CN108152500A - 一种基于荧光微球标记的微囊藻毒素免疫定量试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于荧光微球标记的微囊藻毒素免疫定量试纸条，属于免疫分析快速检测技术领域。本发明通过标记荧光微球制备荧光探针，包括荧光微球‑微囊藻毒素人工抗原和荧光微球‑羊抗兔二抗。将羊抗鼠二抗和兔IgG抗体分别喷涂于硝酸纤维素膜作为检测线和质控线制得免疫层析试纸条；利用竞争免疫法，通过读取荧光免疫分析仪上检测线的荧光值，对样品中微囊藻毒素进行定量分析。该方法不但克服了试纸条技术中胶体金不易保存的缺点，而且制备荧光探针的方法简单高效。

Description

一种基于荧光微球标记的微囊藻毒素免疫定量试纸条

技术领域

本发明涉及一种基于荧光微球标记的微囊藻毒素免疫定量试纸条，属于免疫分析快速检测技术领域。

背景技术

微囊藻毒素(Microcystin，MC)是一类具有生物活性的七肽单环化合物，是具有强烈促癌作用的肝毒素。其主要由淡水藻类铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)产生，具有相当的稳定性。目前为止，已发现80种不同的微囊藻毒素亚型，其中以可变氨基酸为亮氨酸(L)和精氨酸(R)的微囊藻毒素-LR(Microcysitn-LR,MC-LR)的毒性最强，目前已知毒性仅次于二恶英。饮用水中低剂量的该毒素就可以引起人的肝脏损伤，促进肝癌的发生，给人类的健康带来巨大的威胁与隐患。

目前，检测水体中微囊藻毒素的方法主要分为三种：生物测定法、化学分析法、免疫分析法。生物测定法是最早采用的一类毒性分析法，利用动物体内实验、细胞毒性实验等来观测藻毒素毒性，其具有操作简单，可获取器官的病理资料等优点，但存在工作量大、毒素消耗量大、专一性和灵敏度差、无法进行定量分析等缺点。化学分析法是利用光电技术以及样品的理化性质进行分离纯化和定性定量分析的一种方法。其中高效液相色谱法(HPLC)因其测量准确灵敏、重现性好、能同时分析出不同的藻毒素异构体而应用广泛，但存在需要高纯度的标准品、待测样品需要预处理、仪器价格昂贵、需要专业操作等不足之处。

免疫分析法利用毒素诱发免疫反应产生抗体，抗体和抗原进行特异性结合来进行毒素检测。由于其简便快捷、方便携带以及成本低的特性，具有良好的发展趋势。市场上已有胶体金免疫层析试纸条，是以硝酸纤维素膜为固相载体，将胶体金与待测物的抗体/抗原相结合作为标记物，通过毛细管作用使待测样品以及标记物在层析试纸条上移动，经过硝酸纤维素膜时，与提前喷涂的抗原/抗体以及二抗发生免疫反应，最后通过检测线和质控线处颜色的深浅来判断测试结果。该检测技术操作方便、样品无需预处理、特异性好，但其应用的是单份试剂，难以进行质量控制，且灵敏度不高，动态检测范围窄，只能用于定性分析。

我国微囊藻毒素污染范围广，常用检测方法无法满足要求，亟需研究出更加灵敏、方便的可用于现场快速、高通量检测的方法。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明提供了一种基于荧光微球标记的快速检测微囊藻毒素的免疫定量试纸条。本发明采用了荧光微球替代胶体金，制备荧光微球标记的微囊藻毒素人工抗原，将其作为荧光探针用于免疫层析检测微囊藻毒素，结果表明该方法可以快速定量检测微囊藻毒素。

本发明提供的基于荧光微球标记的微囊藻毒素免疫定量试纸条，是在硝酸纤维素膜(NC膜)上分别喷涂羊抗鼠二抗和兔IgG抗体，分别作为检测线(T线)和质控线(C线)，两线之间相距0.4-0.8cm，干燥后，贴上吸水纸和样品垫，以0.3-2cm左右的宽度切条。

