1)以及沿所述底板(1)的长度方向顺次粘覆于所述底板(1)上的吸水纸(3)、硝酸纤维素膜(2)、结合垫(5)和样品垫(4)；所述吸水纸(3)、硝酸纤维素膜(2)、结合垫(5)和样品垫(4)分别依次与且仅与相邻部件相接触；其中，
所述硝酸纤维素膜(2)上设置有相间隔的由抗MC-LR-人工抗原涂层形成的检测线(7)和由二抗IgG抗体涂层形成的质控线(6)；且所述检测线(7)靠近所述结合垫(5)，所述质控线(6)靠近所述吸水纸(3)；
所述结合垫(5)上喷涂有标记了抗MC-LR抗体的含稀土离子的高分子纳米微球涂层；
所述吸水纸(3)、所述硝酸纤维素膜(2)、所述结合垫(5)以及所述样品垫(4)分别依次与且仅与相邻部件部分重叠；
所述质控线(6)与所述检测线(7)平行设置，且所述质控线(6)与所述检测线(7)之间的距离为0.3cm-1.0cm；
所述稀土离子为铕；
所述高分子纳米微球涂层中纳米微球的直径为10-500nm；
所述吸水纸(3)位于所述硝酸纤维素膜(2)的上方，且所述吸水纸(3)与所述硝酸纤维素膜(2)相重叠的部分沿所述底板(1)长度方向的长度为2mm；
所述结合垫(5)位于所述硝酸纤维素膜(2)的上方，且所述结合垫(5)与所述硝酸纤维素膜(2)相重叠的部分沿所述底板(1)长度方向的长度为2mm；
所述样品垫(4)位于所述结合垫(5)的上方，且所述样品垫(4)与所述结合垫(5)相重叠的部分沿所述底板(1)长度方向的长度为2mm；所述结合垫(5)沿所述底板(1)长度方向的长度大于4mm；
所述含铕元素的高分子纳米微球的直径为100-300nm。
2.一种使用权利要求1所述的时间分辨免疫层析试纸条制作的试纸卡，其特征在于，包括外壳，所述外壳包覆在所述试纸条外部；所述外壳包括底座和卡盖(8)，所述卡盖(8)上设置有观察口(10)和加样口(9)；所述加样口(9)开口于所述样品垫(4)上部，以露出部分或全部所述样品垫(4)区域；所述观察口(10)开口于所述硝酸纤维素膜(2)上部，以露出全部所述检测线(7)和所述质控线(6)。
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