在本发明的一种实施方式中，羊抗鼠二抗的浓度为0.5-2mg/mL，喷涂量为1-3μL/cm。

在本发明的一种实施方式中，兔IgG抗体的浓度为0.5-2mg/mL，喷涂量为1-3μL/cm。

在本发明的一种实施方式中，所述吸水纸、硝酸纤维素膜以及样品垫依次相邻，且相邻部位部分重叠区域的长度为1～5mm。

在本发明的一种实施方式中，所述吸水纸与硝酸纤维素膜重叠的部分位于硝酸纤维素膜的上侧。

在本发明的一种实施方式中，还包括包覆所述试纸条的外壳；所述外壳包括底座和卡壳，所述卡壳上有观察口和加样口，以露出试纸条的局部区域；所述加样口开口于所述样品垫上部，以露出部分或全部所述样品垫区域；所述观察口开口于所述硝酸纤维素膜上侧，以露出全部所述检测带和所述质控带。

本发明还提供引用所述试纸条检测微囊藻毒素的方法，所述方法是将Eu-荧光微球标记的微囊藻毒素人工抗原(Eu-MC-LR-BSA)和羊抗兔二抗(Eu-Goat-anti-Rabbit)作为荧光探针，将待测样品、Eu-MC-LR-BSA、微囊藻毒素单抗腹水和Eu-Goat-anti-Rabbit滴加到96孔板中，室温振荡一段时间，取混合物缓慢滴入试纸条的样品垫上，经层析，然后通过免疫定量分析仪记录T值和C值，对样品进行定量检测。

在本发明的一种实施方式中，将30-50μL的待测样品、30-50μLEu-MC-LR-BSA、30-50μL微囊藻毒素单抗腹水和5-20μLEu-Goat-anti-Rabbit滴加到96孔板中，室温振荡8～10分钟，取混合物50～70μL缓慢滴入试纸条样品垫，35～37℃层析5～6min，然后通过HG-98免疫定量分析仪记录T值和C值，用T/T0作为参数，对样品进行定量检测。

在本发明的一种实施方式中，所述单抗腹水以稀释液的形式使用，稀释液含1％BSA、0.9％NaCl、1％NaN₃，浓度为0.05M的pH值为7.8的Tris-HCl溶液。

在本发明的一种实施方式中，所述荧光探针以稀释液的形式使用，是含有1％BSA、1％S9的单抗腹水稀释液。

在本发明的一种实施方式中，所述微囊藻毒素的单抗腹水稀释倍数为30000倍。

在本发明的一种实施方式中，所述两种荧光探针的稀释倍数为100倍。

在本发明的一种实施方式中，所述待测样品的上样体积为30μL。

在本发明的一种实施方式中，所述Eu-MC-LR-BSA上样体积为30μL。

在本发明的一种实施方式中，所述Eu-Goat-anti-Rabbit上样体积为5μL。

在本发明的一种实施方式中，所述微囊藻毒素单抗腹水上样体积为30μL。

在本发明的一种实施方式中，所述室温振荡时间为10min。

在本发明的一种实施方式中，所述试纸条上混合物的加样体积为70μL。

在本发明的一种实施方式中，所述37℃层析时间为5min。

本发明所述的技术方案相比现有技术具有以下优点：

(1)该方法以荧光微球为信号源，荧光微球的体积远大于荧光染料分子的体积，不但可以负载大量的荧光染料分子，而且便于荧光染料分子在检测带和质控带处的聚集，起到信号放大的作用，可实现快速定量检测，且灵敏度高、误差小，为及时检测提供了极大的便利。

(1)该方法以微囊藻毒素单克隆抗体作为识别靶点，检测特异性强。

(2)该试纸条制备方法简单，可实现批量生产。

本发明制备的试纸条是一种能够真正地解决市场需要，精确度高，稳定性强，可重复性高，能够满足工商部门，质检机构，科研高校等检测机构需要的快速检测产品，可供生产经营企业、质控人员、进出口检商、政府管理部门等的使用，适用于食品工业、环境保护和生物化学等领域。

附图说明

图1：Eu-MC-LR-BSA在不同稀释比例条件下得到的阴性对照组T线的荧光强度

图2：微囊藻毒素单克隆抗体腹水在不同稀释比例和不同层析时间条件下得到的阴性对照组与微囊藻毒素含量为1μg/L的样本之间的抑制率。

图3：微囊藻毒素免疫试纸条结构图

图4：标记荧光微球免疫层析法检测微囊藻毒素的标准曲线

具体实施方式

实施例1Eu-荧光微球标记微囊藻毒素人工抗原(或羊抗兔二抗)的荧光探针制备

具体制备方法如下：

(1)取4℃放置的羧基荧光微球(购于厦门挪岛科技，粒径300nm)50μL(1％固含量)，超声分散，加入600-800μL浓度为0.05M的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES，C₆H₁₃NO₄S·H₂O)活化缓冲液，16500rpm离心10-15min(离心时温度控制在15℃左右)；

(2)弃上清，加入600-800μLMES缓冲液，超声重悬，重复离心清洗2-3次；

(3)弃上清，加入200μLMES缓冲液超声重悬，加入50μL10mg/mL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，C₈H₁₇N₃·HCl)、50μL10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，C₄H₅NO₃)室温条件下避光振荡活化30min；

(4)离心，弃上清，加入浓度为0.05M磷酸缓冲液洗2-4次；

(5)弃上清，加400μL磷酸缓冲液超声重悬，加入10μg微囊藻毒素人工抗原(制备方法参考文献：盛建武,何苗,宋保栋,等.微囊藻毒素-LR完全抗原的设计及制备[J].环境科学,2005,26(3):33-37.)(或羊抗兔二抗(购于上海杰一生物技术有限公司))，室温条件下避光振荡2h；

(6)加入10％体积的10倍封闭液，室温条件下避光振荡30min；

(7)封闭后离心弃上清，用浓度为0.05MTris-HCl(含有0.1％Tween-20)缓冲液洗2次；

(8)弃上清，加入400μL冻干液复溶，得到荧光探针Eu-MC-LR-BSA或Eu-Goat-anti-Rabbit，4℃保存备用。

实施例2基于标记荧光微球的微囊藻毒素免疫试纸条的组装

所述微囊藻毒素免疫试纸条结构图如图3所示，底板上从左到右依次为样品垫，硝酸纤维素(NC)膜和吸水纸，试纸条组装的关键是要保证各部分之间具有一致的传递性，其中样品垫叠在NC膜上，二者重叠约5mm，类似地，吸水纸叠在NC膜上，二者重叠约5mm，用切条机将粘贴好的板切成约4mm宽的试纸条，用塑料底座和卡壳组装，4℃密封保存备用。

组装方式如下：在硝酸纤维膜上分别喷涂羊抗鼠二抗(1mg/mL)作为检测线(T线)，在硝酸纤维膜上分别喷涂兔IgG抗体(1mg/mL)作为质控线(C线)，喷涂量均为1μL/cm，两线之间相距约6mm，37℃干燥2-3h，喷涂好的试纸条要及时切开组装，4℃密封保存备用。T线和C线的宽度取决于喷膜仪管路的直径约2mm，T线和C线的长度即单个试纸条的宽度约4mm。T线距离样品垫约5mm，C线距离吸水纸约为5mm。

实施例3基于标记荧光微球的微囊藻毒素免疫试纸条的标准曲线的绘制

标准曲线的绘制方法是：

将Eu-荧光微球标记的微囊藻毒素人工抗原(Eu-MC-LR-BSA)和羊抗兔二抗(Eu-Goat-anti-Rabbit)作为荧光探针，将30μL的微囊藻毒素标准品、30μLEu-MC-LR-BSA、30μL微囊藻毒素单抗腹水和5μLEu-Goat-anti-Rabbit滴加到96孔板中，室温振荡10分钟，取混合物70μL缓慢滴入试纸条样品垫，37℃层析5min。然后通过HG-98免疫定量分析仪记录T值和C值。微囊藻毒素标准品的浓度梯度为：0μg/L、0.1μg/L、0.25μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、5μg/L。以标准品浓度的对数值为横坐标，以F/F0(抑制率)值为纵坐标，绘制曲线。其中，F代表加入不同浓度样品时的T线处的荧光强度，F0代表阴性样品T线处的荧光强度。

随着藻毒素浓度的增大，试纸条T线条带会越来越浅，所以F/F0会越来越小，如图4所示为F/F0随微囊藻毒素浓度的变化曲线，当微囊藻毒素浓度为0.1μg/L～5μg/L时，藻毒素浓度的对数值与F/F0成线性关系，线性方程为Y＝0.5046-0.416LogX，R²＝0.9848，检测限可达到0.056μg/L。

实施例4标记荧光微球快速检测微囊藻毒素过程中的条件优化

(1)Eu-MC-LR-BSA荧光探针的用量对检测结果的影响

为了提高试纸条检测线(T线)的荧光强度和稳定性，本发明研究了实验过程中Eu-MC-LR-BSA荧光探针不同稀释比例下阴性对照组的荧光强度。

该方法的检测原理是竞争免疫法，即样本中的微囊藻毒素与Eu-MC-LR-BSA荧光探针共同竞争微囊藻毒素单克隆抗体腹水，在毛细作用下，样品液向吸水纸一侧泳动，当样品液中不含有微囊藻毒素时，Eu-MC-LR-BSA荧光探针与微囊藻毒素单克隆鼠源抗体(购于北京勤邦生物技术有限公司)形成抗原-抗体复合物，随着层析作用，所述抗原-抗体复合物继续向吸水纸一侧泳动，到达有识别鼠源抗体的羊抗鼠二抗(购于上海杰一生物技术有限公司)条带，即检测线(T线)处，形成抗体-抗原-抗体复合物，在T线形成带有抗体-抗原-抗体复合物的荧光微球的聚集。而无论样品中是否有微囊藻毒素，未结合的Eu-Goat-anti-Rabbit荧光探针继续向吸水纸一侧泳动，到达质控线(C线)时，兔lgG抗体(购于上海杰一生物技术有限公司)与Eu-Goat-anti-Rabbit荧光探针结合，在C线处产线荧光微球的聚集。

图1为Eu-MC-LR-BSA在不同稀释比例条件下得到的阴性对照组T线的荧光强度。实验过程如下：将30μL微囊藻毒素标准品、30μLEu-MC-LR-BSA、30μL微囊藻毒素单抗腹水滴加到96孔板中，室温振荡10分钟，取混合物70μL缓慢滴入试纸条样品垫，37℃层析5min。然后通过HG-98免疫定量分析仪记录T值。其中，微囊藻毒素标准品浓度为0μg/L，微囊藻毒素单抗腹水的稀释比例为1:30000，Eu-MC-LR-BSA的稀释比例分别为1:50、1:100、1:200、1:500、1:1000。从图1中可以看出，随着荧光探针稀释比例增大，相应的荧光强度呈下降趋势。由于该反应是竞争模式，加入标样后所产生的竞争抑制会在阴性对照组的荧光强度的基础上进一步下降，为了保证T线有一定的荧光强度，又节省荧光探针标记物，Eu-MC-LR-BSA荧光探针的稀释比例可为1:100。

(2)微囊藻毒素单克隆抗体的用量以及层析时间对检测结果的影响

为了提高试纸条检测的灵敏度，研究了实验过程中不同单克隆抗体的稀释比例对阴性对照组与样本中微囊藻毒素含量为1μg/L的样本之间的抑制率的影响。

图2为微囊藻毒素单克隆抗体腹水在不同稀释比例和不同层析时间条件下得到的阴性对照组与微囊藻毒素含量为1μg/L的样本之间的抑制率。实验过程如下：30μL微囊藻毒素标准品、30μLEu-MC-LR-BSA、30μL微囊藻毒素单抗腹水滴加到96孔板中，室温振荡10分钟，取混合物70μL缓慢滴入试纸条样品垫，37℃层析一段时间。然后通过HG-98免疫定量分析仪记录T值。其中，微囊藻毒素标准品浓度为0μg/L和1μg/L，Eu-MC-LR-BSA的稀释比例为1:100，微囊藻毒素单抗腹水的稀释比例分别为1:5000、1:10000、1:20000、1:30000、1:40000，37℃层析时间分别为2min、5min、10min、15min、20min。从图2中可以看出，随着抗体浓度的降低，抑制率整体呈先上升后下降的趋势，在抗体稀释比例为1:30000时，整体抑制率率先达到50％；相同抗体浓度条件下，随着层析时间的延长，抑制率呈先上升后下降的趋势，层析时间5min时，抑制率达到最高。为了提高检测灵敏度又减少检测时间，所用微囊藻毒素单克隆抗体的稀释比例为1:30000，37℃层析时间为5min。

实施例5微囊藻毒素免疫试纸条的性能测试

样品测试步骤如下：

(1)重复性实验

随机抽取不同批次的试纸条，分别检测0.5μg/L、1μg/L和2μg/L的样品，每个浓度重复10次，取F/F0的平均值，并计算标准偏差及变异系数。结果如表1示，测定结果CV均小于5％，表明在线性范围内，该试纸条具有较好的重复性。

表1重复性实验

(2)稳定性实验

将组装好的微囊藻毒素荧光免疫层析试纸条分别放置在4℃和37℃密封保存1个月后，测定其T线处的荧光值，结果表明该试纸条在4℃放置一个月后，荧光信号变化不大，而在37℃下放置一个月后，荧光强度变化较大，一方面可能是由于抗体为生物活性分子，会存在失活问题，另一方面，可能是荧光探针自身荧光信号减弱造成的，因此在日后的工作中，有待寻找合适的稳定剂来保护荧光探针，从而增加试纸条的稳定性、使保藏期更长。

(3)加标回收实验

向超纯水中添加不同浓度的微囊藻毒素，采用荧光免疫试纸条进行检测，每个浓度平行测定5次，取平均值，并与ELISA方法相比较，结果如表2所示，试纸条的检测结果整体与ELISA结果都相符，说明该试纸条具有良好的准确性。

表2：加标回收实验

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种基于荧光微球标记的微囊藻毒素免疫定量试纸条，其特征在于，是在硝酸纤维素膜上分别喷涂羊抗鼠二抗和兔IgG抗体，分别作为检测线和质控线，两线之间相距0.4-0.8cm，干燥后，贴上吸水纸和样品垫，以0.3-2cm左右的宽度切条。

2.根据权利要求1所述的一种基于荧光微球标记的微囊藻毒素免疫定量试纸条，其特征在于，羊抗鼠二抗的浓度为0.5-2mg/mL，喷涂量为1-3μL/cm。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于荧光微球标记的微囊藻毒素免疫定量试纸条，其特征在于，兔IgG抗体的浓度为0.5-2mg/mL，喷涂量为1-3μL/cm。

4.根据权利要求1所述的一种基于荧光微球标记的微囊藻毒素免疫定量试纸条，其特征在于，所述吸水纸、硝酸纤维素膜以及样品垫依次相邻，且相邻部位部分重叠区域的长度为1～5mm；所述吸水纸与硝酸纤维素膜重叠的部分位于硝酸纤维素膜的上侧。

5.根据权利要求1～4任一所述的一种基于荧光微球标记的微囊藻毒素免疫定量试纸条，其特征在于，还包括包覆所述试纸条的外壳；所述外壳包括底座和卡壳，所述卡壳上有观察口和加样口，以露出试纸条的局部区域；所述加样口开口于所述样品垫上部，以露出部分或全部所述样品垫区域；所述观察口开口于所述硝酸纤维素膜上侧，以露出全部所述检测带和所述质控带。

6.权利要求1～4任一所述的一种基于荧光微球标记的微囊藻毒素免疫定量试纸条在微囊藻毒素检测方面的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述方法是将Eu-荧光微球标记的微囊藻毒素人工抗原(Eu-MC-LR-BSA)和羊抗兔二抗(Eu-Goat-anti-Rabbit)作为荧光探针，将待测样品、Eu-MC-LR-BSA、微囊藻毒素单抗腹水和Eu-Goat-anti-Rabbit滴加到96孔板中，室温振荡一段时间，取混合物缓慢滴入试纸条的样品垫上，混合物会在毛细管作用下向吸水纸方向移动，当移动至T线时，荧光探针与抗体形成的抗原-抗体复合物会与包被在NC膜上的羊抗鼠二抗发生特异性反应而被捕获，多余的荧光探针继续向前移动，最终被包被在C线的兔IgG抗体捕获；若样品中不含微囊藻毒素，则大量的荧光探针-抗体复合物会被T线上的羊抗鼠二抗捕获，所以紫外光照射下，T线会出现明显的条带，反之，如果样品中含有微囊藻毒素，则样品会与荧光探针竞争结合游离抗体，样品中微囊藻毒素含量越高，则结合到T线的荧光探针-抗体复合物越少，条带越浅，直至消失。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将30-50μL的待测样品、30-50μL Eu-MC-LR-BSA、30-50μL微囊藻毒素单抗腹水和5-20μL Eu-Goat-anti-Rabbit滴加到96孔板中，室温振荡8～10分钟，取混合物50～70μL缓慢滴入试纸条样品垫，35～37℃层析5～6min，然后通过HG-98免疫定量分析仪记录T值和C值，用T/T0作为参数，对样品进行定量检测。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述单抗腹水、荧光探针以稀释液的形式使用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，微囊藻毒素的单抗腹水稀释倍数为30000倍；两种荧光探针的稀释倍数为100倍。